Phản ứng kháng nguyên và kháng thể

1. Trao đổi trực tuyến tại:
http://www.mientayvn.com/Y_online.html

2. PHAÛN ÖÙNG
Khaùng nguyeân – Khaùng theå
PGS. TS. Cao Minh Nga
BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Dược TP. HCM

3. KHAÙI NIEÄM
 ÑN: Laø nhöõng phöông phaùp mieãn dòch hoïc (MDH)
 Muïc ñích:
Xaùc ñònh hoaëc / vaø
- chuaån ñoä moät KN
- ñònh löôïng hieäu giaù moät KT
- ño löôøng moät phöùc hôïp KN-KT
- ño löôøng caùc nhaân toá  tham gia / heä thoáng MD.
VD: kieåm tra hoaït tính cuûa boå theå.

4. Nguyeân lyù phaûn öùng KN-KT
 Tính ñaëc hieäu
a
b
b
a
c
Khaùng nguyeân A
c

6. Khaùng nguyeân• Điểm quyết định KN (epitope):
phần trên phân tử KN có khả
năng liên kết đặc hiệu vào phần
liên kết với KN trên phân tử KT

7. Tương tác KN - KT

8. Hiện tượng vùng

9. PHAÂN LOAÏI
A. PƯ döïa treân söï taïo thaønh “haït”:
1. PƯ keát tuûa (precipitation reaction): KN hoøa tan.
2. PƯ ngöng keát (agglutination reaction): KN höõu hình
B. PƯ döïa treân hoaït ñoäng sinh hoïc cuûa KT:
1. PƯ keát hôïp boå theå (complement binding reaction)
2. PƯ trung hoøa (neutralization reaction)
C. PƯ MD ñaùnh daáu:
1. PƯ MD huyønh quang (immunofluorescence reaction)
2. PƯ MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)
3. PƯ MD phoùng xaï (radio immmuno assay - RIA).
4. Thöû nghieäm xaùc ñònh Westein Blot (daáu thaám MD).

10. Caùc phaûn öùng MD coù ñoä nhaïy khaùc nhau
Loaïi phaûn öùng MD Ngöôõng phaùt hieän (g/ml)
Keát tuûa / moâi tröôøng loûng
Keát tuûa / thaïch:
- khueách taùn ñôn (Mancini)
- khueách taùn keùp (Ouchterlony)
- MD ñieän di (Immuno electrophoresis )
20
10
3
50
Ngöng keát: - tröïc tieáp
- giaùn tieáp
- NK vi khuaån
0,5
0,001
0,001
Coá ñònh boå theå (CF) 0,1
Mieãn dòch huyønh quang (IF) 0,1
Ñònh löôïng MD phoùng xaï (RIA) 0,0001
Ñònh löôïng MD enzym (EIA) 0,0001

11. * Caùc phaûn öùng MD thöôøng duøng
trong Vi sinh laâm saøng
A. PƯ ngöng keát (agglutination reaction)
- Ngöng keát: nhoùm maùu, nhoùm VKÑR, …
- Latex, ngaên ngöng keát (HI)
B. PƯ MD ñaùnh daáu:
- MDHQ (IF),
- ELISA

12. A. PƯ ngöng keát
(agglutination reaction)
Khaùng nguyeân
IgG
IgM
A
C
B
Phaûn öùng ngöng keát
- A: khoâng xaûy ra khi caû 2 vò trí cuûa IgG ñeàu gaén
vaøo moät KN
- B: xaûy ra khi IgG trôû thaønh caàu noái giöõa caùc KN
- C: raát deã xaûy ra khi KT laø loaïi IgM
Kháng nguyên
Tạo mạng

13. Phaûn öùng NK hoàng caàu giaùn tiếp
(thuï ñoäng)
* NK hồng cầu thuï ñoäng
KN hoaëc hapten KT / maãu
gaén treân giaù khoaùc

14. Phaûn öùng NK hoàng caàu giaùn tiếp
(thuï ñoäng) - 2
* NK hồng cầu thuï ñoäng ñaûo ngöôïc
KT / giaù khoaùc KN / maãu

15. PHAÛN ÖÙNG NGAÊN NGÖNG KEÁT HOÀNG CAÀU
(Hemagglutination Inhibition - HI)

16. B. Caùc phaûn öùng MD ñaùnh daáu
1. MD huyønh quang (immunofluorescence - IF)
VD:  RSV, theå neùgri / beänh daïi, Chlamydiae, …
* Ñeám teá baøo doøng chaûy (flow cytometry):
ñeám & phaân loaïi TB.
2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).
VD:  HBV, HCV, HIV, Rubella, …

17. 1. PƯ MD huyønh quang
(immunofluorescence reaction) - IF

18. 1. PƯ MD huyønh quang: nguyeân lyù

19. Ñònh tyùp virus DEN baèng IF vôùi KT ñôn doøng
(thuoác nhuoäm fluorescein )

20. Virus sôûi taïo hôïp baøo töø caùc TB Vero bò nhieãm.
Chaát huyønh quang gaén vaøo KT khaùng virus sôûi ñaõ bieát.
(thuoác nhuoäm rhodamin )

21. 2. PHAÛN ÖÙNG ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )
* Muïc ñích: ñònh löôïng KN hoaëc KT hoøa tan / dòch sinh hoïc.
* Nguyeân lyù cô baûn:
KT/pha raén + KN/maãu + KTE + Subtrate
KN/pha raén + KT/maãu + Khaùng KTE + Subtrate
 maøu: So maøu (maét / maùy ño OD)
* Kyõ thuaät thöïc hieän: - "Caïnh tranh”
- "Khoâng caïnh tranh"

22. ỏ

ỏ
E E E EEH2SO4
E E E E E
E E E E ETMB
a. MD caïnh tranh ELISA:
Nguyeân lyù kyõ thuaät ñònh löôïng KT

23. MD cạnh tranh ELISA
Phản ứng màu tỉ lệ nghịch
với nồng độ kháng thể

24. b. ELISA theo phương pháp “sandwich”

25. c. ELISA “Toùm baét”: MAC-ELISA
(IgM antibody capture-ELISA)
Máy đo quang
Máy ủ Máy rửa
Kháng IgM
IgM /maãu
KN ñaõ bieát
Cộng hợp
Cơ chất
Đo Mật độ quang (OD)

26. Gieáng ñaõ ñöôïc gaén moät löôïng KN nhaát ñònh

27. ELISA
 Öu ñieåm cuûa kyõ thuaät ELISA
 - xeùt nghieäm ñoàng thôøi nhieàu maãu
 - duøng maùy töï ñoäng (±) =>  thao taùc caù nhaân
 - ñoïc keát quaû khoâng phuï thuoäc vaøo chuû quan ngöôøi laøm
XN
 - döõ lieäu keát quaû löu ñöôïc  kieåm tra chaát löôïng
 - giaù thaønh xeùt nghieäm reû.
- là công cụ chủ yếu /  bệnh nhiễm virus

28. ELISA
 Nhöôïc ñieåm cuûa kyõ thuaät ELISA
 - Thôøi gian thöïc hieän XN laâu hôn, kyõ thuaät phöùc
taïp
 - Chi phí maùy moùc ban ñaàu, chi phí baûo haønh baûo
döôõng
 - Nhaân vieân xeùt nghieäm phaûi ñöôïc ñaøo taïo kyõ
 - soá maãu xeùt nghieäm ít => toán keùm do phaûi laøm
nhieàu chöùng

29. CÁC THỬ NGHIỆM NHANH
(test nhanh)
 Nguyên lý
- Agglutination
- Immunodot
- Immunofiltration
- Immunochromatography

30. Nhoû maãu

31. Ghi nhận keát quaû
(1) : döông tính
(2) : aâm tính
(3) : khoâng yù nghĩa

32. CAÙC THÖÛ NGHIEÄM NHANH
(test nhanh)
 Öu ñieåm:
 - xeùt nghieäm vôùi soá löôïng maãu nhoû
 - deã thöïc hieän, cho keát quaû nhanh
 - khoâng ñoøi hoûi thieát bò ñaëc bieät, sinh phaåm deã baûo quaûn
 - coù theå thöïc hieän ôû caùc tuyeán cô sôû
 - xeùt nghieäm vieân coù theå ñöôïc ñaøo taïo nhanh

33. CAÙC THÖÛ NGHIEÄM NHANH
(test nhanh)
 Nhöôïc ñieåm:
 - giaù thaønh cao
 - khoâng thuaän lôïi khi xeùt nghieäm soá maãu lôùn
 - khoâng löu ñöôïc döõ lieäu kyõ thuaät
 - moät soá test nhanh coù ñoä nhaïy keùm hôn so vôùi ELISA

34. XEÙT NGHIEÄM KHAÚNG ÑÒNH
WESTERN BLOT
Nguyeân lyù :
- ñieän di proteine virus  phaân taùch theo PM / gel
polyacrylamide
- chuyeån sang giaáy nitrocellulose: caùc proteine ñònh vò theo PM
- KT / beänh phaåm + KN ñaëc hieäu töông öùng
- phaùt hieän phöùc hôïp KN-KT baèng coäng hôïp -KT gaén enzyme
- phaûn öùng hieän maøu vôùi cô chaát: ñoïc ñöôïc baèng maét
 caùc baêng maøu ôû vò trí coù KT ñaëc hieäu vôùi KN töông öùng

36. BIEÄN LUAÄN KEÁT QUAÛ
WB (-): khoâng coù baêng naøo
WB (+): : coù ít nhaát 2 baêng töông öùng vôùi proteine voû
HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41
HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36
ngoaøi ra coù caùc baêng töông öùng vôùi saûn phaåm cuûa gen gag/pol
WB chöa xaùc ñònh : coù baêng ôû vò trí khaùc tieâu chuaån WB (+)

37. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Ñoä nhaïy (ngöôõng phaùt hieän haøm löôïng KN&KT):
Moãi phaûn öùng coù ngöôõng phaùt hieän  nhau
------> neân ñònh löôïng.
2. Hieäu giaù ranh giôùi: ranh giôùi giöõa bình thöôøng & beänh lyù.
VD: hieäu giaù ranh giôùi cuûa ASLO laø 1:200
(200 ñôn vò/ml huyeát thanh)
------> (+) khi  400 ñ.v/ml.

38. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ (2)
3. Tieán trieån cuûa hieäu giaù KT trong HTh BN:
“huyeát thanh keùp”
4. Keát quaû (+) tính giaû:
---------> thöôøng duøng nhieàu phaûn öùng cuøng luùc.
5. Ñaùp öùng KT: coù thay ñoåi veà lôùp Ig
- IgM: xuaát hieän tröôùc
- IgG: xuaát hieän sau, thay theá nhanh choùng cho IgM.