Cultivos Iniciadores en Quesería: Tradición y Modernidad. Beatriz Martínez (IPLA-CSIC). En las II Jornadas Teécnicas "Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos". Cáceres, noviembre 2013

1. Cultivos Iniciadores en Quesería:
Tradición y Modernidad
T di ió M d id d
Ana Rodríguez González y Beatriz Martínez Fernández
Grupo DairySafe, IPLA‐CSIC
II Jornadas Técnicas
Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos
Cáceres, 14 de Noviembre de 2013

2. INSTITUTO DE PRODUCTOS
LÁCTEOS DE ASTURIAS
CSIC
Tecnología y Biotecnología de P.L.
Microbiología molecular
Fermentos lácticos y bioconservación
Físico-química
Microbiología y Bioquímica de P.L.
Probióticos, prebióticos y exopolisacáridos
Cultivos lácteos funcionales
WWW. IPLA.CSIC.ES
Quesos
de
España

3. FERMENTOS LÁCTICOS Y BIOCONSERVACIÓN
(DairySafe)
CALIDAD Y SEGURIDAD DE
PRODUCTOS LÁCTEOS
Líneas de Investigación
Diseño de cultivos iniciadores
Bacteriocinas
Bacteriófagos y endolisinas

4. Introducción
• Reseña histórica
• Cultivos iniciadores
–
–
–
–
Composición
p
Tipos
Funciones
Propagación
• Fermentos autóctonos
– Afuega´l Pitu
• Perspectivas
– Seguridad
– Calidad

5. Introducción
Friso de la Lechería
(bajorrelieve sumerio del III milenio a.C.)
Descubrimiento accidental hace unos 8.000 años en
el Fertile Crescent
(Valle del Trigris y Eúfrates (antigua Mesopotamia)
Microbiota contaminante
Leche
acidificación
Almacenada en bolsas fabricadas
con estómagos de animales
Cuajada ácida
queso fresco
Coagulación
enzimática
á
queso

6. Introducción
(Ácidos grasos y C 14)
C-14)
Neolítico
Hace 7000 años en Europa

7. Introducción
Uso de una pequeña porción de leche
Back-slopping coagulada como inóculo
S. XIX: identificación de las
bacterias lácticas de la leche
1890
Storch (Dinamarca)
Conn (EEUU)
Weigmann (Alemania)
Fermentos
Cultivos iniciadores
Starters
nata
Streptococcus lactis
p
St. cremoris
bacterias acidificantes
Mantequilla de
mejor calidad

8. Cultivos iniciadores
Una o más cepas de una o más especies bacterianas que se utilizan
para i
inocular un producto crudo o pasterizado con el fin de iniciar
l
d t
d
t i d
l fi d i i i
su fermentación
Ingredientes alimenticios
Actividad
metabólica
Sabor
Aroma
Textura
Nutrientes
Salud
Vida útil
Seguridad

9. Cultivos iniciadores
BACTERIAS LÁCTICAS
Microorganismos Gram +
Inmóviles no esporulados
Inmóviles,
Anaerobios aerotolerantes
g
En general carecen de catalasa
Phylum Firmicutes (G+C < 50%)
Streptococcus
Lactococcus
Oenococcus
Enterococcus
Lactobacillus
Leuconostoc
Pediococcus
GRAS: generally regarded as
safe (FDA, 2001)
QPS: Qualified
Presumption of Safe
(EFSA,
(EFSA 2007)

10. Cultivos iniciadores
Las bacterias lácticas utilizan rutas homo y heterofermentativas
para transformar los carbohidratos en ácido láctico
Lactosa:
azúcar mayoritario de la leche (4-5% g/100 mL)
Galactosa
Vía Homofermentativa
Vía Heterofermentativa
Lactococcus
Streptococcus
Enterococcus
Leuconostoc
Lactobacillus (Grupo III)
Pediococcus
Lactobacillus (Grupo I y II)
LACTICO
>85%
85%
Fórmico
Acético
Etanol
β
(1,4)
pH
Láctico
Acético
Etanol
CO2
Glucosa

11. Cultivos iniciadores
PROTEOLISIS
Caseína
Caseína
Oligopéptidos
Aminoácidos
Transaminación
Deshidrogenación
g
Decarboxilación
Reducción
(www.rug.nl)
α-ceto-acidos
Aldehídos
Alcoholes
ésteres

12. Cultivos iniciadores
FUNCIONES
Metabolismo del citrato:
diacetilo, acetaldehido
Aumenta actividad del
cuajo,
sinéresis del coágulo y
desuerado
(c. enzimática)
Producción de aromas
Producción de
acido láctico
Precipitación de las
caseínas
(
(coagulación ácida)
g
)
MADURACIÓN
(Ojos)
Producción de gas
P d
ió d
Actividad
proteolítica
Producción de
P d
ió d
sustancias
antimicrobianas
CONSERVACIÓN
Ó
pH
Bacteriocinas…
Producción de
exopolisacáridos
TEXTURA
Y
AROMA

13. Cultivos iniciadores
TIPOS
Según la función
Primarios: producción de ácido láctico a partir de la lactosa
Secundarios: desarrollo y control del sabor, aroma y textura
Según la tª óptima de crecimiento
Mesófilos: Tª óptima 30ºC
p
Termófilos: Tª óptima 42ºC
Según la composición
g
p
Indefinidos
Definidos
Cultivos naturales de leche
Cultivos naturales de suero
Cepa única
Múltiples
Mixtos

14. Cultivos iniciadores
Primarios mesófilos definidos
Lactococcus lastis ssp. lactis
L. lactis ssp. cremoris
L(+) lactato
L(+) lactato
L. Lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis
L(+) lactato y diacetilo
Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris D(+) lactato, diacetilo,
euco ostoc ese te o des ssp c e o s ( ) actato, d acet o,
etanol y CO2
Quesos: Gouda, Cheddar, Cottage, Camembert, Feta
Leches fermentadas nórdicas:
Langfil (Suecia, Noruega)
Viilli (Finlandia)

15. Cultivos iniciadores
Primarios termófilos
Streptococcus thermophilus
L(+) lactato, acetaldehido
Lactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus D(+) lactato, acetaldehido
DL-lactato
Lb. acidophilus, Lb. helveticus
Quesos de pasta cocida: Gruyere, Emmental, Grana, Mozarella
Sinergismo
Yogur
Caseína
Aminoácidos
Lactobacillus péptidos
L t b ill
é tid
Ácido fórmico
Streptococcus

16. Cultivos iniciadores
Cultivos naturales o artesanales
Mezcla no definida de especies y cepas distintas
Producción diaria (temperatura y pH controlado)
Selección de cepas
mejor adaptadas
Suero a 45ºC hasta pH 3,3 (fermentos naturales de suero)
Quesos de pasta dura: Parmiggiano Reggiano y Grana Padano
Quesos de pasta hilada: Mozzarella
Lb.
Lb helveticus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. fermentum
St. thermophilus
p
Leche a 65ºC, 10-15 min, y enfriar a 37-45ºC (fermentos naturales de leche)
Quesos italianos t di i
Q
it li
tradicionales
l
St. thermophilus
Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus
Lb. casei
Lb.
Lb helveticus
Enterococcus faecalis
Ent. faecium

17. Cultivos iniciadores
Propagación
Condiciones asépticas
GMP
Medios y condiciones
“personalizados”
personalizados
Concentración:
Centrifugación
Ultrafiltración
DVS
(Cárcoba, Tesis Doctoral)

18. Fermentos autóctonos
Uso de fermentos comerciales
Inconvenientes
Ventajas
Control de la fermentación
Estandarización del producto
Cierta “pérdida “ d características
Ci
“ é did de
í i
organolépticas singulares
Fermentos autóctonos
Quesos con identidad propia
(sabor y aroma diferenciales)
- Respetan la microbiota autóctona y sus
proporciones relativas
- Adaptadas al crecimiento rápido en el tipo de
leche tili d
l h utilizado
- Equilibrio con los fagos endémicos de la zona

19. Fermentos autóctonos
Mezcla de cepas lácticas seleccionadas en función
de sus características fisiológicas, metabólicas y
tecnológicas,
tecnológicas
aisladas de la microbiota del queso de leche cruda
Estudio microbiota
queso leche cruda
Aislamiento
Y
caracterización
Selección
Producción
INDUSTRIAL
INDUSTRIA

20. Fermentos autóctonos
Afuega´l Pitu
DOP
Los Beyos
IGP
Casín
C í
DOP
Gamoneu
DOP
Cabrales
DOP

21. Fermentos autóctonos
Queso AFUEGA’L PITU
Leche de vaca
Coagulación ácida (pH 4,4±0,28)
Consumo fresco 2-3 días; madurado 2-3 semanas)
100
80
% BAL
B
60
40
20
C
ua
60
30
15
7
3
ja
da
0
días maduración
queso
(Cuesta et al., 1996)
Lactobacillus
Leuconostoc
Lactococcus

22. Fermentos autóctonos
Lactococos
7,5
%
33,3%
59,2%
59 2%
180 cepas
L.
L lactis subsp lactis
subsp.
L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis
L. garviae
3,9%
11,7%
11,9%
Leuconostoc
58,8%
13,7%
Leuconostoc citreum
Ln.
Ln mesenteroides
Ln. paramesenteroides
Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides
Ln. mesenteroides
40 cepas

23. Fermentos autóctonos
180
Lactococcus
Capacidad acidificante : >0.65-0.98%
Actividad proteolítica
Producción de compuestos aromáticos
Resistentes a bacteriófagos
Ausencia lisogenia
Compatibilidad
No producción de aminas biógenas
32 cepas
Consumo de citrato
100,00
98,00
96,00
94,00
92,00
90,00
88,00
86,00
(J.I. Sánchez, Tesis doctoral)
40
Leuconostoc
Producción de compuestos aromáticos
Producción de dextrano
Resistencia a la acidez
Resistencia al NaCl
No producción de aminas biógenas
11 cepas

24. Fermentos autóctonos
Leuconostoc citreum
(8 cepas)
25%
19%
L.
L lactis subsp lactis
subsp.
biovar. diacetylactis
(6 cepas)
Análisis comparativo
A
Microbiota
Parámetros
físico-químicos
56 %
Lactococcus lactis
subsp. lactis
(8 cepas)
Análisis
sensorial
MEZCLAS
A
B
C
D
E
F
7
2
3
5
2
2
6
2
3
4
2
3
4
2
2
4
3
2
Mezcla
M l D
Fermento IPLA 001
IPLA-001
IPLA 947 - IPLA 838 – IPLA 616

25. Fermentos autóctonos
Medio de cultivo de bajo coste
Cultivo individual de cepas en biorreactor
(pH, pO2, fuente de carbono)
Cultivo
C lti continuo
ti
(individual, mixto)
Concentración de biomasa
(filtración tangencial)
Liofilización
(ensayo de crioprotectores)

26. Fermentos autóctonos
bi
io
bio g es
bi ges
o
o
starters
starters
IPLA001 500
Fermento láctico congelado ,con centrado
Ingredientes: Cultivo microbian o
( Lactococcus y Leuconostoc), leche en polvo.
Lote: IPLA001 120710
IPLA 001
Cantidad neta: 105 ml
para 500 L de leche
Co nservar co ng elado (-20ºC)
Modo de em pleo : D iluir co n leche
atemperada y añ adir a l a cub a de cu ajad o.
Usar preferentemente
antes del fin de : 01/2011
Fermento autóctono para queso Afuega`l
Pitu, elaborado por Bioges con cepas
aisladas por el IPLA-CSIC
Fabricado po r:
Bio-Ges Starters, S.A.
Avd a. Portugal, 41
24071 Leó n (ESPAÑA)
Contiene lactosa. Antes de usar ver ficha
tècnica.
Tfn o.: 987 291813 Fax: 987 291947
o:
CIF: A-24469249
RGSA: 31.02073/LE

27. Fermentos autóctonos

28. Perspectivas
p
Nutritivo
y
energético
é
Nutritivo
N ii
y
energético
CALIDAD
Sano, seguro
S
y
apetecible
SEGURIDAD
Nutritivo
y
energético
Sano, seguro
Sano seguro
y
apetecible
Beneficioso
para
la salud
Nutritivo
y
y
energético
Sano, seguro
y
y
apetecible
Beneficioso
para
para
la salud
Respetuoso
con el medio
con el medio
ambiente
Biodiversidad
Biodiversidad
cultural

29. Perspectivas
p
CULTIVOS
PROTECTORES
INICIADORES/ADJUNTOS
PROBIÓTICOS
OBJETIVOS
↑ Vida útil
↑ Salubridad
Cambios
C bi organolépticos
lé i
↑ Valor a ñadido
↑ Funcionalidad

30. Perspectivas: Seguridad
p
g
BACTERIOCINAS
Péptidos antimicrobianos
Tecnológicamente aptas
T
ló i
t
t
Amplio espectro de inhibición
Historia de consumo seguro: BAL
Leu
Ala
Gly
Dha
Ile
Leu
Ile Dhb Ala
Ala Lys
Pro Gly
Nisina: E-234
Gly
Abu
S
Ala Abu
S
Met
Ala
S
S
His
Ala
Asn Met Lys Abu
Ala Ser
Abu
Ala
S
Ile
His
Val Dha Lys

31. Perspectivas: seguridad
p
g
– Diseño de cultivos iniciadores protectores (nisina Z)
activos en quesos de coagulación ácida y de pasta
lavada.
Fermento IPLAIPLA001
(Cárcoba, 2000)
Fermento IPLA-001-nisZ
IPLA-001(A)
Fermento IPLA-001-nisZ
IPLA-001(B)
Fermento IPLA-001-nisZ
IPLA-001(C)
28%28%- IPLA 729
28% - IPLA 947
19% - IPLA 838-1
83825% - IPLA 616
18% - IPLA 729
38% - IPLA 947
19% - IPLA 838-1
83825% - IPLA 616
56% - IPLA 729
19% - IPLA 838-1
83825% - IPLA 616
56% - IPLA 947
19% - IPLA 838
25% - IPLA 616
IPLA-001-nis+ (C)
IPLA-001-nis+ (B)
Evolución del fermento
Afuega l
Afuega´l pitu
2400
10
2000
8
1600
6
1200
4
800
2
400
0
0
3
6
9 12 15
0
3
6
9 12 15
0
3
6
Tiempo (días)
9 12 15
0
3
6
9 12 15
0
UA/g
Log uf
fc/g
IPLA-001-nis+ (A)
IPLA-001
12
Leuconostoc citreum IPLA 616
Lactococcus lactis IPLA 947
L. lactis IPLA 729
L. lactis biovar. diacetylactis IPLA 838
UA/g

32. Perspectivas: seguridad
p
g
Rilla et al., 2003

33. Perspectivas: seguridad
p
g
Fermento IPLA-001-nisZ+
0,25
20
0,2
0,15
10
0,1
10
0,6
0,4
5
0,05
0
0
0,5
7
0,6
06
0,3
0,4
0,2
0,2
0
0
0,1
5
10 15 20 25 30
0
5
10 15 20 25 30
Tiempo de maduración (días)
0
0
0,8
6
5
0,6
4
0,4
3
2
0,2
1
0
1
8
15
30
1
8
Tiempo de maduración (días)
15
30
0
3-M
Metilbutanal*
0,4
0,2
Acetoin
na*
0,8
Ácido but
tírico (mg/g)
5
0
Ácido acétic (mg/g)
co
1
0,8
Diacetilo*
15
1,2
15
Etanol*
Fermento IPLA-001;
Ácido pirúvico (mg/
/g)
Á
Ácido láctico (mg/g)
Fermento comercial;

34. Perspectivas: calidad
p
Producción de
cultivos iniciadores
Congelación
Liofilización
Materia prima
Bacteriófagos
Compuestos
antimicrobianos
Fermentación en la industria láctea
Acidez
Temperaturas extremas
Salinidad
Bacteriófagos
Compuestos antimicrobianos
Producto lácteo
fermentado
Calidad higiénica
Sabor
Aroma
Textura
RESPUESTA AL ESTRÉS

35. Perspectivas: calidad
p
Presión selectiva
GM17
Resistencia a bacteriófagos
Cepas más robustas

36. Perspectivas: calidad
p
RIBOTIPADO
RAPD
RFLP PFGE
RFLP-PFGE

37. Perspectivas: calidad
p
Tecnologías de alto rendimiento
Genómica
Proteómica
Metabolómica
Fenómica…

38. Muchas gracias
g