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Sequencing technology 분석 이승배

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Wrtten by Seung-Bae,Lee

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Sequencing technology 분석 이승배

  1. 1. 이승배
  2. 2. Contents - 2 - • Sequencing 이해Part Ⅰ • Sequencing 기법(WGS, WTS, Exome, Target)Part Ⅱ • USE CASE Study(응용 분야 소개)Part Ⅲ • 참고 사항 :NGS & 3-4세대 Vendor별 Sequencing 기법Part Ⅳ
  3. 3. - 3 - Part Ⅰ: Sequencing 이해 Sequencing의 정의 Sequencing 역사
  4. 4. - 4 - 시퀀싱(sequencing)은 염기의 순서를 화학적으로 읽어 내는 것을 말하고, ‘염기서열해독'이라고 한다. Ⅰ. Sequencing 이해 샘플 준비 과정 ①DNA 추출 ②DNA Library 제작 (DNA에 1Primer 부착) ③증폭 1. 정의 시퀀싱 과정 ①Lib와 4가지 형광 색 2dNTP간 결합 ②카메라 촬영> 이미지 파일 ③이미지 분석> 염기문자 변형 데이터분석(Bioinformatics) ① 염기문자파일 upload ② 분석 Pipe-line 매핑/정렬->변이 분석 ③ 분석 결과 레포트 증폭기 Library 제작 기 DNA 추출 기 산출물 3Flow-cell위 에 증폭된 DNA Library 산출물 염기문자파일 CTAACCTGG GCTTCATCC GCTAATCCG CTCCTACC 1Primer: 대상 DNA의 복제 시작 부분을 표시해 주기 위한 작은 RNA 가닥으로부터 단일 가닥 DNA 끝 부분 붙임. 2dNTP(deoxy-Nucleoside-Tri Phosphate): DNA가 합성될때 필요한 물질로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 4가지 있음. 3Flowcell: 샘플 준비가 완료(추출->Lib제작->증폭)된 판. 시퀀싱 외부에서 샘플 준비 후 시퀀싱 장비로 이 판(flowcell)을 삽입 시킴.
  5. 5. - 5 - Ⅰ. Sequencing 이해 2. 역사 Fred Sanger에 의해 최초 Sequencing (수동 방식) - 1977 1970년 1990년 2000년 2010년 2020년 1st Sanger 자동화 Sanger Sequencing 개발(1990) Automated Sanger 1ST Human genome by Sanger method 크렉벤터, Sanger방식으로 최초 인간 염기서열 분석(2007) 1st Human genome by NGS 제임스 왓슨 NGS 방식으로 최초 인간 게놈 발표(2008) NGS 3-4G 대 부분 염기서열 분석은 NGS 방식으로 전이됨 (2009년 이후 현재까지) 현재, Pacbio만 상용화 초기이고, Nanopore 등 타 기술은 연구 중 (Pacbio특징은 PCR 증폭 필요 없음)
  6. 6. - 6 - ① Whole Genome Sequencing ② RNA-Seq ③ Whole Exome Sequencing ④ ChIP-Seq ⑤ Small RNA ⑥ Bisulfite-Seq ⑦ MeDIP-Seq Part Ⅱ. Sequencing 기법 Target Sequencing: 전체가 아닌 목표 부문을 정해서 표시하고 그 부분에 대한 Sequencing을 하는 기법으 로 Whole이 아닌 특정 목표 부분 에 해당되는 모든 기법이속함.
  7. 7. Ⅱ. Sequencing 기법  Sequencing 과정의 공통적 이해: 7 1. 시퀀싱 과정과 차이의 일반적 이해 과 정: Sample Preparation Sequencing by Sequencer: Sequencing 기법에 따른 변동 요소 없음 Data analysis by Bioinformatics Sequencing 기법 차이의 이유: 다양한 Sequencing 기법이 있지만, Sequencer(시퀀싱 장비)에선 오직 동일한 과정으로 DNA만을 대상으로, 형광 색을 뭍힌 4가지색의 서열판독용 염기(C,G,A,T)와 결합->사진촬영->이미지 판독->염기 문자파일 변환이란 과정만 있을 뿐임. 기법에 따른 기기 조작 차이나 DNA아닌 대상(RNA,단백질) 없음. Sequencing by Sequencer: DNA만 Sequencing Sample Preparation 상이 RNA-Seq Exome-Seq ChIP-Seq Small RNA-Seq Bisulfite-Seq MEDIP-Seq Bioinformatics 분석 상이 Resequencing De-novo assembly Variant calling #1 Variant calling # N …… Downstream # 1 Downstream # N 유전체 분석 기법의 차이는 Sample Preparation과 Bioinformatics 분석 방법의 차이에 따라 달라짐
  8. 8. Ⅱ. Sequencing 기법 8 Cluster Generation 군집 증 폭(Sequencer마다 상이) Library Preparation  Primer를 절개된 DNA Fragment 양쪽부착.  Primer + DNA Fragment = Library하며, 이 형태로 증폭-> Sequencing 처리를 함. DNA Shearing (DNA 절삭) ① 혈액/타액->DNA만 적출 ② 일정한 크기로 절단(DNA Fragment) 약 6시간 소요 약 4시간 소요 2. Pre-Sequencing Covaris 사의 Acoustic Disruptor를 이 용한 DNA shearing 로, 원하는 크기 로 균일하게 DNA shearing이 가능 각 Sequencing 종류 별, 별도의 Kit 가 있으며, Primer가 포함되어 있음. Flowcell이란 기판에 Library를 놓고 기기별 다른 증폭방식으로 증폭. (향후, 시퀀싱 장비로 Flowcell 기판 자체를 Insert)
  9. 9. - 9 - DNA 절삭-> DNA Library 제작 -> 증폭 극소 정량 DNA 절삭/추출과 primer 결합을 통한 Library를 제작하는 샘플 제작 과정임. (전용기기 이용) 선별된 DNA Library 를 증폭(Clustering)하 는 과정임.(증폭 기) 증폭된 최종 DNA Library가 다량 Clustering(군집)을 이루고 있는 시퀀싱 장비에 삽입 용 판넬 3. Pre-Sequencing 사례 소개Ⅱ. Sequencing 기법
  10. 10. - 10 - 정 의: 생명체가 가지고 있는 전체 DNA(Genome:유전체)를 해독하는 방법이며 이를 통해 서로 다른 개체들간의 특이적인 변이를 찾거나 질환 특이적인 변이를 찾는데 유용. 응용 분야: 유전적 변이 DNA Marker 개발 유전자 지도 개발 형질 분석 생식 질 판독 합맵(일부 유전체 분석) 구축과 전정 유전체 연 관성 연구 돌연변이 연구 진화 연구 1.WGS (Whole Genome Sequencing)Ⅱ. Sequencing 기법 Molecular Markers Development(DNA Marker) 질병 진단을 위한 Marker 개발에 활용.  Genetic Map construction & QTL Mapping: - 유전체 전체 지도 구축과 양적 형질 연구 HapMap construction & GWAS: * HapMap: 인간의 공통된 유전자변이 목록으로, SNP을 취합하여 비교하면서 질병 연구. SNP는 너무 많으므로 SNP와 연결된 각각 특정한 영역인 하플로 타입과 연결된SNP (30~60만개)로 이용 비교/분석함. * GWAS(Genome-wide association study): 대규모 정상인/환자 별 전체 변이 분석 결과 있고, 주로 질환과 같은 형질과 단일 염기서열 다형 성(SNP)사이에 관련성에 초점을 맞춤. Mutation Research: 돌연변이에 대한 연구 시 사용. Evolution Study: 개체의 진화, 타 개체간의 진화 연구.
  11. 11. - 11 - 정 의: 발현하는 RNA 전체에 대한 Sequencing을 말하며, WTSS(Whole Transcriptome Shot gun Sequencing)와 RNA-Seq라고도 불리고 Transcriptome는 전사(Transcription) + 유전체(genome) 합성 어 임. 2.WTS (Whole Transcriptome Sequencing)Ⅱ. Sequencing 기법 특 성:  mRNA를 직접 시퀀싱 장비로 해독이 불가능하기 때문에(4dNTP를 통한 Uracil에 대한 화학 결합 불가) 역 전사 효소를 통한 cDNA로 5역 전사를 하여 해독함. 응용 분야:  유전자의 발현 차이 분석과 변이분석 (SNP/SNV/Indel)하여 질병 발병 원인/경로 연구.  신약 발굴과 후보 신약 검증 연구 등.  대량의 Small RNA 발굴. 과 정: Sample Preparation ① 1mRNA 추출 ② 2Primer결합 ③ 3cDNA로 역전사(효소이용) cDNA 증폭 cDNA 시퀀싱 염기문자 파일 산출 1mRNA(Messenger RNA) : DNA의 유전 정보를 단백질 합성을 위해 리보솜에 전달하는 RNA를 말하며, DNA의 엑손(정보물질)만으로 이루어짐. 2Primer: 시발 체라고 하며 DNA의 합성 시, 시작점 표식을 위한 작은 RNA 가닥. 3cDNA(Complementary(상보적)DNA): 전사과정에서 DNA->mRNA 됨.이 Mrna를 역전사 효소(reverse transcriptase)로 다시 DNA로 인공적으로 바꾼 것 4dNTP: Deoxynucleotide로 DNA의 최소 구성 염기 조각(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)이며시퀀싱에서 서열 판독을 위해 형광색 묻혀 합성용으로도 사용. 5역 전사(Reverse Transcription): 역 전사 효소와 mRNA가 반응하여 cDNA로 바뀌는 현상(유전정보(엑손)이 그대로 cDNA로 전달됨)
  12. 12. - 12 - 정 의: 인간 DNA에는 정보를 갖고 있는 exon과 정보를 갖지 않은 Intron이 같이 섞여 구성되어 있는데 exon 전체를 exome이라고 칭하며 이런 중요한 부분인 Exome만 Sequencing 하는 기법을 WES라 함. 특 성: RNA-Seq와 달리, 전사과정 이전 원 상태 DNA 상황에서 엑솜만 추출하여 시퀀싱 하는 기법. 보다 정확한 전체 exon의 변이 분석이 가능함. WGS 보다 적은 부문(exon 만) 분석하므로 빠르고, 저렴하나, Intron부문을 통한 변이 등 분석에는 한계. 응용 분야:  질병 연관된 유전변이 발굴을 통한 조기 진단(암, 당뇨, 비만 및 중증 지적 장애 진단, 각종 증후군) 3.WES (Whole Exome Sequencing)Ⅱ. Sequencing 기법 과 정: Sample Preparation ① 샘플에서 DNA 적출. (DNA 적출 기 內) ② DNA中 exon에 1Probe 결합. (Sample 제작기內) ③ Probe와 2bead와 결합. (Sample 제작기內) ④ 자성으로 Bead 당겨, exon만 분리 (Sample 제작기內) DNA 증폭 (증폭기 內) Sequencing (Sequencer 內) 1Probe (탐침 DNA): 특정 염기배열을 갖는 DNA 단편이나 유전자를 찾는 데 사용되는 짧은 길이 DNA. 2bead : 탐침 하고자 하는 DNA만 Capture하기 위한 자성을 띈 구형 물질로 Probe와 결합함.
  13. 13. - 13 - 정의: ChIP 은 1Chromatin 2Immunoprecipitation의 약자로 단백질에 결합된 DNA 서열을 분리해낸 후 DNA와의 상호 관계를 알기 위한 목적으로 sequence 하는 기법. 응용 -세포 내 단백질과 DNA간의 상호작용을 알아내기 위해서는 전사 인자(특정단백질)과 Binding되는 DNA 서열을 알아냄으로 써, 각각 전사 인자가 유전자 발현에 영향 관계 분석 연구에 주로 사용. 4.ChIP-SeqⅡ. Sequencing 기법 특 성: - 전사인자를 추출하는 방법으로 항체를 이용하는 특성이 있음. 1. Chromatin(염색 질): 고등생물(진핵 생물)의 DNA는 세균 등 원핵생물의 DNA와 달리 핵 내에서 단백질, RNA, 지방 등과 복합체를 형성하고 있는데 이것을 염 색 질(chromatin)이라고 한다. 염색 질은 보통 핵 내에 분산하여 존재하고 있으나 핵 분열 기에 응축하여 염색체를 형성한다. 2. Immunoprecipitation(면역 침강 법): 항원 항체반응에 의하여 침전이 생기는 것. 유전공학의 분야는 이 반응을 이용하여 특정의 단백질에 대응하는 mRNA를 정제하는 방법을 의미하며, 면역 흡착 법이라고도 함 3. Transcription factor (전사 인자): 특정 유전자의 전사 조절 부위 DNA에 특이적으로 결합하여 그 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 조절 단백질. 과 정: Sample Preparation ① 전사인자(3Transcription factor) 고정(by 포름알데이트) – 제작 기 ② 인자 추출(항체(Antibody)를 통해 원심 분리) - 원심분리기 ③ Target DNA만 적출(인자와 결합된 DNA만 분리)-DNA분리기 DNA 증폭 (증폭기內) Sequencing
  14. 14. - 14 - 정의: Small RNA는 21~25개의 짧은 뉴클레오티드로 구성된 Non-codon RNA로 유전자 발현 제어(발현시기조절, 촉진,억제 등)하는 RNA로, miRNA (Micro RNA)와 siRNA(small interfering RNA)가 있으며,이러한 RNA를 분석 하기 위해 Sequencing 하는 기법. 특성: 두 가지 대표적인 small RNA는 mRNA일부 구간에 결합되어 발현을 조절 함. miRNA :인간 200종류 약 1000여 개 존재, 발현시기, Cell Proliferation(증식),Death(소멸), 세포 분화 조절. siRNA : 특정 mRNA에 결합하여 단백질 발현억제(유전자 침묵(Gene Silencing)) 유도 함. 응용 분야:  miRNA 돌연변이 분석을 통해 확인하여 질병(암,뇌졸 증 등)의 발병 위험도와 진단에 활용됨.  siRNA를 질병 mRNA파괴 물질로 활용. -> 질병 단백질 생성 이전 전사 단계에서 질병 mRNA를 분해-> 생성 자체를 사전 봉쇄 기술로 활용됨. -> 기존 항체 약품/치료 방식은 대상이 완성된 질병 단백질을 대상으로 공격) -> 이론적으로 모든 질병 유전자(난제 질병 유전자 포함)도 전사 단계 거치므로, 모두 치료 가능. 5. Small RNA SequencingⅡ. Sequencing 기법 과정: Sample Preparation ① small RNA만 고착(고착 Kit) ② small RNA만 분리.(분별 기) ③ Small RNA 표식(adapter(primer)와 bar-code). ④ Small RNA 역전사(cDNA) cDNA 증폭 Sequencing
  15. 15. 정의: DNA 1Methylation 변이 분석을 위한 Sequencing 기법으로 특정 염기서열 군2CpG island) 중 어떤 염기가 Methylation됐 는지를 확인함으로 써, 해당 특정 유전자의 발현이 억제됨에 따라 발생되는 질병 분석을 위한 Sequencing 기법. 응용 분야 : 암 억제 유전자(Tumor suppress gene)에 비 메틸화 여부 분석을 통해 암 분석 및 예견 분야에 많이 응용됨. 6. Bisulfite-SeqⅡ. Sequencing 기법 특성:  정확한 Cytosine 메틸화 지도 작성 가능하여 전장 유전체의 정확한 메틸화 파악이 가능함. 1Methylation(메틸화): 염기 서열 중, 일부 Cytosin에는 CH3(메틸기)가 붙어 있어, 이 메틸기가 전사(DNA->RNA)시, Cytosin에서 Uracil로 바뀌는 것을 억제하는 역할 을 하며, 이러한 현상을 말함. 2CpG island:C와G가 연속으로 몰려 있는 곳으로, 진화과정 중 점차 감소 했으며 주요 메틸화되는 위치임(전체 메틸화 중 70%), 종과 조직에 따라 특이한 차이점 있음. 과정: Sample Preparation ① DNA 절삭(절삭기) ② DNA에 primer 장착(샘플 제작기) ③ DNA에 Bisulfite 처리(Bisulfite Kit) -> CH3 (메틸기)가 없는 Cytosin->Uracil 변환처리. DNA 증폭 Sequencing
  16. 16. 정의: 메틸화된 시토신에만 인식하여 반응하는 특이한 항체를 이용하여 DNA 메틸화된 부위를 대량 선별(DNA 면역 침강 반응 기술)하고 이를 Sequencing하는 기법. 7. MeDIP-SeqⅡ. Sequencing 기법 응용분야 • 암 Bio marker 발굴에 활용. • 전장 유전체 메틸화 연구 활용(Geome-wide methylation Study). 특성: 메틸화(CH3)된 DNA 부문만 선별하여 Sequencing 할 수 있는 방법(면역 침강 기술 이용) 전장 유전체에 대해 비교적 적은 비용으로 Methylation 된 부분만 분석하는 기법임. 과정: Sample Preparation ① DNA 절삭(절삭기) ② DNA 선별(메틸기 항체 반응 Kit, 시티딘5) ③ 선별된 DNA에 Primer 부착(샘플 제작 기) DNA 증폭 Sequencing
  17. 17. - 17 - Part Ⅲ: USE-CASE Study(응용 사례) WGS와 GWAS 통한 질병진단 microRNA와 암 siRNA와 암 DNA Methylation과 암
  18. 18.  현재 WGS의 가장 활발한 응용분야는 전장유전체 단일 염기 다형 성(Whole genome SNP) 연구임.  SNP는 사람의 염기 서열 평균 200-300bp 마다 하나씩 존재하고, 이로 인해 개인적인 차이와 질병에 대한 민감성, 치료 반응 차이에 대한 원인 규명하는 것이 주된 내용임. 18 Ⅲ. Case Study- WGS(Whole Genome Seq.) 1. WGS와 GWAS 통한 질병진단  항 혈전제인, 클로피도그렐(clopidogrel)의 경우 일부 사람들에서 효과가 없었는데, 해당 환자에 대해 WGS을 통해 전체 SNP에 분석과 GWAS DB와 연동 분석한 결과, clopidogrel은 간에서 대사 되어야 효과가 나타나는데 일부 사 람들에게서 대사에 관여하는 CYP2C19유전자의 변이로 인해 간에서 대사 되지 않은 원인 규명함. WGS과 1GWAS를 통한 약물 연구 사례  SNP 중 MTNR1B와 CDKAL1 두 개 변이가 있는 산모는 임신 중 인슐린 분비 능력이 감소되고, 임신 성 당뇨 변이 로 확인됨. 임신 성 당뇨 변이가 있는 산모 중 50%는 출산 후, 10년 이내에 당뇨병 발병됨.  시험 대상 산모들을 대상으로 WGS를 통해 SNP 변이를 분석하고 GWAS와 연동 분석한 결과 두 개의 변이가 원인 임을 밝혀 냄. WGS과 GWAS를 통한 2임신 성 당뇨 병 유전자 변이 규명 1GWAS(Genome-wide association Study, 전장유전체연관분석 연구): 대규모 정상인과 각종 질병환자를 각각 유전체 분석 결과(특히,SNP)를 공유하는 기구/DATABASE. 2임신 성 당뇨병: 임신기간 중 처음으로 진단된 당뇨병으로 전체 임신부의 약 2~5%가 걸린다. 보통 임신 24~28주차에 임신 성 당뇨병 검사를 한다. 임신 성 당뇨가 있는 상태에서 혈당 조절을 하지 않으면, 태아가 4kg 이상으로 크게 태어나 제왕절개를 해야 할 수도 있다. 또 태아의 폐 성숙이 안 되거나 뇌 기능 이상, 저 혈당 증이나 저 칼슘증, 호흡 곤란 증, 고빌리루빈혈증 같은 여러 문제를 갖고 태어날 수 있다. 또 산모가 임신중독증에 걸릴 가능성도 높고, 사산·조기 진통 및 분만·비뇨기 계 감염 위험도 높다. 대상에서 DNA 추출/샘플 작성 Whole Genome Seq -전체 유전체 염기 문자 배출 Bioinformatics -1차 변이 분석->GWAS DB와 통계 분석 전반적인 변이와 질병 연관성 규명
  19. 19.  DNA Methylation(메틸화) 분석을 통한 암 진단/ Marker 개발 등에 활용: 19 Ⅲ. Case Study- Epiginomic 2. DNA Methylation과 암 ※암과 DNA 메틸화와의 관계: 암을 일으키는 유전체의 비정상적인 변이에는 3 종류로 알려져 있음 ① 염색체의 일부분이 통째로 바뀌는 변이 -> 유전적(genetic) 원인 or 방사선 노출 ② 염기 서열이 1-2 군데 바뀌는 서열의 변화-> 유전적 (genetic) 원인 or 방사선 노출 ③ 염색질의 변화(chromatin modification) -> 후천(성)적 원인. 후성적 유전체 변화 중에서 가장 대표적인 암 세포에서의 DNA 메틸화(methylation)는 식생활이나 환경 적 요인이 그 원인일 것으로 알려지고 있음. ☞암 억제 유전자(Tumor suppressor gene), 세포주기 조절(Cell cycle)유전자, DNA 수리(Repair)유전자, 세포 접착(adhesin)등 유전자의 Cytosine에 메틸화가 된다면 해당 유전자의 발현이 억제되어 암 발병률이 높아지는 관계가 있음. 메틸기(MH3)가 붙은 DNA 만 추출/샘플 준비 방법: 3가지 중 선택 전사인자방법 Bisulfite 방법 MEDIP방법 Sequencing 메틸기 연결된 염 기문자 산출 Bioinformatics -정렬->공개 DNA Methylation Cancer DB와 연관성 분석 암 진단/ Marker 개발
  20. 20. 20 Ⅲ. Case Study- Small RNA 3. miRNA와 암 miRNA를 통한 암 억제 유전자 조절 사례:-서울대 김 빛내리 교수 (Cell 기재) P53은 대표적인 암억제 유전자(Tumor suppressor gene). miRNA 中, miR-29 miRNA가 p53의 발현과 기능을 직접 조절 함. 이외 많은 miRNA가 암 유발/억제 유전자 발현 조절. (예: miR-221, -222, -146 증가->갑상선 유두 암 ) 암 의심환자의 miR-29(miRNA) 추출/샘플 작성 Sequencing -miR-29염기문자 추출 Bioinformatics -정렬->miR-29변이 량/ 암DB와 비교 연관성 확인 암 예견/진단 Nature 그림 (miRNA발현 량과 암 관계) http://www.nature.com/nm/journal/v11/n7/fig_tab/nm0705- 712_F1.html miRNA의 발현 과다로 상당수가 종양 억제 유 전자에도 붙어 종양 억 제 유전자(Tumor suppressor gene) 발 현 감소 miRNA 발현 부족 (Under expression) miRNA의 적은 발현수 로 암 유전자와 붙어 억제하는 수가 부족하 여 암 유도 유전자 (oncogene)이 증가됨. miRNA 발현 과다 (Over expression) 암 유도 유전자(Oncogene) : 암을 유발시키는 능력을 가진 유전자로, 약 40 여 종이 있으며, 계속 새롭게 밝혀지고 있음. 1Proto-oncogene에서는 암 유도 기능이 없다 가 mutation를 일으키면, oncogene으로 바뀜. Mutation의 원인: 발암물질, 방사선 등 종양 억제 유전자 (Tumor suppressor gene) : 무분별한 세포의 분열과 성장을 억제하는 기능 을 가져 암의 발생에서 중요한 역할. 대표적인 종양억제유전자인 p53은 세포의 비 정상적인 분열과 증식을 억제하며 세포 DNA 가 손상되었을 때에 이를 정상적으로 복구하는 기능을 수행하고, DNA가 무제한적으로 증폭되 는 것을 방지. 1Proto-oncogene(원암 유전자): 암을 일으키는 유전자가 아니라 정상적으로 세포주기의 조절에 관여하는 유전자로 모든 인간에게 존재하고, 이들은 세포 성장인자를 만들거나, 세포 성장인자의 합성을 조절하는 다른 단백질들을 암호화 함.
  21. 21. 21 Ⅲ. Case Study- Small RNA 4. siRNA와 암  siRNA 분석/연구 사례 (알려진 질병 유전자 억제하는 siRNA와 비교 분석, 알려지지 않은 새로운 siRNA 판단) 대상에서 siRNA 추출/샘플 작성 Sequencing -siRNA염기문자 추출 Bioinformatics - 정렬->공개DB와 비교 연관성 확인 신규 siRNA 분석 완료 질병 표적 유전자 (mRNA)용 분해 siRNA 설계 질병 세포 내 siRNA 투입 질병 표적유전자 (mRNA) 와 siRNA 분석 (Sequencing 등) 치료 siRNA 신약 개발 및 유효성 확인 (임상실험)  siRNA 이용한 신약 개발 사례-㈜ 바이오니아(Bioneer) & 사노피(Sanofi)  암/난치 성 질병 치료용 siRNA 나노 입자 치료제(SAMIRNA) 개발-’13.1 (국/내외 특허 등록)  SAMIRNA는 주사제로, 암 조직에만 선택적 전달 뒤 siRNA로 전이 되어 암 유발mRNA를 분해 시킨다고 함.  현재, 글로벌 제약회사인 사노피와 함께 간암,고형 암,만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에 임상실험 진행 중 임.  시험 대상에서 추출한 siRNA 샘플을 Sequencing과 Bioinformatics를 통해 신규 siRNA 여부 분석/ 등록.
  22. 22. - 22 - Part Ⅲ: 참고 자료 siRNA 와 뇌졸증/당뇨 병 NGS Sequencing Vendor별 기법 3-4세대 Sequencing 기법 소개
  23. 23. Ⅲ. 참고 자료 23 1. miRNA와 뇌졸증/당뇨 병 miRNA 돌연변이로 인한 뇌졸중 분석사례: 분당 차 병원 임상의학연구소 김남근,옥준 교수 -미국 혈액 생물학 지 기재  miRNA-146a에 돌연변이가 생긴 환자 > 허 혈성 소 혈관 뇌졸중과 허 혈성 대 혈관 뇌졸중.  miRNA-149에 돌연변이가 생긴 환자 > 허 혈성 소 혈관 뇌졸중이 높게 발병.  miRNA-146a + miR-149에서 동시에 돌연변이 > 무증상 뇌졸중이 발병. 정상/뇌졸증 환자 로부터 각각 146a, 149(miRNA) 추출/샘플 작성 Sequencing -146a,149염기문자 추출 Bioinformatics Potential 변이 추출-> 돌연 변이 DB와 연관성 분석 miRNA 돌연변이에 따른 뇌졸증 예견/진단 당뇨 병 치료를 위한 표적물질 연구사례: 가톨릭 의대 윤건호/김지원 교수– 당료 병 전문지 Diabetologia ’13/1 인슐린을 분비하는 췌장 베타세포 전사인자인 Beta2/NeuroD가 miR-30a-5p(miRNA)에 의해 억제됨으로 써, 인슐린 분비가 억제 되는 현상을 밝혀 냈음. 이는 당뇨 병 치료를 위한 새로운 표적물질 가능성 증명 사례. 향후 인간에 적용 시, miR-30a-5p(miRNA)에 대한 변이 추출/변 이 량 분석을 통해 치료 신약 개발에 활용 가능.
  24. 24. - 24 - Sanger Sequencing Overview Sanger NGS 특 징 생물체(대장균,박테리아 등 이용)를 통한 증폭 순차적인 촬영과 이미지 판독 상대적으로 긴 Read 사용. Nano 기술 비 생물체 증폭방식(Bridge, emulson Cluster) Multiple 촬영/판독 처리 방식. 상대적으로 짧은 Read 사용. 장 점 상대적으로 정확성이 높음 빠른 처리속도, 대량 증폭 가능, 저렴한 처리 비용. 단 매우 번거롭고 증폭 량 적고,시간/비용이 많이 듬. 중복이 있는 짧은 대량의 Read를 조합/데이터 분석이 어려움. Ⅲ. 참고 자료 2. Sanger vs. NGS
  25. 25. - 25 - Bridge 증폭 방식 Reversible Terminate Sequencing 방식 3. Illumina NGS Sequencer Step1: Bridge 증폭을 거친 이 Cluster에 4가지 색의 dNTP가 Terminator group으로 쉽게 합성. 형광 부분이 떼어져 질 때까지 더 이상 합성이 불가능하며, 결국 dNTP는 하나씩 합성됨. 이 때 레이저를 쏘아 Exciting 상태로 만들어 얻은 형광의 빛을 찍어냄. Step2: Wash의 과정을 거쳐 dNTP의 색을 제거. Step3: 위 과정을 반복적으로 하여 촬영한 이미지 파일을 분석하여 염기 문자로 산출함. 장점: • 생산력이 높음 (300Gb / run) • 짧은 run 처리시간(하루 미만) • 샘플 제작이 상대적으로 쉬움. 단점: • 짧은 Read 길이(36~150bp) • 상대적으로 많은 양 샘플 제작 필요. Ⅲ. 참고 자료
  26. 26. - 26 - 장점: •Read 길이가 상대적으로 김(200~1000bp) •Reference 서열이 없이 조립하는 de novo 유리함. •짧은 Run 실행시간 ( 하루 이내) 단점: •상대적으로 적은 처리량으로 인해, 운용비 비쌈. •샘플 준비 과정이 어렵고 복잡함. 4. Roche Sequencer < 454 시퀀싱 장비 처리 과정 소개 > STEP1: DNA합성 중에 PPi(Pyrophosphate)가 부산물로 생성. STEP2: PPi는 ATP-sulfurylase에 의해 APS와 반응 하여 ATP 생성. STEP3: ATP는 Luciferase 활성화 시켜 Luciferin으로 산화 (빛 발생) STEP4: 이 때 이 발산되는 빛을 CCD camera로 검출, 이미지 분석 함. Roche 454 시퀀싱 장비는 Pyrosequencing(파이로(불)시퀀싱) 방식 임. DNA를 합성하는 동안 생성되는 부산물인 Pyrophosphate(PPi)를 이용한 기술로 효소연쇄반응) 응용, Pyrosequencing 중 나타난 빛을 CCD 카메라로 검출/이미지 분석 함. Ⅲ. 참고 자료
  27. 27. - 27 -  장점 2개 염기 인코딩 방식이라 빠름.Two base encoding system 모든 염기를 두번씩 해독하는 효과가 있음 ((n-1)씩 겹쳐 해독하기 때문) 시퀀싱 산출량이 큼(270Gb / run)  단점 짧은 염기 파편 (30-80bp) 샘플 제작이 어려움. Illumina나 roche보다 Pair-end read 처리가 복잡함. 5. Life Technologies Sequencer Sequencing by Ligation : 라이게이션 시퀀싱 방식 Step 1: 알고 있는 염기 2개가 붙은 probe를 DNA에 합성. (4가지 색 표시) Probe가 Dntp가 아닌 Ligation(합성제한 효소:라이게이션)을 이용 절삭. Step 2: 합성되면 레이저로 쏘아 형광물질을 excite시켜 촬영 후->이미지 분석. Step 3: 다시, probe를 한 염기 뒤로(n-1)가서 위 합성>절삭>레이저>촬영>분석 반복 Ⅲ. 참고 자료
  28. 28. END OF DOCUMENT 감사합니다

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