Evaluacion de la planta helechito de agua Azolla filiculoides comofitorremediador sobre aguas contaminada con cobre.

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DECANATO
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN.
INFORME
TITULO :
Evaluación de la planta "Helechito de agua" (Azolla filiculoides) como
fitorremediador sobre aguas contaminadas con Cobre. Lambayeque. Septiembre-
Diciembre del 2015
AUTORES :
Barbosa Castro Roger1
, Pisfil Colchado Katheryn1
.
Lambayeque, 09 de diciembre del 2015

DEDICATORIA
Les dedicamos este presente trabajo
a Dios padre que siempre nos cuida y
guía, a nuestros padres por su apoyo
y al Msc Jhon García López.

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos en primer lugar a nuestros
padres que con su apoyo nos han
encaminado día a día para lograr nuevas
metas. A nuestro profesor Msc. Jhon
García López, que con las enseñanzas
brindadas hemos podido realizar esta
investigación aumentando así la ciencia en
nuestra facultad.

CONTENIDO
RESUMEN
I. INTRODUCCION
II. MATERIAL Y METODOS
2.1METODOS
2.2METODOS
2.2.1Recolección de las muestras.
2.2.2Aclimatación de las plantas en condiciones de laboratorio.
2.2.3 Elección de Procedimiento Experimental.
2.2.4 Análisis de los muestras con sulfato de cobre (II) mediante
espectrofotometría.
2.2.4.1 Espectro de absorción del sulfato de cobre.
2.2.4.2 Curva de calibración.
2.2.5 Absorbancia obtenidas mediante espectrofometría.
2.2.6 Determinación del peso fresco.
2.2.6.1 Determinación física de los tratamientos.
III. RESULTADOS
3.2 Recolección de las muestras.
3.3 Aclimatación de las plantas en condiciones de laboratorio
3.3 Plantas acuáticas en soluciones de sulfato de cobre (II)
3.4 Análisis de los muestras con sulfato de cobre (II) mediante
3.4.1Espectro de absorción del sulfato de cobre

3.4.2 Curva de calibración
3.4.3 Absorbancias obtenidas mediante espectrofometría
3.5 Determinación de peso fresco.
IV. DISCUSION
V. CONCLUSIONES
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
VII. ANEXOS

LISTA DE TABLAS.
Tabla N°02: Absorbancia de sulfato de cobre (II) a 0.031M cada 40nm.
Tabla N°03: Absorbancias iniciales y finales obtenidas luego de 10 días a 660nm.
Tabla N°06: Peso final e inicial, diferencias y % de pérdida en cada muestra.
LISTA DE FIGURAS.
Figura N°1: Espectro de absorción.
Figura N°02: Variación de absorbancia de 600 a 850nm.
Figura N°03: Curva de Calibración.

RESUMEN
El presente trabajo de investigación se realizó con el propósito de evaluar la planta
"Helechito de agua" (Azolla filiculoides) como fitorremediador de aguas contaminadas con
cobre.Las muestras fueron colectadas en la quebrada Shambo en el poblado de
Laquipampa, ubicada en el distrito de Incahuasi – Ferrenñafe. Las plantas fueron
aclimatadas en el laboratorio de Genética de la Facultad de Ciencias Biológicas - UNPRG
durante 15 días en bandejas de 5l con aguas de las lagunas y Agua Destilada (1:4), además
de sustancia nutritiva.Se realizaron 2 ensayos con 3 tratatamientos de la soluciones de
sulfato de cobre (II) a 0,125M, 0.063M, 0.032 y un 1 grupo control(Agua destilada ) .Se
seleccionaran plantas jóvenes con características viables y se agregó 3 g de plantas por
tratamiento en 8 envases de 200 ml con150 cm3 de cada solución .Los resultados se
obtuvieron mediante espectrofometría, obteniendo un porcentaje mayor de absorbancia a
concentraciones de 1,25M de sulfato de cobre(II), con un porcentaje de cambio del valor
inicial a final de 28, 26;30,04 %, y 31,44 a 660nm, 700nm y 805nm respectivamente
.Además el porcentaje máximo de perdida fue de 34,33% a esta misma concentración.
Concluimos que Azolla foliculoides absorbe iones de cobre contribuyendo en un proceso
de fitorremediación.
Palabras claves: Azolla foliculides,sulfato de cobre(II),fitorremediación,absorbancia

I.INTRODUCCIÓN
Azolla filiculoides (helecho de agua) es una especie de Azolla, nativo de regiones templadas
y tropicales de las Américas, así como la mayor parte del viejo mundo, incluyendo Asia y
Australia. Crece en regiones templadas en altitudes desde cerca del nivel del mar hasta
5.000 msnm. En general, Azolla prefiere condiciones frías y semisombreadas y se
desarrolla mejor en contenidos altos de fósforo, tanto en el agua como en el suelo.
Taxonómicamente podemos ubicarla dentro de la clase Polypodiopsida /Pteridopsida;
orden Salviniales; familia Azollaceae. Son plantas acuáticas flotantes, de hojas pequeñas
con raíces cortas. Frondes divididas cuyo color oscila entre rojo y púrpura a pleno sol y de
verde pálido a verde azulado en la sombra. Crece muy rápido, ideal para cubrir la
superficie. Ayuda a controlar el desarrollo de las algas al limitar la disponibilidad de la luz.
Son intolerantes al agua salada. Flotan en la superficie del agua por medio de numerosas,
pequeñas, estrechamente sobrepuesta escamas como hojas, con sus raíces colgando en el
agua. Forman relaciones simbióticas con la cyanobacterium Anabaena azollae, que da a la
planta la capacidad de fijar nitrógeno del aire.
Azolla es también una seria maleza en muchas partes del mundo, cubriendo cuerpos de
agua tanto que no se ve el agua. Así se deriva el nombre 'helecho mosquito', por la creencia
de que ningún mosquito puede penetrar la cubierta verde de helechos para poner sus huevos
en el agua. Azolla tiene fama de ser capaz de crecer tan rápido de duplicar su biomasa en
tres días en buenas condiciones.Puede crecer en temperaturas frescas, con prolongadas
heladas en invierno, y a veces no pueden pasar el invierno así. Son utilizadas como planta
ornamental.
La fitorremediación puede definirse como una tecnología sustentable que se basa en el uso
de plantas para reducir in situ la concentración o peligrosidad de contaminantes orgánicos e
inorgánicos en agua, suelo y aire; a partir de procesos bioquímicos realizados por las
plantas y microorganismos asociados a su sistema de raíz que conducen a la reducción,
mineralización, degradación, volatilización y estabilización de los diversos tipos de
contaminantesEn los últimos años el tratamiento de aguas residuales por medio de
estanques con plantas acuáticas ha despertado un gran interés, por el potencial que han
presentado para la depuración de las mismas. Algunos de estos sistemas han logrado
proporcionar un tratamiento integral en donde no solamente se remueven eficientemente
material orgánico y sólidos suspendidos sino que también se logran reducir nutrientes, sales
disueltas, metales pesados y patógenos.

El cobre es uno de los metales pesados que mayor preocupación está causando en el mundo
por su acción sumamente toxica para los organismos y para el hombre. Se considera poco
peligroso en forma metálica y en sales minerales, pero en compuestos orgánicos su acción
se torna muy toxica para el hombre como último consumidor de pescados y mariscos, que
tienen la propiedad de acumularlos en sus tejidos.
La fitorremediación ha sido propuesta para limpiar tanto el agua del suelo y la superficie
contaminada con metales pesados para que las plantas son capaces de contener, eliminar o
neutralizar. Entre esas plantas dirigidas a los procesos de fitorremediación, especies de
helechos poseen la capacidad de acumular metaloides tales como Cd, Pb, Cu, Cr, Ni, Zn, y
As; y pueden alcanzar niveles altos de estos contaminantes sin mostrar ningún signo de
toxicidad. Esta acumulación natural está relacionada con la resistencia que representa la
respuesta de las plantas a condiciones de estrés metal.
Debido al incremento en la población, el desarrollo industrial y la producción agrícola
intensificada, se han liberado enormes cantidades de contaminantes al medio ambiente,
deteriorando los cuerpos de agua; por lo que es necesario desarrollar estrategias para
reducir y prevenir su contaminación .En el presente trabajo de investigación se estudió y
determinó la capacidad que tiene la planta Azolla filiculoides de absorber y acumular en sus
estructuras metales pesados como el Cobre y lograr así disminuir la contaminación en las
aguas. Por último este estudio servirá de gran ayuda para futuros proyectos a gran escala
que permitan la identificación de contaminación y la disminución de esta misma sobre las
aguas lo que beneficiara al medio ambiente que lo rodea.

II.MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1METODOS
Este estudio fue realizado en cuatro meses en el laboratorio de Genética de la Facultad
de Ciencias Biológicas – UNPRG.
El material vegetal empleado en este estudio, se obtuvo de plantas colectadas en la
quebrada Shambo en el poblado de Laquipampa, ubicada en el distrito de Incahuasi -
Ferrenñafe.
2.2METODOS
2.2.1 Recolección de las muestras.
Las muestras de Azolla filiculoides serán en el poblado de Laquipampa,
ubicada en el distrito de Incahuasi - Ferrenñafe, y se transportaron en baldes de
4L con agua de las lagunas, a temperatura ambiente (25 ºC).
2.2.2 Aclimatación de las plantas en condiciones de laboratorio
Las plantas serán aclimatadas en el laboratorio de Genética de la Facultad de
Ciencias Biológicas - UNPRG hasta el momento de la realización del
experimento. Esta fase se considerara absolutamente necesaria pues permitirá
determinar si la planta puede adaptarse a las condiciones de laboratorio.
Las plantas se colocaran en bandejas de 5 litros conteniendo en estos
recipientes una mezcla de Aguas de las lagunas de donde se colecto, con la
adición de Agua Destilada (1:4) y Sustancia Nutritiva para su respectiva
aclimatación, para este proceso tendrá una duración de 7 a 10 días.
2.2.3 Elección de Procedimiento Experimental
El experimento se llevara a cabo bajo un diseño completamente al azar y será
conformado por 4 grupos con 2 repeticiones.
De las plantas aclimatadas, se seleccionaran plantas jóvenes con buenas
características y que estén viables se agregará 3g de muestra por tratamiento.

Se agregaron 150 cm3 de las soluciones de sulfato de cobre (II) según el
protocolo (Tabla Nº 1).
Tabla Nº 1: Protocolo de la solución
# de Envase Composición y concentración (moles dm-3
)
1 y 2 Sulfato de cobre (II), 0,125M
3 y 4 Sulfato de cobre (II), 0.063M
5 y 6 Sulfato de cobre (II), 0.032M
7y 8 Agua destilada + nutrientes
2.2.4 Análisis de los muestras con sulfato de cobre (II) mediante
2.2.4.1 Espectro de absorción del sulfato de cobre
Se representará el espectro de absorción del sulfato de cobre, es decir se
realizara medidas de la absorbancia de la solución más diluida cada 40
nm para seleccionar la longitud de onda más adecuada para medir con
precisión el resto de tratamientos.
2.2.4.2 Curva de calibración
Realizaremos una curva de calibración a dichas longitudes de onda:
medir la absorbancia de las soluciones preparadas y graficar absorbancia
en función de concentración.
2.2.5 Absorbancia obtenidas mediante espectofometría.
Se determinara el valor inicial de absorbancia de cada una de las muestras
antes y después del tratamiento después de 10 días aplicado el
tratamiento.
Se calculara la variación de absorbancia y/o concentración en estos
períodos y se construirá una tabla con los resultados y a partir de ellos
realizar un gráfico para mostrar la variación
2.2.6 Determinación del peso fresco.
Para la determinación de la biomasa (peso fresco) se tomaron al inicio del
ensayo cada planta seleccionada será pesada antes y después de los
tratamientos para determinar la ganancia o pérdida de biomasa como peso
fresco.
2.2.6.1 Determinación física de los tratamientos

Para la lectura se tomara en cuenta los siguientes parámetros: Clorosis
(hojas amarillentas con presencia mínima en la mitad de una de las dos
hojas); Necrosis (borde quemado, mínimo en la mitad de una de las dos
hojas); Peso húmedo (después de 10 días).
III.RESULTADOS
3.1 Recolección de las muestras.
Se colectó las plantas de Azolla filiculoides en la quebrada Shambo en el
poblado de Laquipampa, ubicada en el distrito de Incahuasi - Ferrenñafe, y se

transportaron en baldes de 4L con agua de las lagunas, a temperatura ambiente
(25 ºC) con el debido cuidado para lograr que las plantas no pierdan sus raíces
y permanezcan vivas.
3.2 Aclimatación de las plantas en condiciones de laboratorio
Las plantas fueron aclimatadas en el laboratorio de Genética de la Facultad de
Ciencias Biológicas - UNPRG hasta el momento de la realización del
experimento.
Las plantas fueron colocadas en bandejas de 5 litros conteniendo en estos
recipientes una mezcla de Aguas de las lagunas de donde se colecto, con la
adición de Agua Destilada (1:4) y Sustancia Nutritiva.
Debido a la dificultad de aclimatar las plantas en laboratorio se adecuó una
cámara de luz simuladora con un foco de 20 watts donde las plantas estuvieron
expuestas por unas 5 horas luego se colocaron cerca de una ventana de luz
natural. Debido a estas dificultades y pruebas para aclimatar las plantas este
proceso tuvo una duración de 15 días realizando dos aclimataciones para
mejores resultados.
3.3 Plantas acuáticas en soluciones de sulfato de cobre(II)
Se realizó 2 ensayos conformado por 3 tratamientos más 1 grupo control,en
cada uno de ellos.
De las plantas aclimatadas, se seleccionaran plantas jóvenes con
características viables. Se consideró adecuado utilizar 3 g de las plantas por
tratamiento (8 envases) en depósitos transportes de 200 ml.
Se agregó 150 cm3 de las soluciones de sulfato de cobre (II) según el
protocolo de la Tabla Nº 1 en cada uno de los ensayos y se colocaran en una
mesa ambientada cerca de la ventana para que tengan una buena iluminación.
3.4 Análisis de los muestras con sulfato de cobre (II) mediante
3.4.1 Espectro de absorción del sulfato de cobre
Se midió la absorbancia de la solución de sulfato (II) de cobre más
diluida (0,031M) Cada 40nm (Tabla N°02) y con estos resultados se
representó el espectro de absorción de sulfato de cobre (II) (Figura N°1).

Tabla N°02: Absorbancia de sulfato de cobre (II) a 0.031M cada 40nm.
λ
(nm) 460 500 540 620 660 700 740 780 820 860 900 940 980
A 0.007 0.007 0.018 0.025 0.049 0.101 0.19 0.273 0.323 0.316 0.293 0.266 0.248
Figura
400 500 600 700 800 900 1000 1100
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
A
N°1: Espectro de absorción
Se graficó la variación de absorbancia de 600 a 850 nm (Figura N°02).

600 650 700 750 800 850
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
f(x) = 0x - 1
R² = 0.97
Absorbancia
Figura N°02: Variación de absorbancia de 600 a 850nm.
Luego seleccionamos las longitudes de onda más adecuadas, mediante
Excel (Hypothesis Test: Paired Observations) para medir la validez de
nuestra afirmación con respecto a la proporción de toda población de
espectros de absorción.
Se seleccionó las longitudes de onda en el rango de 660nm a 820nm
como el rango más adecuado y significativo (Cuadro N°1).
Cuadro N°01: Hipótesis de Prueba

Hypothesis Test: Paired
Observations
0.000000
hypothesize
d value
0.127600
mean Group
1
0.187200
mean Group
2
########
mean difference (Group 1 - Group
2)
0.026595 std. dev.
0.011894 std. error
5 n
4 df
-5.01 t
.0074
p-value
(two-tailed)
Observations
0.000000
hypothesize
d value
0.010667 mean A
0.016667
mean Group
2
######## mean difference (A - Group 2)
0.005568 std. dev.
0.003215 std. error
3 n
2 df
-1.87 t
.2029
p-value
(two-tailed)
Observations
0.000000
hypothesize
d value
0.291667
mean Group
1
0.269000
mean Group
2
0.022667
mean difference (Group 1 - Group
2)
0.004509 std. dev.
0.002603 std. error
3 n
2 df
8.71 t
p-value
(two-

3.4.2 Curva de calibración
Se realizó una curva de calibración a dichas longitudes de onda (660nm)
para medir la absorbancia de las soluciones preparadas y se graficó la
absorbancia en función de la concentración (Grafico N°02).
Figura N°03: Curva de Calibración
3.4.3 Absorbancias obtenidas mediante espectrofometría
Se determinó el valor inicial de absorbancia de cada una de las muestras
de concentración de sulfato de cobre (II) inicialmente y después de 10
días.
Se calculó la variación de absorbancia y/o concentración en estos
períodos y se construyó una tabla con los resultados. (Tabla N°03, Tabla
N°04 y Tabla N°05).
Tabla N°03: Absorbancias iniciales y finales obtenidas luego de 10 días a
660nm.
Concentración
de CuSO4
Muestra Valor inicial
Valor
final
Diferencia
% de
cambio

0.125 M
#1 0.368 0.264 0.104 28.26%
#2 0.368 0.293 0.075 20.38%
0.063 M
#3 0.256 0.213 0.043 16.80%
#4 0.368 0.184 0.072 28.13%
0.031 M
#5 0.124 0.105 0.019 15.32%
#6 0.124 0.117 0.007 5.65%
700nm.
Concentració
n de CuSO4
Valor
final
Diferencia
% de
cambio
0.125 M
#1 0.679 0.4750 0.204 30.0441826
#2 0.679 0.5290 0.15 22.0913108
0.063 M
#3 0.342 0.3120 0.03 8.77192982
#4 0.342 0.2930 0.049 14.3274854
0.031 M
#5 0.179 0.1520 0.027 15.0837989
#6 0.179 0.1700 0.009 5.02793296
805nm.
Concentración
de CuSO4
Valor
final
Diferencia
% de
cambio
0.125 M
#1 1.23 0.843 0.387 31.46
#2 1.23 0.929 0.301 24.47
0.063 M
#3 0.624 0.462 0.162 25.96
#4 0.624 0.432 0.192 30.77
0.031 M
#5 0.322 0.234 0.088 27.33
#6 0.322 0.248 0.074 22.98
3.5 Determinación de peso fresco.
Para la determinación de la biomasa (peso fresco) se tomó el peso de cada
ensayo antes y después de los tratamientos para determinar la ganancia o
pérdida de biomasa como peso fresco.
Los resultados fueron registrados (TablaN°06).

Tabla N°06: Peso final e inicial, diferencias y % de pérdida en cada
muestra.
Concentración
de CuSO4
Muestra Peso inicial Peso final Diferencia
% de
perdida
0.125 M #1 3.000 1.970 1.03 34.33
#2 3.000 2.060 0.94 31.33
0.063 M #3 3.000 2.210 0.79 26.33
#4 3.000 2.150 0.85 28.33
0.031 M #5 3.000 2.450 0.55 18.33
#6 3.000 2.570 0.43 14.33
3.5.1 Determinación física de los tratamientos
Para la lectura se tomó en cuenta los siguientes parámetros: Clorosis
(hojas amarillentas con presencia mínima en la mitad de una de las dos
hojas); Necrosis (borde quemado, mínimo en la mitad de una de las dos
hojas); Peso húmedo (después de 10 días) (Anexo).
IV .DISCUSION
Azolla filiculoides (helecho de agua) flota en la superficie del agua por medio de
numerosas, pequeñas, estrechamente sobrepuesta escamas como hojas, con sus
raíces colgando en el agua, estas son muy sensibles a movimiento o manipulación
brusca, es por ello que esto fue uno de las limitantes del transporte desde el lugar de
recolección hasta el laboratorio donde se realizó el experimento , para superar este
inconveniente se recolecto gran número de muestra en baldes que fueron

transportados con mucho cuidado hasta el laboratorio y allí se eligió las plantas
aptas para la aclimatación.
La planta Azolla, Crece en regiones templadas en altitudes desde cerca del nivel del
mar hasta 5.000 m.s.n.m prefiere condiciones frías y semisombreadas y se
desarrolla mejor en contenidos altos de fósforo, tanto en el agua como en el suelo.
Es por estas razones que la aclimatación fue otra de nuestros retos ya que Azolla no
se adaptaba fácilmente a las condiciones de laboratorio y el tiempo de aclimatación
duro más de lo programado, para solucionar estas dificultades se adecuo en el
laboratorio una lámpara con un foco donde fueron colocadas las muestras a
aclimatar y otras fueron colocados frente a luz natural cerca de una ventana
,finalmente se pudo lograr aclimatarlas utilizando macro y micro nutrientes y la
mezcla de materia orgánica en el fondo traída de la misma zona de recolección, lo
que demuestra la gran importancia del uso de materia orgánica de esta planta para su
sobrevivencia.
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante espectofometria en las tablas y
gráficos, luego de 10 días se pudo demostrar que las plantas absorben iones de cobre
y esto se pudo determinar a partir de la medición de la absorbancia de cada uno de
las muestras antes y después del tratamiento. Esto indica que la concentración de
iones cúprico disminuyo del valor final respecto al inicial. Es decir que se corroboró
con la hipótesis planteada. Además a partir de estos resultados se puede interpretar
que las plantas podrían contribuir a un proceso de fitorremediación .Se puede
observar que el porcentaje de cambio de absorbancia y por lo tanto en la
concentración del ion de solución es más pronunciado cuando las soluciones tienen
altas concentraciones (1,25M), lo que podría indicar que la planta Azolla requiere
una cierta concentración adecuada de cobre en el medio para empezar a absorber
este metal ya que estas plantas son capaces de retener en sus tejidos una gran
variedad de metales pesados (como cadmio, mercurio, arsénico) y el mecanismo de
cómo actúa se cree es a través de formaciones de complejos entre el metal pesado
con los aminoácidos presentes dentro de la célula, previa absorción de estos metales
a través de las raíces esto abre el inicio de nuevas investigaciones por resolver.

V. CONCLUSIONES
 Se Determinó la quebrada Shambo en el poblado de Laquipampa, ubicada
en el distrito de Incahuasi - Ferrenñafe,como la zona donde se extrajeron
las plantas de "Helechito de agua" (Azolla filiculoides).
 Logramos Aclimatar las plantas de "Helechito de agua" (Azolla filiculoides)
en condiciones de laboratorio usando recipientes de 5 litros que contenían

una mezcla de Aguas de las lagunas de recolección y con la adición de
Agua Destilada (1:4) junto con Sustancia Nutritiva, el proceso tuvo una
duración de 10 días.
 Se Determinó las concentraciones de Cobre (II) 0,125M, 0.063M y 0.032,
para cada uno de los tratamientos junto con agua destilada con nutrientes
(grupo control) agregando 150 cm3 de cada uno a los 8 envases de 200ml
con 3g de la planta.
 Pudimios Comprobar la capacidad de "Helechito de agua" (Azolla
filiculoides) para absorber iones de Cobre y así disminuir la contaminación
de las aguas, con un porcentaje de cambio del 28 a 34% a una
concentración de 1,25M de sulfato de cobre (II).
VI.RECOMENDACIONES
 Se propone utilizer distintas variedades de plantas y de iones metálicos para
corroborar y comparer los resultados obtenidos en este trabajo de investigación.
 Asi mismo se propone ampliar el estudio usando diferentes periodos de tiempo
con diferentes tratamientos para garantizar mayor validez de los resultados.
 Por otro lado, se recomienda probar con concentraciones de iones de
concentraciones mayores de 1,25M sulfato cuprico(II).
 Se recomienda medir la absorbancia de las soluciones con tiempos de ensayo
inicial, durante y final a diferentes longitudes de onda.

VII.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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15. Krosravi, M., Ganji, T. M., & Rakhshaee, R. (2005). Toxic effect of Pb, Cd, Ni and
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growth, nitrogen and phosphorus removal from wastewater , en‖ Water Research,
vol. 35, 1592-1598, 2001.

Evaluacion de la planta helechito de agua Azolla filiculoides comofitorremediador sobre aguas contaminada con cobre.

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