1. Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”
Campus La Morita
Técnicas en
Bioquímica
Profa. Fabiola Sarco Lira. • Univ. Ismar Romero.
• Univ. José Rojas.
• Univ. Kelvin Rojas.
• Univ. Victor Rojas.
Grupo #03
Abril, 2013

2. Electroforesis
Es una técnica para la separación de moléculas que se
basa en la migración de solutos iónicos bajo la
influencia de un campo eléctrico; estas partículas
migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una
combinación de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional.
Separación, visualización y
Ventajas cuantificación del numero de
proteínas de una solución.
Afecta la estructura de las proteínas
Desventajas por lo tanto, también afecta a la
función de la misma.

3. Movimiento iónico en un
campo eléctrico
Durante el proceso de migración de una partícula cargada en un
campo eléctrico, dependiendo de la carga neta ocurrirá lo siguiente:
a. Si la partícula posee carga + se moverá hacia el cátodo.
b. Si la partícula posee carga – se moverá hacia el ánodo.
c. Si la partícula no posee carga no se moverá

4. Electroquímica moderna, Volumen 1.
John O'Mara Bockris

5. En la electroforesis, la fuerza que
mueve la macromolécula es el
potencial eléctrico, E, expresada
en voltios/cm.
La movilidad electroforética de la
molécula, μ, es el cociente entre la
velocidad de la partícula, V,
expresada en cm/seg, y el
potencial eléctrico.
Principios de Bioquímica
La movilidad electroforética esta Lehninger
expresada en cm2 /(V)(s)
La movilidad depende de la carga de
la partícula que, a su vez, depende
del pH del medio en el que se
encuentre.

6. Proceso Electroforético
Electroforesis libre:
Electrodos
Una disolución tamponada de
la mezcla de proteínas se coloca
en una célula de observación en Buffer
forma de U.
Proteínas
disueltas en el
buffer
http://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpg

7. La disolución a tratar se aplica
Electroforesis de zona : como una mancha , o como una
banda, y las partículas migran a
través del disolvente, utilizando
además un medio de soporte
inerte y homogéneo, tal como
el papel o ciertos tipos de geles.
Bioquímica
Christopher K. Mathews

8. Cámaras Electroforéticas
Cámaras horizontales
En la electroforesis de tipo
horizontal generalmente,
se trabaja con ADN o
ARN.

9. En la electroforesis de tipo
Cámaras verticales vertical, se analizan tanto
moléculas de ADN como
proteínas.

10. Medios de Soporte
Método sencillo y rápido
•Proteínas
•Oligonucleótidos
Separación de: •Carbohidratos
Papel •Lípidos
•Se desgarra fácilmente
•Distorsiona las bandas
Desventajas •Se produce interacción entre
las proteínas y los grupos
hidroxilo de la celulosa, por lo
tanto la migración se frena

11. Se usa en el análisis de fluidos biológicos
Tiempo de análisis corto
Acetato de
Celulosa Sencillez de la técnica
Desventaja: Su débil resolución
Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han
esterificado por acetilación, por lo que no hay interacción
con las proteínas.

12. Almidón Técnica barata, fácil y rápida
Soporte mas usado
en electroforesis
Poliacrilamida De alta resolución
Gel Sus componentes
son tóxicos
Buena resolución
Separación de
Agarosa moléculas grandes
con radio mayor a 5-
10nm (virus, ácidos
nucleicos)

13. Factores que afectan la
Electroforesis
 Carga neta
 Tamaño
 Intensidad del campo eléctrica
 Temperatura
 Medio de soporte
 Buffer

14. Electroforesis en gel de poliacrilamida
¿Qué es la poliacrilamida?
Polímero generado a partir de acrilamida y
bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa para
realizar electroforesis de macromoléculas, en
especial proteínas y fragmentos de ácidos
nucleicos.
http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html

15. ¿Como se realiza la electroforesis
en gel de poliacrilamida?
• Primeramente se necesita el gel de poliacrilamida,
quien funciona como filtro gracias a su estructura
porosa.
http://www.esacademic.com/dic.nsf
/eswiki/943905 http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspx

16. electroforesis en gel de
poliacrilamida?
• Colocar las muestras en los
pocillos.
http://biomodel.uah.es/biomode
• Se aplican cargas eléctricas l-misc/anim/elfo/electrof.html
http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electrofor
esis-monografia.html

17. ¿Como se realiza la electroforesis
en gel de poliacrilamida?
• Aplicar un colorante tal como el azul de
Coomassie.
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm

18. Electroforesis en gel de
poliacrilamida en SDS
Es otra técnica electroforética también aplicada en
proteínas en la que las mismas sufren desnaturalización.
¿SDS?
¿De que habla?
El SDS (Dodecilsulfato sódico) es un compuesto
desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.

19. ¿Como se realiza la electroforesis
en gel de poliacrilamida SDS?
• Primero deben
desnaturalizarse las proteínas.
http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mito-
• En presencia de SDS la realidad.html
proteína:
http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012/1 http://cvclavoz.com/blog/paralel http://bioquimica6ce.wikispaces.co
1/proteinas.html o/page/6/ m/Proteinas

20. ¿Como se realiza la electroforesis
en gel de poliacrilamida SDS?
• Se colocan las
muestras en los pocillos
y se aplican las cargas
eléctricas.
http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/electro
foresis-en-gel.html
• Se visualizan
añadiendo un
colorante como el azul
de Coomassie
http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biologia/t
ecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html

21. Electroforesis bidimensional
¿Qué es?
Es una técnica para la separación de
mezclas complejas de proteínas, ya que la
misma permite la separación y visualización
de hasta 1.000 proteínas diferentes en un
solo gel.

22. ¿Cuál es el procedimiento para la
electroforesis bidimensional?
• Punto Isoelectrico
• Se establece un gradiente de pH.
Se incorpora una
mezcla de
anfolitos.
Lehninger 5ta edición

23. ¿Cuál es el procedimiento para
la electroforesis bidimensional?
Primera dimensión . pI decreciente
El gel se coloca sobre un
gel de poliacrilamida SDS
Segunda dimensión Peso molecular
decreciente
Electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS
pI
Lehninger 5ta edición
decreciente

24. Electroforesis en gel de
agarosa
o Es una técnica utilizada para fragmentos grandes
de ADN.
¿Agarosa?
La agarosa es un polímero de galactosa
http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196

25. ¿Cómo se lleva a cabo la
electroforesis en gel de agarosa?
• Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con
un buffer.
http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.html

26. ¿Cómo se lleva a cabo la
electroforesis en gel de agarosa?
http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-
nucleicos.html

27. ¿Cómo se lleva a cabo la
electroforesis en gel de agarosa?
http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-
molecular-1-electroforesis/

28. La Espectrofotometría
Es una de las técnicas experimentales
más utilizadas para la detección
específica de moléculas. Se caracteriza
por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta
naturaleza (contaminantes,
biomoleculas, etc) y estado de
agregación (sólido, líquido, gas)

29. Principios de la
Espectrofotometría
• Todas las sustancias pueden absorber energía
radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe radiación
de longitudes de ondas que no pertenecen al
espectro visible; el agua absorbe fuertemente
en la región del infrarrojo.

30. • La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles
e infrarrojas depende de la estructura de las
moléculas, y es característica para cada sustancia
química. En el proceso de absorción de la radiación,
un fotón incidente cede su energía a una molécula,
lo que da lugar a la excitación de la misma que
pasa a un nivel de energía superior.

31. • Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la
energía es absorbida; la energía radiante no puede
producir ningún efecto sin ser absorbida. La
frecuencia de la radiación absorbida es proporcional
a la diferencia de energía entre ambos niveles.

32. • El color de las sustancias se debe a que éstas
absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar
a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no
absorbidas.

33. • La espectrofotometría se basa en dos leyes que
relacionan la absorción de luz a una determinada
longitud de onda con la concentración del
material absorbente y la longitud del camino que
debe atravesar. Estas dos leyes, que combinadas
resultan en la ley de Lambert-Beer

34. Espectro de absorción
• Representación gráfica de la absorbancia de un
analito (o de otra magnitud equivalente) en función de
la longitud de onda de la radiación, l, (o de otro
parámetro relacionado con la energía de la radiación
utilizada).

35. Ley de Lambert Beer
ASPECTOS TEÓRICOS
Medición
La fotometría de luz
La espectrofotometría
Luz
La colorimetría monocromática
Leyes de
Lambert y Beer

36. La medida de la absorción
Lambert y
Beer
El espesor de la sustancia absorbente
relacionan
La cantidad de sustancia que absorbe
observando
crecimiento exponencial de la absorción
de radiación
En Función de
espesor de la región absorbente la cantidad de esa especie

37. Ley de Lambert Beer
Ley de Lambert: «la cantidad de luz absorbida por
un cuerpo depende de la
Medio absorbente concentración en la solución»
Intensidad transm.
1. Agua con azúcar disuelta.
2. Agua con mayor cantidad de azúcar.

38. Ley de Lambert Beer
Ley de Beer: «La cantidad de luz absorbida por
un objeto depende de la distancia
recorrida por la luz»
Sustancia absorbente
Intensidad trans.
1. Agua con azúcar disuelta.
2. Agua con azúcar disuelta
en un vaso con mayor
diámetro.

39. Ley de Lambert Beer
Estas dos leyes se combinan en la ley de
Lambert-Beer:
«Relaciona la absorción de luz con las
propiedades del material atravesado,
relaciona la intensidad de luz entrante en
un medio con la intensidad saliente
después de que en dicho medio se
produzca absorción»
http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-radiacion_11.html

40. Ley de Lambert Beer
• Transmitancia (T)
Es la fracción de radiación incidente transmitida por la solución
Si T se expresa en %,
T % = 100 I/I0 T: I/I0
• Absorbancia (A)
Es la fracción de radiación incidente absorbida por la solución, expresada
como
A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T
Si T se expresa en % A = log100/T% = 2 -logT%

41. Ley de Lambert Beer
La ley de Lambert-Beer establece que la
absorbancia está directamente relacionada
con las propiedades intrínsecas del analito,
A= C .ξ . L con su concentración y con la longitud de
la trayectoria del haz de radiación al
atravesar la muestra
• ξ: Absortividad molar
Es una propiedad de la materia relacionada
únicamente con la naturaleza de la misma.
a cuando la concentración está en mg/L
ξ cuando la concentración está en mol/L
• L: Trayectoria de la radiación a través de la
muestra (cm)
• C: Concentración (mg/L ó mol/L)
expbasquimica-g1-zb-09-10.wikispaces.com

42. Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.;
Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE
QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la
luz. MacGraw Hill: México.

43. Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.;
Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE
QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la
luz. MacGraw Hill: México.

44. Ley de Lambert Beer
1) Una disolución 100 µM de un determinado cromóforo tuvo una
transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una celda 1.5 cm de
longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolución; b) la
absorptividad molar del cromóforo.
a) A = -log T = - log 0.5 = 0.301
b) A = C . ξ . L Reordenando la ecuación obtendremos:
ξ = A/(C . L) = 0.301 /(10-4 M x 1.5 cm) = 2 x 103 M-1 cm-1
% Transmitancia
0,5
0,01
% Concentración

45. Nadie puede volver atrás y
comenzar de nuevo. Pero
cualquiera puede comenzar hoy
mismo y hacer un nuevo final, no
te rindas.
Anónimo