1. Fundamentos de técnicas
blotting: Southern,
Northern, Western.
Bioquímica I
DULCE CAROLINA ROJAS HERRERA
2013
FACULTAD CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

2. Universidad Autónoma de Sinaloa
Química Farmacéutica Bióloga
Nombre de la alumna:
Rojas Herrera Dulce Carolina
Nombre del maestro:
Dr. Eduardo Armienta Aldana
Materia:
Bioquímica I
Grupo:
204
Culiacán Rosales , Sinaloa 26 de Octubre de 2013

3. En las últimas décadas la tecnología de
recombinación del ADN también
conocida como ingeniería genética, o
más acertadamente recombinación
genética in vitro, ha revolucionado la
biología.
El campo de la salud es uno de los
más beneficiados con el desarrollo de
esta tecnología. Las investigaciones
que se realizan en esta área están
enfocadas a un diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible
tratamiento a través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de
genes. Además, la manipulación de genes proporciona una herramienta
fundamental para la eliminación futura de enfermedades mortales para el hombre.
Por estas razones resulta útil que el médico de asistencia esté familiarizado con
conceptos básicos sobre biología molecular, su aplicación en la investigación
biomédica, y en especial con sus posibles aplicaciones clínicas, conceptos estos
que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la literatura biomédica,
tanto básica como clínica.
Entre los fenómenos que se estudian son la hibridación que es la construcción
artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la
complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de un proceso de unión de
dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una
molécula de ácido nucleico de doble cadena. Es un método muy versátil que
permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos.
En otras palabras una purina siempre está encarada a una pirimidina. Las dos
cadenas de polinucleótidos de la doble hélice están conectadas mediante uniones
hidrógeno entre bases. En condiciones normales,
una G se une específicamente con una C, mientras
que una A solamente se puede unir con una T. El
par de bases GC tiene tres uniones hidrógeno,
mientras que el par AT tiene solamente dos. Como
consecuencia, se necesita más energía para
romper el par GC que el par AT. El hecho de que
una cadena de ADN sea complementaria a la otra
permite una reproducción exacta del material
genético; así, cada cadena puede servir como
molde (“template”) para la síntesis de otra.
Cualquier
hibridación
en
la
que
la
complementariedad sea inferior al 70% se
considerará como no-homóloga y, por tanto, ocurre en condiciones de baja
astringencia (temperatura baja y/o concentración alta de sales).
Esta técnica también permite la detección de fragmentos de DNA que son
complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas).

4. Una sonda es un fragmento de tamaño variable (de pocos nucleótidos como 50
pb hasta 2 kb) que puede ser ADN o ARN, que se une específicamente por
complementariedad de bases a la 5 secuencia que se encuentra en la membrana
de nylon junto con cientos de fragmentos más. Este sucede lo que
mencionábamos anteriormente el evento de unión por bases complementarias que
se conoce como hibridación. Se dice que la sonda “hibrida” con el fragmento
específico. Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna
“marca” para que pueda detectarse la unión y por ende, identificar la secuencia de
interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para
marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen
nucleótidos comerciales marcados con fósforo radioactivo que al incorporarse en
una sonda por diferentes técnicas le permite ser detectada mediante la exposición
de la membrana a una placa autorradiográfica (como la de los rayos X).
Existen varias técnicas basadas en la hibridación entre ellas PCR, CGH ISH:
FISH, CISH, SISH y las de nuestro estudio que son las técnicas de transferencia
o “blotting”: Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y
caracterizar ADN y ARN respectivamente. La técnica de Southern fue desarrollada
por Edwin Southern para separar ADN y por analogía la separación de ARN se
denominó Northern y la transferencia de proteínas que se denominó Western
blot.
El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se
usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio,
permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos
visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que
expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo
material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes.
Estas técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de
separar las moléculas por su tamaño, posteriormente la transferencia a una
membrana para finalmente identificar un fragmento específico de ADN, una
molécula de ARN particular o una proteína de interés mediante la unión específica
de otra molécula de ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para
proteínas.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la
autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un
gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:


Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan
anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda
que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas
de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una
secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen
secuencias complementarias a la de la sonda

5. 
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de
RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia
conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias
complementarias a la de la sonda
ELECTROFORESIS
Se separan las proteínas o los
ácidos nucleicos en un gel de
electroforesis

Con proteínas se utiliza
un gel de poliacrilamida
 Con ácidos nucleicos se
utiliza un gel de agarosa
TRANSFERENCIA
(BLOTTING)
Se transfieren las bandas de
proteínas o de ácidos nucleicos
desde el gel hacia una
membrana de nitrocelulosa
(flechas azules) para que
puedan reaccionar con la sonda
radioactiva.
AUTORRADIOGRAFÍA
Se
añaden Anticuerpos
radiactivos
contra
una
proteína o sondas radioactivas
de ácidos nucleicos (con
secuencia conocida). Se espera
a que reaccionen (A). Se coloca
la membrana de nitrocelulosa
sobre una placa fotográfica y se
revela (B).

6. Western blot.
El Western blot, o
analítica
usada
específicas en una
mezcla compleja de
tisular).
inmunoblot, es una técnica
para
detectar
proteínas
muestra determinada (una
proteínas, como un extracto
Se utiliza para determinar la presencia y cantidad
de antígenos y de anticuerpos específicos.
En la actualidad el Western blot es el estudio
confirmatorio más empleado para el diagnóstico del SIDA. Se emplean antígenos
virales obtenidos por cultivo celular.
Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente
peso molecular.
Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se
incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan añadiendo una antiIgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda
coloreada al añadir un sustrato. Esta técnica identifica anticuerpos específicos
frente a las distintas proteínas del VIH. Las proteínas son separadas en primer
lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se
transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico y un tampón de
transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello,
se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo
al positivo o ánodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de
transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra esponja.
Este montaje, llamado coloquialmente sándwich, se dispone en el sistema de
transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los
materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se desplazan
hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. Tras la transferencia,
se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de

7. proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material
proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada
gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se
transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas). Los resultados
que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen
múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y
un resultado indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero
que no son suficientes para ser considerado como positivo.
Southern blot.
Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una
secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello,
emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los
fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una
membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del
apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Los pasos para Southern blot:
1. Extracción del ADN: Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido
humano.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. El ADN extraído
de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una
enzima que corta el ADN bicatenarios en donde tenga una secuencia
característica.
3. Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los fragmentos
de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis

8. en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz
del gel de agarosa
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot"): Tras la
electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras
permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución
alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una
copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este
sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se
conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward
Southern.
5. Hibridación con sonda radioactiva: Una sonda de locus único es una
molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación
de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en
el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un
isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten
un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano.

9. 6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de
hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de
Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, La
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de
rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el
revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se
conoce como autorradiografía.
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: En un análisis
legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios
cromosomas diferentes. Tras el revelado de
una autorradiografía para la primera sonda, se
puede lavar la radiactividad con una disolución
a elevada temperatura, que deja el ADN en su
sitio, e hibridarlo con una segunda sonda
radiactiva que se una a un locus diferente. Se
repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez
un
locus
diferente.
El
grupo
de
autorradiografías de una misma transferencia
de Southern se conoce como un "perfil de
ADN"
Northern blot
Es similar a la técnica
anterior,
pero
permite
detectar RNA en vez de DNA
(Innis y Gelfand, 1990). En
síntesis la técnica consiste
en extraer el RNA de las
células pertinentes y su
posterior separación
por
tamaño
mediante
electroforesis en gel.
Las muestras de RNA son
normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído
como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura
secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y
visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de
poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele
limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro
mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría
desplazarse por el gel.

10. Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el
Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y
posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas
en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean
complementarios a la sonda.
Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el
tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer
el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional.
Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un
mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de
células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible
determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el
desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período
definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a
diferentes estímulos fisiológicos.

11. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
 http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf
 http://prezi.com/5oqtln5q1xkx/fundamento-y-utilidad-de-tecnicas-empleadas-para-el-diagnosticoen-la-inmunologia/
 http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/molecular.pdf




http://www.jove.com/science-education/5065/el-western-blot?language=Spanish
http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp6.pdf