1. Hepatocita-szerű sejtek karakterizálása a
humán embrionális őssejtek máj irányú differenciáltatása során
Doktori értekezés tézisei
Erdélyi-Belle Boglárka
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar
Biológia Doktori Iskola
Molekuláris sejt- és neurobiológia program
Témavezetők: Prof. Schaff Zsuzsa, (SOTE)
Dr. Homolya László, (RCNS, HAS)
A Biológia Doktori Iskola vezetője: Prof. Erdei Anna
A Molekuláris sejt- és neurobiológia program vezetője: Prof. Sass Miklós
Enzimológiai Intézet, Természettudományi Kutatóközpont,
Magyar Tudományos Akadémia
II.sz. Patológiai Intézet, Semmelweis Egyetem
Budapest, Hungary
2014

2. 1
Bevezetés
Az irreverzibilis máj rendellenességben szenvedők számára manapság a máj
transzplantáció az egyetlen szóba jöhető megoldás, azonban a szervdonorok hiánya miatt más
alternatív lehetőségeket is számba kell venni, mint például a sejt alapú terápiát, melynek során
a különböző típusú őssejtek (mint például, humán embrionális őssejtek, indukált pluripotens
őssejtek, csontvelő eredetű őssejtek) segítségével igyekeznek regenerálni a sérült máj
szövetet.
Kísérleteink során két humán embrionális őssejt vonalat tanulmányoztunk a HUES1-et
és a HUES9-et, melyeket úgy, ahogy a többi embrionális őssejt vonalat, a humán
blasztociszták belső sejtjeiből állítottak elő. Különböző növekedési faktorok és morfogének
hatására ezek a pluripotens embrionális őssejtek mindhárom csíralemez kialakítására képesek.
A differenciáció folyamatát jól lehet jellemezni különböző differenciációs stádiumokra
specifikus markerekkel.
A máj szöveti parenchimájának fő alkotó elemei a hepatociták és a kolangiociták
eltérő funkciót töltenek be a máj működésében valamint különböznek egymástól ABC
transzporter és a tight junction (TJ) komponens expressziós mintázatukban is. A TJ
komponenseknek fontos szerepük van az érett hepatociták polarizációjának kialakításában. A
hepatocitákban a polarizáció során kialakult bazolaterális (szinuszoidális), és apikális
(kanalikuláris) membránoknak különböző a ABC transzporter készletük, amik
elengedhetetlenek a máj funkciójának betöltéséhez (anyagcsere folyamatok, glikogén
raktározás, epekiválasztás, koleszterol szintézis, detoxifikáció, stb.).
Mindezidáig még nem vizsgálták a humán embrionális őssejtek májirányú
differenciáltatása során számos ABC transzporter, bicelluláris TJ komponens; mint például a
claudinok, és a legújabban azonosított, három sejt között kapcsolatot tartó tricellulin valamint
az extracelluláris mátrix protein, agrin génexpressziójának változását.
A TJ komponensek expressziójának megváltozása és a malignus transzformáció között
szoros kapcsolatot feltételeznek, ezért céljaink között szerepelt még különböző szöveti
eredetű (máj és hasnyálmirigy) rákos megbetegedések TJ komponens készletének vizsgálata.

3. 2
Célkitűzések
A munkánk elsődleges célkitűzése a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciáltatása
volt, amihez előszöris
 ki kellett választani a hepatocita irányú differenciációra leginkább alkalmas humán
embrionális őssejtvonalat,
 ki kellett választani a leghatékonyabban és a legkönnyebben reprodukálható
differenciációs protokolt,
 ezt követően célunk volt, a jól karakterizált differenciációs állapotokra jellemző
markerek expressziós szintváltozásának vizsgálatával nyomon követni a differenciáció
folyamatát, valamint
 funkcionális esszékkel karakterizálni a differenciáció során kapott hepatocita-szerű
sejteket és egyben a differenciációs folyamat hatékonyságát.
Munkánk során célul tűztük ki, a humán embrionális őssejtek máj irányú differenciációs
folyamatának jól karakterizált állapotaiban elsőként
 feltérképezni az expressziós szintváltozását a hepatociták bazolaterális (szinuszodális)
membránján kifejeződő ABCA1, ABCC1 (MRP1), ABCC3 (MRP3), ABCC6 (MRP6),
és a hepatociták apikális (kanalikuláris) membránján kifejeződő ABCB1(MDR1),
ABCB4 (MDR3), ABCB11 (BSEP), ABCC2 (MRP2), ABCC4 (MRP4), ABCG2
(BCRP), ABCG5/G8 valamint a kolangiocita specifikus ABCC7 és végül a máj
makrofágokban is kifejeződő ABCG1 géneknek, valamint
 feltérképezni számos TJ komponens, mint például a claudin-1, -4, -5, -7, tricellulin,
valamint az agrin, extracelluláris matrix protein gének expressziós szintváltozását.
A legtöbb rákos szövetburjánzás a szervezetben előforduló „rákos őssejtekből” eredeztethető,
amik az őssejtekhez nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek; ilyen például az
önmegújítóképesség, és a pluripotencia, ezért céljaink közt szerepelt továbbá
 összehasonlítani a különböző szöveti eredetű rákos megbetegedéseket a hozzájuk
tartozó ép szövetekkel a TJ komponens és ABC transzporter génjeik expressziós és
protein lokalizációs mintázatuk alapján, ezt követően pedig,
 páruzamot vonni a tumorok kialakulása és súlyossága valamint, a differenciáció során
tapasztalt eredményeink között.

4. 3
Vizsgálati módszerek
A laboratóriumunkban rendelkezésre álló őssejtvonalak, HUES1 és HUES9 irányított
differenciációját két féle, az irodalomban leírt eljárással végeztük. A hepatikus differenciáció
végén, a kapott hepatocita-szerű sejt populációt morfológiai vizsgálatokkal, és különböző
funkcionális módszerekkel jellemeztük, mint például; glikogén tárolás, organikus anion
felvétel/leadás, albumin és urea szekréció mérésével valamint CDF-DA hidrolízis vizsgálattal.
A differenciációs folyamatát különböző, jól karakterizált fázisaiban a különböző őssejt és
hepatocita markerek mRNS expressziós mintázatának változását is nyomon követtük
Az ABC transzporter és TJ komponens gének expresszióját mRNS-szinten kvantitatív
valós idejű (RT) PCR-el határozzuk meg a fent említett differenciációs stádiumokban.
Ezt követően néhány májrákos megbetegedést hasonlítottunk össze a hozzájuk tartozó
ép szöveti mintákkal; a sejtkapcsoló készletük gén expresszós mintázata alapján kvantitatív
RT-PCR-el, valamint a sejtkapcsoló fehérjéik lokalizációja alapján immunhisztokémiával.
Majd igyekeztünk párhuzamot vonni a különböző súlyosságú rákos megbetegedések és a
rákos szövetek TJ gén expressziója között kvantitatív RT-PCR-el.
Eredmények
A kiválasztott differenciációs protokoll relatív egyszerű és jól definiált differenciációs
stádiumokra volt bontható. A HUES9 sejteket három napig differenciálatlan állapotban
tartottuk, amik öt napig tartó Activin A kezelés hatására endoderma-szerű sejtekké alakultak.
További hét napig tartó hepatocita növekedési faktorral (HGF) való kezelés hatására pedig
hepatocita-szerű sejtekké differenciálódtak.
A HUES9 sejtek máj irányú differenciáltatásának hatékonyságát különböző
módszerekkel vizsgáltuk (morfológia vizsgálatával, funkcionális esszékel, őssejtmarkerek és
májmarkerek expressziójának vizsgálatával RT-PCR-el), amik segítségével igazoltuk, hogy
sikerült a humán embrionális őssejtekből májszerű sejteket differenciáltatnunk. A
differenciáltatási folyamat különböző időpontjaiban nyomon követtük a sejtek
morfológiájában végbemenő változásokat. A folyamat végére a hepatocita-szerű sejtek
sokszögletűek lettek és a citoplazmájukban sok glikogén tartlamú granulum volt látható,
hasonlóan a sejtkultúrában tenyésztett normál humán hepatocitákhoz. A humán embrionális
őssejt eredetű hepatocita-szerű sejtek hepatocitákra jellemző funkcionális aktivitást mutattak.

5. 4
A PAS (periodic acid-schiff) esszét rutinszerűen alkalmazzák a májsejtekre jellemző
citoplazmatikus glikogén felhalmozódás kimutatására. A differenciációs folyamat végén a
hepatocita-szerű sejtek PAS pozitívak voltak. A működőképes májsejtek kimutatására
alkalmas módszer az ICG (indocyanin green) organikus anion felvételének és leadásának
vizsgálata. A humán embrionális őssejtekből differenciáltatott májszerű sejtek felvették az
ICG-t, azonban a differenciálatlan őssejtek nem voltak erre képesek. A máj funciót mutató
sejtek a felvett ICG-t hat óra múlva eliminálták. A sejtek máj karakterét támasztja alá, hogy a
differenciációs folyamat végére a sejtek urea szekréciója szignifikánssan megnőtt. Azonban a
differenciáltatott sejtek albumin szekréciója az endoderma állapot végén volt a legmagasabb,
ami a hepatocita állapot végére kissé lecsökkent, összességében elmondható, hogy a
differenciáció során nőtt az albumin szekréció. A CDF-DA hidrolízis vizsgálattal a
polarizálódó hepatocitákban az epe kanalikulusok kialakulását és tipikusan azok membránján
expresszálódó ABCC2 (MRP2) jelenlétét vizsgáltuk, melynek során azt láttuk, hogy a zöld
CDF festék a hepatocita-szerű sejtekben és a sejtek közti térben halmozódott fel, kanalikulus
képződést azonban nem tapasztaltunk. Mindez arra utalt, hogy a differenciáció végén a
hepatocita-szerű sejtek polarizációja és ez által a membrán proteinek megfelelő helyre
juttatása még folyamatban van.
A differenciáció hatékonyságát őssejt marker gének expressziójának nyomon
követésével is vizsgáltuk, melynek során az Oct3/4 és Nanog gének szignifikáns csökkenését
tudtuk kimutatni kvantitatív RT-PCR-el, ami arra utalt, hogy a differenciáció során a sejtek
elvesztették az őssejt karakterüket. A differenciációs folyamat végére a hepatocita marker
gének, az α-fötoprotein és az albumin expressziója szignifikánsan megemelkedett.
Ezt követő vizsgálataink rámutattak arra, hogy a humán embrionális őssejtekből
differenciáltatott hepatocita-szerű sejtek többé-kevésbé a hepatocitákra jellemző ABC
transzporter és TJ készlettel rendelkeztek. A kvantitatív RT-PCR-el végzett vizsgálatinak
során azt tapasztaltuk, hogy az általunk vizsgált négy tipikusan a polarizált hepatociták
bazolaterális (szinuszoidális) membránján expresszálódó ABC transzporter közül az ABCA1
(15-ször), az ABCC3 (MRP3) (15-ször) és az ABCC6 (MRP6) (30-szor) gének expressziója
növekedett meg szignifikánsan a differenciáció során. Az általunk vizsgált nyolc apikális
(kanalikuláris) ABC transzporter közül, pedig az ABCB11 (BSEP) (110-szer), az ABCC2
(MRP2) (30-szor), és az ABCG5 (8-szor) gének expressziója növekedett meg szignifikánsan.
Az apikális ABCG2 (BCRP) (20-szor) expressziója a differenciáció folyamata során
kezdetben csökkent, amit a folyamat végére szignifikáns növekedés váltott fel, ez egybevág
az irodalmi adatokkal. A tipikusan máj makrofágok (Kupffer sejtek) membránján

6. 5
expresszálódó ABCG1 (85-ször) és az epevezetéksejtek membránján expresszálódó ABCC7
(CFTR) (80-szor) géneknek szintén szignifikáns növekedését tapasztaltuk a hepatikus
differenciáció során.
A TJ komponens készletben végbemenő változásokat vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy
az endoderma-szerű sejtek szignifikánsan több claudin-1-et (30-szor) expresszáltak, mint a
hepatocia-szerű sejtek. A differenciáció során szignifikáns mértékben emelkedett a claudin-4
(20-szor), és agrin (10-szer) gének expressziója, és a legmagasabb szintet a differenciáció
végén érték el. Azonban a hepatocita-szerű sejtek nem expresszáltak több claudin-7, és
tricellulin gént a kiindulási sejtekhez képest.
A tumoros megbetegedések vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy amíg a
hasnyálmirigy duktuláris adenokarcinómák (PDAC) dedifferenciáltságával csökkent a
tricellulin expressziója, addig a hepatocelluláris karcinomás (HCC) esetekben a
dedifferenciáltság megnövekedett tricellulin termelődéssel és egyben rossz prognózissal járt
együtt. A tricellulin expressziót megvizsgáltuk továbbá cirrózisos (CIR) és fokális noduláris
hiperpláziás (FNH) esetekben is és azt tapasztaltuk, hogy amíg a CIR esetében enyhén, addig
az FNH-ban fokozódott a tricellulin protein expressziója. Az általáunk vizsgált
megbetegedések közül a HCC-ben tapasztaltuk a legnagyobb mértékű tricellulin termelődést.
Vizsgálataink során azt láttuk, hogy a fibrolamelláris carcinomában (FLC) kevesebb claudin-1
és tricellulin, azonban több claudin-5 expresszálódik, mint a hepatocelluláris carcinomában
(HCC). A humán máj és hasnyálmirigy rákok esetében mi detektáltuk elsőként a tricellulin
jelenlétét.
Következtetések
A humán embrionális őssejteket (ES) in vivo különböző morfogének és növekedési
faktorok hozzáadásával akár mindhárom csíravonal irányába lehet differenciáltatni. Célunk az
volt, hogy figyelemmel kísérjük az őssejtek máj irányú differenciálódási folyamata során a
tight junction (TJ) komponensek, és az ABC (ATP-binding cassette) transzporterek
génexpressziós változását. A differenciációs folyamat során a humán ES sejtekből először
endoderma-szerű sejtek lettek, amiket tovább differenciáltatva hepatocita-szerű sejteket
kaptunk.
A differenciáltatott sejtek sokszögletű morfológiája és funkcionális vizsgálata (pl.
glikogén tárolás, organikus anion felvétel/leadás, albumin és urea szekréció) is máj karaktert

7. 6
mutatott. Az őssejt marker gének (Oct3/4 és Nanog) expressziós szintje a differenciáció előre
haladtával szignifikánsan lecsökkent, míg a májra jellemző gének (α-fötoprotein, albumin)
expressziós szintje a differenciálás végén érte el a csúcspontját. Az endoderma-szerű sejtek
claudin-1 expressziója volt a legmagasabb, amely végül a hepatocita-szerű sejtekben
csökkent. A kolangiocita markerek expressziós szintje (claudin-4, CK-7, CK-19, és agrin) a
differenciálás végén volt a legmagasabb. A hepatocita-szerű sejtek a differenciálódási
folyamat végén néhány hepatocita-specifikus apikális (kanalikuláris) ABC transzportert
(ABCC2/MRP2, ABCG5 ABCB11/BSEP), úgy ahogy néhány hepatocita-specifikus
bazolaterális (szinuszoidális) ABC transzportert (ABCA1, ABCC3/MRP3 és ABCC6/MRP6)
szignifikánsan magas szinten expresszáltak. Az eddigi eredmények alapján elmondhatjuk,
hogy a differenciációs folyamat végén lévő sejtek egyaránt mutatnak hepatocita és
kolangiocita szerű karaktert. A HUES9-ből differenciálatatott hepatocelluláris és egyben
kolangiocelluláris karakterű sejtek segítségével a különböző típusú rákos megbetegedések
molekuláris mechanizmusait modellezhetjük. Eredményeink alátámasztják, hogy a hepatikus
differenciáció során a TJ komponensek és az ABC transzporterek nyomonkövetésével jobban
megérthetjük az in vivo máj organogenezist.
Összehasonlítottunk különböző máj és a hasnyálmirigy rákos megbetegedéseket (FLC,
HCC, FNH, CIR, PDAC) az ép máj és hasnyálmirigy szövetekkel a különböző TJ
komponensek és ABC transzporterek génexpressziója és fehérje lokalizációja alapján. Azt
találtuk, hogy míg a HCC-kben a magas tricellulin expresszió, addig a PDAC
megbetegedésekben az alacsony tricellulin expresszió társult rossz prognózissal.
Eredményeink előre vetítik annak a lehetőségét, miszerint a TJ komponenseket a tricellulint
és az ABC transzportereket a rák gyógyítás potenciális célpontjaiként tarthatjuk számon.

8. 7
Saját publikációk az értekezés témakörében
B. Erdélyi-Belle, Á. Apáti, Gy. Török, B. Sarkadi, Zs. Schaff, A. Kiss, L. Homolya
Expression profiling of hepatocyte-like cells initiated from human embryonic
stem cells
PATHOLOGY AND ONCOLOGY RESEARCH (2014) accepted
(IF: 1.555)
Somorácz A, Korompay A, Törzsök P, Patonai A, Erdélyi-Belle B, Lotz G, Schaff Z,
Kiss A.
Tricellulin Expression and its Prognostic Significance in Primary Liver
Carcinomas.
PATHOLOGY AND ONCOLOGY RESEARCH In press: p. In press. (2014)
IF: 1.555
Korompay A, Borka K, Lotz G, Somorácz Á, Törzsök P, Erdélyi-Belle B, Kenessey I,
Baranyai Zs, Zsoldos F, Kupcsulik P, Bodoky Gy, Schaff Zs, Kiss A
Tricellulin expression in normal and neoplastic human pancreas
HISTOPATHOLOGY 60:(6B) pp. E76-E86. (2012)
IF: 3.082
Patonai A, Erdélyi-Belle B, Korompay A, Somorácz Á, Straub BK, Schirmacher P,
Kovalszky I, Lotz G, Kiss A, Schaff Zs
Claudins and tricellulin in fibrolamellar hepatocellular carcinoma
VIRCHOWS ARCHIV-AN INTERNATIONAL JOURNAL OF PATHOLOGY 458:
pp. 679-688. (2011)
IF: 2.491
Apáti Á, Orbán T, Varga N, Németh A, Schamberger A, Krizsik V, Erdélyi-Belle B,
Homolya L, Várady G, Padányi R, Karászi É, Kemna EW, Német K, Sarkadi B
High level functional expression of the ABCG2 multidrug transporter in
undifferentiated human embryonic stem cells.
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES 1778:(12) pp. 2700-
2709. (2008)
IF: 4.180
Egyéb publikációk
Patonai A, Erdélyi-Belle B, Korompay A, Somorácz A, Törzsök P, Kovalszky I,
Barbai T, Rásó E, Lotz G, Schaff Z, Kiss A.
Molecular Characteristics of Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma.
Pathol Oncol Res. 2013 Jan;19(1):63-70. doi: 10.1007/s12253-012-9558-0. Epub 2012
Aug 8.
IF: 1.366

9. 8
Konferencia absztraktok
B. Erdélyi-Belle, Á. Apáti, B. Sarkadi, L. Homolya
Expression profiling of ABC transporters during hepatic differentiation initiated
from human embryonic stem cells
Magyar Őssejt Konferencia, Budapest 2008.06.05-2008.06.05
Erdélyi-Belle Boglárka
Az ABC-transzporterek expressziós szintváltozásának vizsgálata a humán
embrionális őssejtek máj-irányú differenciáltatása során
39. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg 2009.05.19-2009.05.22
Korompay Anna, Borka Katalin, Lotz Gábor, Kovalszky Ilona, Somorácz Áron,
Patonai Attila, Erdélyi-Belle Boglárka, Kiss András, Schaff Zsuzsa
A tricellulin jelenlétének, lokalizációjának és mennyiségi változásainak vizsgálata
humán pancreasban és egyes daganataiban
PHD TUDOMÁNYOS NAPOK, Budapest, 2010. április 15-16.
Erdélyi-Belle Boglárka
ABC transzporterek expressziós mintázata őssejt-eredetű májszerű sejtekben
40. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg 2010.05.18-2010.05.21
Patonai A, Törzsök P, Korompay A, Erdélyi-Belle B, Somorácz Á, Kovalszky I, Lotz
G, Kiss A, Schaff Zs.
Characteristics of fibrolamellar hepatocellular carcinoma: expression of tight
junction proteins.
EASL Special Conference on Hepatocellular Carcinoma: from Genomics to
Treatment, Dubrovnik, Croatia, June 25-26, 2010
Korompay A, Borka K, Erdélyi-Belle B, Somorácz Á, Törzsök P, Lotz G, Kovalszky
I, Patonai A, Kiss A, Schaff Zs.
A tricellulin jelenlétének, lokalizációjának és mennyiségi változásainak vizsgálata
egér hasnyálmirigyben, illetve humán pancreasban és egyes daganataiban.
69. Patológus Kongresszus, Siófok, szeptember 30-október 2, 2010
Korompay A, Erdélyi-Belle B, Apati A, Homolya L, Kiss A, Schaff Zs.
Expression profiling of tight junction proteins during hepatic differentiation
initiated from human embryonic stem cells.
46th
Annual Meeting of EASL, Berlin, Germany, March 30-April 3, 2011
A. Korompay, B. Erdelyi-Belle, Á. Apati, L. Homolya, A. Kiss, Z. Schaff

10. 9
981 EXPRESSION PROFILING OF TIGHT JUNCTION PROTEINS DURING
HEPATIC DIFFERENTIATION INITIATED FROM HUMAN EMBRYONIC
STEM CELLS
Journal of Hepatology - J HEPATOL , vol. 54, pp. S391-S391, March 2011
Somorácz Á, Korompay A, Patonai A, Erdélyi-Belle B, Törzsök P, Lotz G, Schaff Zs,
Kiss A.
Expression of tricellulin, a recently identified tight junction protein in normal
liver and in primary liver cancers.
46th
Annual Meeting of EASL, Berlin, Germany, March 30-April 3, 2011
Á. Somorácz, A. Korompay, A. Patonai, B. Erdélyi-Belle, P. Törzsök, G. Lotz, Z.
Schaff, A. Kiss
251 EXPRESSION OF TRICELLULIN, A RECENTLY IDENTIFIED TIGHT
JUNCTION PROTEIN IN NORMAL LIVER AND IN PRIMARY LIVER
CANCERS
Journal of Hepatology - J HEPATOL , vol. 54, pp. S103-S103, March 2011
DOI: 10.1016/S0168-8278(11)60253-5
Á. Somorácz, A. Korompay, P. Törzsök, A. Patonai, B. Erdélyi-Belle, G. Lotz, Z.
Schaff, A. Kiss
751 TRICELLULIN EXPRESSION CORRELATES WITH OVERALL
SURVIVAL IN HEPATOCELLULAR AND CHOLANGIOCELLULAR
CARCINOMAS
Journal of Hepatology Vol. 56 Supplement 2, Page S295, April 2012