Rapport_final_1B

DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE ET DE GÉNIE BIOTECHNOLOGIQUE
Faculté de génie
Université de Sherbrooke
PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE NANOPARTICULES DE CHITOSANE
RENFERMANT DE LA BERBÉRINE POUR LE TRAITEMENT DU CANCER
par
ANTOINE BRIÈRE
NATHANAËL CARBONNEAU
SARAH DION
JOCELYN MORIN
SAMUEL NICOL
SHIRAA NOUMBISSIE-NZEFA
NICOLAS PERRON
ÉLODIE VACHON LACHIVER
Équipe 1B
travail présenté à
NATHALIE FAUCHEUX
dans le cadre du cours
GBT 415
Projet d’intégration I
Sherbrooke
NOVEMBRE 2015

2
TABLE DES MATIÈRES
1. INTRODUCTION ..............................................................................................................................................3
1.1 CONTEXTE DE RÉALISATION DU PROJET .....................................................................................................3
1.2 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET GLOBAL ............................................................................................4
1.3 OBJECTIFS ET DESCRIPTION DU PROJET 1B.....................................................................................................5
1.4 INTÉRÊTS ÉCONOMIQUES DE LA RÉALISATION D'UN TEL PROJET ...................................................................6
2. MÉTHODOLOGIE ............................................................................................................................................7
2.1 PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................................................7
2.2 CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ..................................................................................................10
2.2.1 Pourcentage d'encapsulation................................................................................................................10
2.2.2 Cinétique de libération..........................................................................................................................12
2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules.......................................................................................................13
2.2.3.1 La lyophilisation.................................................................................................................................14
3. RÉSULTATS ESCOMPTÉS...........................................................................................................................16
3.1 RÉSULTATS DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES ............................................................................16
3.2 RÉSULTATS DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES ....................................................................16
4. BUDGET............................................................................................................................................................19
5. RISQUES ET MESURES DE SÉCURITÉ ....................................................................................................20
6. PLANIFICATION EXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION ...............................................22
7. CONCLUSION .................................................................................................................................................23
ANNEXE................................................................................................................................................................30
A-1. PROTOCOLES DE LA PRÉPARATION DES NANOPARTICULES (IONIC CROSS-LINKING)...................................30
A-2. PROTOCOLE DE LA PRÉPARATION DE LA COURBE ÉTALON DE CHLORURE DE BERBÉRINE.........................35
A-3. PROTOCOLES DE LA CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES................................................................36
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1: TYPES DE NANOPARTICULE FRÉQUEMMENT UTILISÉS POUR LA LIBÉRATION D'UN PRINCIPE ACTIF.............................5
FIGURE 2: STRUCTURE DU TRIPOLYPHOSPHATE DE SODIUM (SIGMA-ALDRICH, SODIUM TRIPOLYPHOSPHATE)..........................7
FIGURE 3: CHITOSANE SOUS SA FORME PROTONÉE (BAHRKE ET COLL., 2003). ...........................................................................7
FIGURE 4: COMPLEXE STPP/CHITOSANE (CHIH-HUI, 2009)........................................................................................................8
FIGURE 5: STRUCTURE DU CHLORURE DE BERBÉRINE (SIGMA ALDRICH, BERBERINE CHLORIDE).............................................10
FIGURE 6: SCHÉMA DU FONCTIONNEMENT D'UN SPECTROFLUORIMÈTRE (ÉQUIPE 1B, ORAL INTERMÉDIAIRE 3)......................11
FIGURE 7: TAILLE DES NANOPARTICULES SANS BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013).................................................................16
FIGURE 8: NANOPARTICULES NE FORMANT PAS D'AGRÉGATS (II) FORMANT DES AGRÉGATS (III) (CHOU ET COLL., 2013). .......17
FIGURE 9: PROPRIÉTÉS DES NANOPARTICULES SELON LES QUANTITÉS DE BERBÉRINE AJOUTÉES (CHOU ET COLL., 2013)........17
FIGURE 10: CINÉTIQUE DE LIBÉRATION DES NANOPARTICULES CONTENANT DE LA BERBÉRINE (CHOU ET COLL., 2013)..........18
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU 1: VALEURS DES PARAMÈTRES CONSTANTS.................................................................................................................9
TABLEAU 2: LISTE D'ÉPICERIE DE L'ÉQUIPE 1B ET COÛTS AFFÉRENTS. ......................................................................................19
TABLEAU 3: MESURES DE PRÉVENTION SELON LES PRODUITS UTILISÉS. ...................................................................................20
TABLEAU 4: PROTOCOLES À EFFECTUER SELON LES SEMAINES DE LA SESSION. ........................................................................22

3
1. INTRODUCTION
1.1 Contexte de réalisation du projet
La Société canadienne du cancer estime que 196 900 Canadiens auront reçu un diagnostic de cancer d’ici
la fin de l’année 2015 (Société canadienne du cancer, 2015) et que ce nombre pourrait augmenter de 40%
d’ici 2030 en raison de la croissance de la population et de son vieillissement (Presse canadienne, 2015).
Actuellement, trois principales méthodes sont employées afin de traiter les personnes atteintes de cette
maladie, soit la chirurgie, la radiothérapie ainsi que la chimiothérapie (Ligue nationale contre le cancer,
2009).
La chirurgie consiste à l’ablation de la zone tumorale en retirant partiellement ou complètement les tissus
de l'organe atteint. Cette méthode est utilisée pour traiter plus de 50% des personnes atteintes d'un cancer
(Société canadienne du cancer, 2015). La radiothérapie, de son côté, vise à soumettre les cellules tumo-
rales à des rayonnements électromagnétiques (photons X ou gamma) ou à des rayonnements corpuscu-
laires (faisceau de protons ou de neutrons) (Maranninchi et coll., 2005). Lorsqu'ils entrent en interaction
avec les cellules malignes, ces rayonnements peuvent provoquer des ruptures simple-brin ou double-brin
de leur ADN et, ainsi, causer leur mort (Maranninchi et coll., 2005). On estime qu'au moins deux patients
sur trois auront recours à la radiothérapie durant la période de traitement de leur cancer (Maranninchi et
coll., 2005).
La chirurgie et la radiothérapie sont deux méthodes dites « locorégionales », car elles ciblent les cellules
cancéreuses se retrouvant dans une région précise du corps du patient. Inversement, la chimiothérapie,
qui implique l'administration par voie orale ou intraveineuse de substances chimiques, n'est pas une mé-
thode locorégionale. Elle est utilisée pour traiter approximativement 22% des patients atteints d'un cancer
(Milliman, 2013) et les principales substances qu'elle implique sont les agents alkylants, les antimétabo-
lites ainsi que les vinca-alcaloïdes (Ligue nationale contre le cancer, 2009).
Les agents alkylants forment des radicaux alkyles qui effectuent des liaisons covalentes avec certains des
atomes des acides nucléiques (ADN et ARN). Lors de la transcription de l'ADN, la liaison avec le radical
empêche la séparation adéquate des brins, ce qui entraîne une incapacité de la cellule à se diviser et, par
le fait même, sa mort (Poletto, 2009). Les antimétabolites, de leur côté, se divisent en deux sous-catégo-
ries ayant chacune leur propre mode d'action. Les antimétabolites « antifoliques » inhibent l'activité des
enzymes essentielles à la synthèse des acides nucléiques, tandis que les antimétabolites « leurres » vont
mimer une base azotée et être intégrés à l'ADN lors de sa synthèse. Pour la cellule, l'un ou l'autre de ces
deux médicaments perturbe la phase S du cycle cellulaire et, ainsi, empêche sa division (Poletto, 2009).
Enfin, les vinca-alcaloïdes qui sont des composés organiques provenant de différentes pervenches tropi-
cales empêchent la mitose en contrant la formation du fuseau mitotique (Poletto, 2009).
Il est possible que les cellules cancéreuses migrent par rapport à leur zone tumorale initiale et envahissent
d’autres tissus de l’organisme. Les cellules qui agissent de la sorte se nomment « métastases » et rendent
parfois nécessaire le couplage de deux ou de trois méthodes de traitement différentes (Société canadienne
du cancer, 2015). De fait, pour un cancer métastatique (cancer s’étant propagé), la radiothérapie peut être
employée pour éliminer la source des cellules cancéreuses, soit la tumeur d’origine, alors que la chimio-
thérapie peut être utilisée avantageusement afin d’éliminer les cellules cancéreuses répandues non spé-
cifiquement dans d’autres parties du corps (Ligue nationale contre le cancer, 2009). Cependant, le recours
à la chimiothérapie entraîne également son lot d’inconvénients. En effet, les agents chimiques se diffu-
sent dans les différents tissus de l’organisme et perturbent toutes les cellules dont la division cellulaire
est rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Les cellules cancéreuses, dont la division s'effectue

4
rapidement, sont alors détruites, mais les cellules saines qui ont naturellement un rythme de multiplica-
tion élevé le sont également (Société de recherche sur le cancer, 2015). Cela explique pourquoi les pa-
tients traités par chimiothérapie perdent habituellement leurs cheveux. En effet, les cellules responsables
de la croissance des cheveux ont une division rapide (Société de recherche sur le cancer, 2015). Outre la
perte de chevelure, la chimiothérapie peut provoquer plusieurs autres effets secondaires indésirables chez
le patient tel que des dommages permanents aux organes (cœur, foie, reins, organes reproducteurs, etc.)
(Société canadienne du cancer, 2015).
1.2 Objectifs et description du projet global
Pour contourner les inconvénients de la chimiothérapie, de nombreux chercheurs des domaines pharma-
ceutiques et de la nanomédecine tentent de développer un système de libération contrôlé de médicaments
(Centre national de la recherche scientifique, 2015). En d'autres mots, ceux-ci cherchent à concevoir des
méthodes par lesquelles les agents chimiothérapiques sont délivrés directement aux tissus cancéreux sans
toutefois atteindre et affecter les tissus sains. Le présent rapport s’inscrit dans un projet de plus grande
portée dont l’objectif est similaire. De fait, ce projet vise l’élaboration d’un système de libération d’alca-
loïde afin de l’utiliser dans un contexte biomédical, soit pour le traitement du cancer (Faucheux, 2015).
Pour parvenir à atteindre cet objectif, trois principales phases doivent être réalisées : la préparation et la
caractérisation du polymère formant la structure du système de libération du médicament, la préparation
et la caractérisation du système lui-même ainsi que l’étude des effets du médicament délivré sur la survie,
la prolifération et la migration des cellules cancéreuses (Faucheux, 2015).
La première phase implique d’extraire de la chitine (un biopolymère de N-acétylglucosamine très abon-
dant dans la nature) des carapaces de crustacés et de procéder à sa désacétylation (élimination de grou-
pement acétyle sur la chaîne polysaccharidique). Lorsque le degré de désacétylation de la chitine atteint
une valeur supérieure ou égale à 60 %, il est question de chitosane (Ifremer, 2010). Contrairement à la
chitine, le chitosane est soluble en milieu acide et son activité antimicrobienne, sa biocompatibilité ainsi
que sa biodégradabilité en font un polymère structural de choix pour le développement d'un système de
libération contrôlé de médicaments (Ifremer, 2010). La deuxième phase du projet consiste à préparer des
nanoparticules (c’est-à-dire un système de libération dont les dimensions sont comprises entre 1 et 100
nm) (De Jong, 2008) à partir du chitosane préalablement produit puis à y introduire de la berbérine. La
berbérine est un alcaloïde hétérocyclique activant l’enzyme adénosine monophosphate-activated protein
kinase (AMPK), ce qui lui confère un effet inhibiteur sur la migration des cellules cancéreuses. En effet,
le rôle de l'AMPK est d'assurer que la cellule a des ressources d'énergie suffisantes pour se diviser (Jones
et coll., 2005). Dans le cas d'un stress métabolique (déficience en glucose, par exemple), l'AMPK s'active
et elle phosphoryle la protéine p53. Cette phosphorylation active la p53 et fait en sorte que le cycle de la
division cellulaire est désormais régulé par la présence de cette protéine (Jones et coll., 2005). Or, il se
trouve que la p53 permet la multiplication des cellules saines, mais bloque la multiplication de toutes les
cellules anormales (les cellules cancéreuses, entre autres) (Katiyar et coll., 2009). Par cette chute d'acti-
vation, la berbérine peut donc inhiber la prolifération des cellules cancéreuses. La berbérine a également
un rôle sur la cyclo-oxygénase 2 (COX-2) qui est une enzyme qui catalyse la conversion de l'acide ara-
chidonique en prostaglandine E2 (PGE2) (Xuan et coll., 2015). De son côté, PGE2 est une protéine qui
peut contribuer à l'augmentation de la production de la protéine Bcl-2 qui est anti-apoptotique (elle em-
pêche les cellules de se « suicider » en cas d'anormalité) (Sobolewski et coll., 2010). Ainsi, par l'inhibition
de cette voie enzymatique, la berbérine contribue à limiter la prolifération et l'invasion des cellules can-
céreuses. Ces effets de la berbérine seront d'ailleurs l'objet d'études lors de la troisième phase du projet,
alors que les impacts de la mise en contact de cellules de mélanome murin B16F10 et des nanoparticules
contenant cet alcaloïde seront analysés.

5
1.3 Objectifs et description du projet 1B
Le présent rapport traite plus profondément de la deuxième phase du projet, c’est-à-dire de la préparation,
mais aussi de la caractérisation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine. La prépara-
tion et l’utilisation de nanoparticules sont non seulement utiles pour contourner les revers de la chimio-
thérapie, mais également pour empêcher le médicament d’être dégradé avant d’arriver à sa cible, soit les
cellules cancéreuses. De fait, la berbérine est dégradée à un plus faible taux lorsqu’elle se retrouve en-
capsulée dans une nanoparticule, ce qui contribue à accroître sa biodisponibilité (la vitesse et l'étendue
avec lesquelles elle devient disponible à sa cible (Toutain et Bousquet-Melou, N/D)) et, par le fait même,
à accroître ses effets sur les cellules cancéreuses (Xue et coll., 2013).
Pour observer une inhibition de l'activité des cellules cancéreuses ou une élimination de celles-ci, l'équipe
de recherche de Man Tsang et de ses collaborateurs ont effectué des essais in vivo sur des rats atteints
d'un carcinome du nasopharynx en les soumettant à des doses de 5 mg/kg et de 10 mg/kg de berbérine.
Leurs résultats montrent qu'à ces deux doses, la taille de la tumeur est réduite de plus de trois fois par
rapport à la tumeur témoin, et ce, après 43 jours de traitement (Man Tsang et coll., 2013). De leur côté,
l'équipe de recherche de Xuan et de ses collaborateurs indiquent qu'une concentration in vivo de 50, 100
et de 200 mg/kg peut significativement réduire le taux de croissance des tumeurs provenant des cellules
de cancer colorectal (SW260 et LoVo) et que des concentrations in vitro de berbérine de 10, 20 et de 40
µM peut considérablement altérer la capacité de migration de ces cellules (Xuan et coll., 2015). L'équipe
a également établit que les CI50 de la berbérine pour les cellules SW260 et LoVo, soit les concentrations
qui réduisent de 50% leur croissance sont respectivement 54,41 µM et 78,66 µM (Xuan et coll., 2015).
En ce qui concerne les cellules B16F10, Jiaolin et coll. ont rapporté qu'à des doses comprises entre 1,25
et 5 µM, la berbérine permet une augmentation de la prolifération de 112 à 170% par rapport au contrôle,
mais qu'à des doses allant de 10 à 80 µM, elle l'inhibe (Jiaolin et coll., 2015). En considérant ces données,
il apparaît important d'assurer qu'une quantité convenable de berbérine pourra être encapsulée dans les
nanoparticules préparées.
Les substances qui composent les nanoparticules, tant au niveau de leur contenant que de leur contenu,
ainsi que les méthodes utilisées pour les préparer ont une influence sur le type de nanoparticule obtenu.
En effet, comme le montre la Figure
1, les nanoparticules peuvent notamment se retrouver sous forme de
nanocapsule, de nanosphère ou de nanosphère d’adsorption lorsqu’elles sont utilisées dans un contexte
biomédical.
Figure 1: Types de nanoparticule fréquemment utilisés pour la libération d'un principe actif.
(fig. adaptée de Legrand et coll., 2007)
Les nanocapsules sont des nanoparticules « réservoir », c’est-à-dire que le principe actif est dissout dans
un cœur liquide lipophile ou hydrophile (dépendamment de la solubilité du médicament) et que ce cœur
est, à son tour, contenu dans une enveloppe de polymère. Les nanosphères, elles, sont des nanoparticules
Nanosphère Nanosphère d’adsorption Nanocapsule

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matricielles, ce qui signifie que le principe actif est directement dispersé dans la matrice du polymère qui
forme la structure de la nanoparticule. Enfin, les nanosphères d’adsorption sont des nanosphères sur les-
quelles le principe actif se retrouve fixé à la surface de la structure polymérique, l’exposant ainsi davan-
tage à la dégradation (Legrand et coll., 2007).
Dans le cadre de ce rapport, deux objectifs principaux devront être atteints. D'abord, il faudra parvenir à
préparer des nanoparticules dont la structure est faite de chitosane et dont le contenu est du chlorure de
berbérine. Cet objectif implique donc notamment de connaître la solubilité de ces deux substances, de
connaître leurs interactions moléculaires et de connaître le ratio de solvant à utiliser par rapport à leurs
quantités. Ensuite, il faudra caractériser les nanoparticules préparées, et ce, à quatre niveaux :
• Le pourcentage de berbérine encapsulée : il correspond au rapport entre la masse de berbérine se
retrouvant piégée dans les nanoparticules et la masse totale de berbérine utilisée au départ.
• La cinétique de libération de la berbérine : elle correspond à la vitesse à laquelle le principe actif
(berbérine) diffuse hors des nanoparticules.
• La quantité de berbérine contenue dans une nanoparticule : elle implique la division de la quantité
de berbérine encapsulée par le nombre approximatif de nanoparticules préparées.
• La taille des nanoparticules : il s'agit de vérifier les dimensions des nanoparticules préparées.
1.4 Intérêts économiques de la réalisation d'un tel projet
Outre les intérêts au niveau de la santé qui ont été explicités au début de ce rapport, l'atteinte des objectifs
fixés pourrait s'avérer avantageuse d'un point de vue économique. En effet, le coût des agents chimiothé-
rapiques est actuellement très élevé. En guise d'exemple, pour traiter un cancer colorectal sur une période
de deux ans, les coûts sont de l'ordre de 100 000$ pour les médicaments anti-cancéreux (Pelchat, 2014).
De plus, l'augmentation annuelle des coûts des agents chimiothérapiques au Québec est la plus élevée de
tous les types de médicaments alors qu'elle se situe autour de 20% (Pelchat, 2014). Cette augmentation
est non seulement due à une hausse des coûts de production des médicaments anti-cancéreux eux-mêmes,
mais surtout à un constant accroissement du nombre de patients devant être traités (INESSS, 2012). Or,
il se trouve que, lors du traitement, les médicaments peuvent être dégradés et, ainsi, arriver aux cellules
cancéreuses en concentration si faible qu'ils perdent de leur efficacité (Heimburger, 2010). Pour obtenir
des effets satisfaisants, des doses supérieures doivent donc être administrées.
En développant un système de libération contrôlé de berbérine avec des nanoparticules dont la structure
est faites d'un polymère biodégradable, le principe actif est protégé de la dégradation jusqu'à ce qu'il
arrive à sa cible. Cela réduit ainsi les doses de médicament devant être administrées au patient, ce qui
abaisse les coûts nécessaires pour se les procurer. Ainsi, en parvenant à mettre au point un système de
production de nanoparticules ou un système d'encapsulation efficace, peu énergivore et peu dispendieux,
des économies majeures pourraient être réalisées.

7
2. MÉTHODOLOGIE

2.1 Préparation des nanoparticules
La méthode sélectionnée pour la préparation des nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine
est celle de la réticulation ionique (ionic cross-linking). Cette dernière se base sur les interactions molé-
culaires entre le chitosane et un liant, soit le tripolyphosphate de sodium (STPP) (Figure
2). Le STPP est
le composé inorganique le plus utilisé dans ce genre de procédure (Abdul Ghafoor Raja et coll., 2015) et
il est non toxique. En effet, la dose de cette substance qui, administrée en une seule fois, est létale pour
50% des sujets étudiés (DL50) (Centre canadien d'hygiène et de sécurité au travail, 2015), est de plus
3000 mg/kg. (Anachemia). La méthode expérimentale permettant de déterminer la DL50 d’une substance
consiste à administrer différentes doses de cette substance à des lots d’organismes, souvent des souris ou
des rats. Chacun des lots est mis en contact avec des doses croissantes de substance. Le but est de mettre
en évidence la dose non létale (0%) et la dose tuant tous les organismes du lot (100%). La DL50 est celle
pour laquelle la moitié des sujets décèdent (Stora, 2013).
Figure 2: Structure du tripolyphosphate de sodium (Sigma-Aldrich, Sodium tripolyphosphate).
Les forces qui unissent le STPP et le chitosane en solution sont ioniques, d'où le nom donné à la méthode.
Dans le présent cas, c'est par une variation de pH que ces forces seront induites et cela permettra ensuite
de former des nanoparticules. En effet, les groupements amines du chitosane sont des groupements ba-
siques (pKa = 6,5) pouvant se protoner en solution acide (pH < pKa). Ainsi, en solubilisant le chitosane
dans une solution d'acide acétique (éq. 1), il est possible de l'obtenir sous une forme chargée positivement
(éq. 2) (Rinaudo et coll., 1999). Cependant, pour s'assurer que la forme majoritaire qui est présente dans
la solution soit celle qui est protonée (Figure
3), la solution d'acide acétique doit avoir un pH maximal de
5,5 soit une unité de pH sous le pKa du chitosane.
CH#COOH +
H'O ⇆ CH#COO)
+ H#O*
(éq. 1)
Chitosane − NH' + H#O*
⇄ Chitosane − NH#
*
+ H'O (éq. 2)
Figure 3: Chitosane sous sa forme protonée (Bahrke et coll., 2003).
Le STPP, de son côté, s'ionise en solution afin de former de l'acide triphosphorique (P3O10
5-
) et des ions
sodium (Na+
). En mélangeant le chitosane solubilisé dans l'acide acétique avec du STPP, les groupements
amines protonés (NH3
+
) chargés positivement se lient aux atomes d'oxygène de l'acide triphosphorique
chargés négativement, ce qui forme un complexe STPP/chitosane (Figure
4) (Martins et coll., 2012).

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Figure 4: Complexe STPP/chitosane (Chih-Hui, 2009).
La préparation de nanoparticules de chitosane renfermant de la berbérine s'effectuera donc en solubilisant
d'abord le chitosane dans une solution d'acide acétique 1% (v/v) (Annexe A-1.1.1). Ensuite, le chlorure
de berbérine, préalablement solubilisé dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (Annexe A-1.1.3), sera ajouté
d'un trait à la solution de chitosane et le tout sera mélangé par agitation magnétique à 200 RPM pendant
une heure (Annexe A-1.3.1). La vitesse de l’agitation magnétique sera contrôlée à l’aide de l’affichage
numérique de la plaque agitatrice. Il est important de conserver la même plaque agitatrice entre chacune
des préparations afin de s’assurer que ce paramètre soit maintenu constant. Puis, le STPP (5 mg/mL) sera
ajouté goutte par goutte à la solution, causant ainsi la formation du complexe STPP/chitosane. Lorsqu'il
est lié au STPP, le chitosane voit sa solubilité aqueuse être réduite, car l'acide triphosphorique empêche
les groupes amines protonés d'être solvatés par les molécules d'eau. Cela cause la précipitation du com-
plexe STPP/chitosane, ce qui enferme, par le fait même, les molécules de berbérine (Chou et coll., 2013)
(Annexe A-1.3).
Puisque la solution résultante des étapes de préparation précédentes contiendra à la fois les nanoparticules
en suspension et des excès de réactifs, des étapes de purification devront être effectuées. Dans un premier
temps, les nanoparticules seront centrifugées à partir de 2000g pendant 10 minutes et le surnageant sera
retiré afin de conserver uniquement le culot (nanoparticules) (Annexe A-1.4). Celui-ci sera alors resus-
pendu dans de l'eau distillée et la solution sera centrifugée à nouveau selon les mêmes paramètres. Cette
dernière étape devra être effectuée jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 7,0. Ensuite, les nanopar-
ticules seront resuspendues dans un tampon physiologique HEPES (pKa = 7,45-7,65 à 20 ºC (Uptima))
concentré à 20 mM. Le tampon HEPES a été sélectionné puisqu’il ne porte pas de groupement phosphate
qui pourrait interagir avec les groupements amine du chitosane et qu'il permet de conserver le pH de la
solution dans l'intervalle de pH pour lequel les cellules conservent leur homéostasie. D'ailleurs, la con-
centration du tampon a été fixée à 20 mM puisqu'il s'agit de la concentration idéale pour effectuer de la
culture cellulaire (MP, 2015). Enfin, les nanoparticules seront filtrées afin de les stériliser. Cette étape
est primordiale, car les nanoparticules seront éventuellement mises en contact avec les cellules B16F10.
La présence de contaminants (bactéries, poussières, réactifs, etc.) pourrait alors altérer la justesse des
résultats obtenus pour cette phase du projet. Une unité stérile jetable de filtration permettra donc de dé-
barrasser les solutions de nanoparticules de ces possibles contaminants (Annexe A-1.4.3).
Les caractéristiques qui sont révélées lors de la caractérisation des nanoparticules dépendent directement
des choix effectués pour les préparer. Par exemple, le fait de solubiliser une quantité de berbérine plus
ou moins élevée dans la solution d'acide acétique engendrera une variation de la taille des nanoparticules,
ainsi qu'une variation du pourcentage de principe actif encapsulé. De même, le ratio de chitosane et de
STPP peut influencer la taille ainsi que l'homogénéité des nanoparticules. En effet, si la concentration de

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chitosane est élevée par rapport à la concentration de STPP, les nanoparticules n'auront pas une taille
homogène à cause d'un manque d'agent liant lors de leur formation. À l'inverse, si la concentration de
STPP est trop élevée, des agrégations se formeront, rendant les étapes de caractérisation de la taille et du
nombre de nanoparticules plus complexes (Chou et coll., 2013). Selon l'étude de Chou et coll., le ratio
chitosane/STPP idéal à utiliser afin de préparer des nanoparticules compactes et homogènes est de 5:1.
Dans le cadre du présent rapport, différentes nanoparticules seront préparées en faisant uniquement varier
la quantité de chlorure de berbérine en solution (0, 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg). Tous les autres paramètres
seront donc gardés constants au cours des différents essais.
La concentration de la solution de chitosane est l'un des paramètres devant demeurer constant. En effet,
puisque les chaînes de chitosane se retrouvent sous forme protonée dans la solution acide, elles ont ten-
dance à se repousser les unes les autres. Cependant, elles sont également capables de se lier entre elles
par des liaisons hydrogène. Cela fait en sorte que pour un certain intervalle de concentration de chitosane
(≈ 2 mg/ml), il existe un équilibre entre la répulsion et l'attirance des chaînes. Au dessus de cet intervalle,
l'attirance prédomine sur la répulsion et, lors de l'ajout du STPP, plus de chaînes se lient ensemble avec
le STPP, ce qui peut faire augmenter la taille des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). La con-
centration de la solution d'acide acétique doit également être maintenue constante entre les essais. En
effet, plus la concentration en ions CH3COO-
est élevée en solution, plus ces ions (contre-ions) vont faire
un effet d'écran sur les charges positives du chitosane. Cela diminue les répulsions électrostatiques entre
les chaînes, ce qui, pour les mêmes raisons que la concentration de chitosane, peut contribuer à augmenter
la taille des nanoparticules (Wen et coll., 2011). D'un autre côté, étant donné que les forces de répulsion
sont plus faibles, les chaînes de chitosane se compactent mieux entre elles, ce qui peut également faire
diminuer la taille des nanoparticules. Une variation de la concentration de la solution d'acide acétique
ferait donc simplement en sorte de diminuer l'homogénéité des nanoparticules préparées (Wen et coll.,
2011).Il est également important de conserver la vitesse d'agitation à une valeur constante entre les essais.
Une vitesse d'agitation trop élevée (800 RPM) peut contribuer à perturber la répulsion entre les chaînes
de chitosane et, ainsi, provoquer l'agrégation des nanoparticules. À l'opposée, une vitesse d'agitation trop
faible ne disperse pas convenablement le STPP dans la solution de chitosane et cause une diminution de
l'homogénéité des nanoparticules obtenues (Wen et coll., 2011). Pour s'assurer que les caractéristiques
des nanoparticules obtenues seront seulement fonction de la concentration de berbérine, il faut donc gar-
der ce paramètre constant. Le Tableau
1 présente un sommaire des valeurs de chacun des paramètres qui
demeureront inchangés dans les étapes de préparation.
Tableau 1: Valeurs des paramètres constants
Paramètre Valeur
[Solution chitosane] 1% (m/v)
[Solution acide acétique] 1% (v/v)
[Solution STPP] 5 mg/ml
[HEPES] 20 mM
Rythme d'ajout du STPP 53 mL/h
Vitesse d'agitation magnétique (préparation des solutions) 200 RPM
Vitesse d'agitation magnétique (préparation des nanoparticules) 550 RPM
Température ambiante Intervalle : 16 à 25 ºC
Il existe plusieurs avantages à utiliser la méthode de la réticulation ionique pour effectuer la préparation
de nanoparticules. D'abord, cette méthode permet la formation de nanosphères qui contribuent à protéger

10
le principe actif de la dégradation. Ensuite, elle n'implique pas l'usage de techniques de laboratoire avan-
cées et dispendieuses. Enfin, cette méthode peut être transposée à l'échelle industrielle s'il fallait, éven-
tuellement, effectuer une production de masse des nanoparticules. (Chou et coll., 2013)
En contrepartie, la réticulation ionique comporte également certains inconvénients. D'une part, la forma-
tion du complexe STPP/chitosane limite les tampons dans lesquels les nanoparticules peuvent être con-
servées. En effet, un tampon anionique, tel le PBS, peut interagir avec les groupes amines protonés du
chitosane et, par le fait même, déstabiliser les nanoparticules (López-León et coll., 2005). D'une seconde
part, pour obtenir des nanoparticules dont la taille moyenne est similaire entre deux essais, de nombreux
paramètres doivent être gardés constants. Non seulement faut-il mettre les mêmes concentrations de chi-
tosane et de berbérine dans la solution de départ, mais il faut également ajouter les gouttes de STPP au
même rythme et en même quantité (Chou et coll., 2013). Pour assurer le contrôle de ce dernier paramètre,
une pompe péristaltique sera employée. Également, il faut noter que, bien que la réticulation ionique ne
nécessite pas une grande quantité de solvants organiques, le DMSO est utilisé pour solubiliser la berbé-
rine. Or, ce solvant est toxique à plus de 0,1% (v/v) pour les cellules (OECD, 2012). Les nanoparticules
doivent donc être convenablement purifiées avant d'être utilisées pour la culture cellulaire. Cependant, il
est impossible de garantir qu'aucun DMSO ne restera emprisonné dans les nanoparticules même après
les étapes de purification.
Dans l'éventuel cas où des problèmes seraient rencontrés en ce qui concerne la préparation des nanopar-
ticules à l'aide de la méthode de la réticulation ionique, la micellisation inverse sera utilisée (Hasanzadeh
Kafshgari et coll., 2012).
Cette technique se base sur les tensions qui existent entre une phase organique
(apolaire) et une phase aqueuse (polaire). En effet, la solution aqueuse d'acide acétique contenant le chi-
tosane et le chlorure de berbérine sera ajoutée à un mélange de solvants organiques, ce qui provoquera
la formation de micelles aqueuses, soit de petits agrégats de molécules en suspension. Ces micelles seront
ensuite précipitées par une augmentation du pH de la solution, ce qui formera les nanoparticules (Hasan-
zadeh Kafshgari et coll., 2012). Également, si les étapes de centrifugation perturbent la morphologie des
nanoparticules ou provoquent des agrégations, la dyalise ou la filtration sur pores pourra être employée.
2.2 Caractérisation des nanoparticules
2.2.1 Pourcentage d'encapsulation
La méthode choisie pour évaluer le pourcentage d’encapsulation et la cinétique de libération du chlorure
de berbérine contenu dans les nanoparticules est la spectrofluorimétrie. Cette technique est utilisable de
par la structure même de la berbérine (Figure
5). En effet, cette molécule possède une structure composée
de nombreux cycles aromatiques et hétérocycliques, ce qui lui confère une activité fluorescente. (Gálvez
et coll., 2006) et (Gaulin, 2014).

Figure 5: Structure du chlorure de berbérine (Sigma Aldrich, Berberine chloride).

11
La fluorescence est la capacité d’une molécule d'émettre de la lumière. Elle se produit lorsqu’une molé-
cule ayant été excitée retourne à son état fondamental. Cette dernière libère alors de l’énergie sous forme
de photon, ce qui se traduit par une production de lumière. La relation de Beer-Lambert (éq. 3) met en
relation le taux de fluorescence produit dans une solution avec la concentration de l’agent fluorescent.
A7 = ϵ7×
ℓ𝓁
×
C
(éq. 3)
Où Aλ correspond à l’absorbance ou au taux de fluorescence de la solution, ελ au coefficient d’extinction
molaire, ℓ à la longueur du trajet optique dans la solution à traverser et C à la concentration de la molécule
fluorescente (Gaulin, 2014).
Le taux de fluorescence d'une solution est mesuré par un spectrofluorimètre et le fonctionnement de cet
appareil (Figure
6) se résume comme suit. D'abord, de la lumière d'une longueur d'onde précise est émise
et passe au travers de la solution contenant la molécule fluorescente afin de l'exciter (longueur d'onde
d'excitation). Une fois excitée, la molécule commence à vibrer, ce qui dissipe une partie de son excès
d'énergie et abaisse légèrement son niveau énergétique. Elle finit alors par libérer l'ensemble de son sur-
plus d'énergie sous forme de photons à 360° (longueur d'onde d'émission). Ces photons sont captés par
un détecteur placé à 90° par rapport à l'émetteur afin de limiter les interférences avec les longueurs
d'ondes émises non absorbées (transmises) (Gaulin, 2014).

Figure 6: Schéma du fonctionnement d'un spectrofluorimètre (Équipe 1B, Oral intermédiaire 3).
Afin de déterminer le pourcentage d'encapsulation de la berbérine dans les nanoparticules, il faut d'abord
récupérer le surnageant obtenu après la première centrifugation effectuée dans les étapes de préparation.
Ce surnageant, tel que mentionné précédemment, contient les molécules de berbérine qui n'ont pas été
piégées dans les nanoparticules. Ensuite, un aliquot d'un volume précis du surnageant est prélevé et est
analysé au spectrofluorimètre pour en déterminer le taux de fluorescence (Annexe A-3.1). Cette mesure
est comparée à une courbe étalon préalablement établie de solutions de chlorure de berbérine de concen-
trations connues et dont la fluorescence a été déterminée (Annexe A-2). En effet, en substituant la valeur
de la fluorescence de l'aliquot dans l'équation de cette courbe étalon, il sera possible de trouver la con-
centration de berbérine dans l'aliquot et, ensuite, de trouver la masse totale de berbérine n'ayant pas été
encapsulée. Enfin, le pourcentage d'encapsulation peut être calculé avec la formule suivante (éq. 4) :
% encapsulation berbérine = 100 x (masse ajoutée - masse non encapsulée)/masse ajoutée (éq. 4)
Paramètres opératoires de la spectrofluorimétrie (un scan 3D pourrait être nécessaire) :
• Longueur d'onde d'excitation du chlorure de berbérine: 365 nm (évalué dans le méthanol 1mg/100
mL) (Gálvez et coll., 2006).
Excitation Transmission
Photons/émis
Détecteur
Échantillon

12
• Longueurs d'onde d'émission du chlorure de berbérine: 450-550 nm (évalué dans une solution de
méthanol 1mg/100 mL) (Gálvez et coll., 2006).
• Composition du blanc: surnageant d'un essai de préparation pour lequel aucun chlorure de berbé-
rine n'aura été ajouté à la solution de chitosane.
Une méthode alternative à la spectrofluorimétrie qui pourrait être utilisée en cas de problème est la spec-
trophotométrie UV-visible. Cette méthode est semblable à la spectrofluorimétrie, mais elle implique la
mesure de l'absorption de rayons lumineux par la berbérine et non la mesure de son activité fluorescente.
L'absorption maximale du chlorure de berbérine s'effectue en émettant des longueurs d'onde de 229, 265,
347 et 425 nm (Bashmakova et coll., 2009).
Les principaux avantages de la spectrofluorimétrie sont les suivants. D'abord, elle permet normalement
une meilleure sensibilité que la spectrophotométrie. En effet, sa limite de détection est de l’ordre de 10-9
M versus 10-4
/10-5
M pour la spectrophotométrie (Gaulin, 2014). De surcroît, cette méthode est non des-
tructive puisqu’il est possible de récupérer l’échantillon si nécessaire (Gaulin, 2014). Enfin, étant donné
que peu de molécules sont fluorescentes, elle est très spécifique à la molécule d'intérêt (Gaulin, 2014).
Toutefois, la spectrofluorimétrie comporte certains désavantages. La fluorescence est influencée par le
pH, la température, le taux d'oxygène dissout ainsi que la présence d'ions métalliques en solution. Ces
paramètres doivent donc être constants pour chacune des solutions testées (Gaulin, 2014). De plus, il est
possible que certains photons émis par la substance fluorescente soient absorbés par d'autres composantes
du milieu, ce qui peut fausser l'intensité du signal sur le détecteur et, ainsi, altérer la justesse du taux de
fluorescence (Gaulin, 2014).
2.2.2 Cinétique de libération
Les étapes nécessaires à l’évaluation de la cinétique de libération ressemblent à celles pour le pourcentage
d’encapsulation étant donné qu'elles impliquent également l'utilisation de la spectrofluorimétrie. En fait,
il s'agit d'abord de faire plusieurs aliquots de 3 mL de la solution de nanoparticules en suspension dans
le tampon HEPES. Ensuite, il faut évaluer la concentration de chlorure de berbérine libérée à différents
intervalles de temps, soit directement après la préparation, après 15min, 30min, 1h, 2h, 24h, 48h, puis
après 7 jours. La raison pour laquelle la concentration est évaluée plusieurs fois dans les deux heures qui
suivent la fin de la préparation est que la majorité des médicaments (dont le chlorure de berbérine) pro-
fitent d'un effet « burst », soit une libération rapide dans les quelques heures suivant l'encapsulation (voir
la section 3. Résultats escomptés). Pour déterminer la concentration de chlorure de berbérine libérée à
un temps donné, les aliquots seront centrifugés et le surnageant sera recueilli afin d'en faire une lecture
de la fluorescence. Puis, cette lecture sera substituée dans l'équation de la courbe étalon de chlorure de
berbérine. Enfin, une courbe de la quantité de berbérine libérée en fonction du temps permettra alors de
déterminer la cinétique de libération de la berbérine. La grande sensibilité de la spectrofluorimétrie est
alors très utile, puisqu'il est probable que de très faibles quantités de berbérine se retrouvent en solution
pour certains intervalles de temps.
D'ailleurs, il est important de noter que la cinétique de libération sera évaluée dans diverses conditions
de température, soit à -80°C, à 4°C et à 37°C. Il est intéressant d'évaluer la cinétique de libération à une
température de -80°C afin de voir si les nanoparticules particules peuvent être conservées en étant con-
gelées (si la congélation ne provoque pas la diffusion de la berbérine à l'extérieur de la nanoparticule). Il
est également logique de vérifier la cinétique de libération à 37°C étant donné qu'il s'agit de la tempéra-
ture corporelle, soit celle à laquelle les nanoparticules seraient soumises dans un réel contexte biomédi-
cal.

13
Toutefois, l'évaluation de la cinétique à ces conditions de température pose certaines limites méthodolo-
giques qui pourraient altérer la représentativité des résultats obtenus. D'abord, une lecture de la fluores-
cence est effectuée 15 minutes après avoir terminé les essais de préparation. Or, pour les aliquots gardés
à -80°C, il est possible que ce temps ne permette pas une congélation complète et, ainsi, que la lecture
ne soit pas représentative de la condition de l'aliquot. Dans un même ordre d'idées, il est probable que la
température des échantillons à 4°C et à 37°C n'atteignent pas ces valeurs lorsqu'ils auront seulement été
incubés pendant 15 minutes à ces conditions. Encore une fois, cela contribuerait à diminuer la représen-
tativité des résultats.
De plus, tous les échantillons à -80°C doivent être décongelés dans un bain d'eau avant d'être centrifugés
et transférés sur la plaque de lecture du spectrofluorimètre. Or, il est probable que le chlorure de berbérine
soit libéré de la matrice de chitosane lors de cette étape, ce qui viendrait fausser la cinétique de libération.
Enfin, la centrifugation est effectuée à 4°C, ce qui implique que la température des aliquots sera légère-
ment abaissée dans le cas des échantillons conservés à 37°C.
2.2.3 Taille et nombre de nanoparticules
La microscopie électronique est utilisée comme alternative à la microscopie photonique (utilisant la lu-
mière), puisqu’elle offre une résolution bien supérieure. Un microscope photonique ne peut distinguer
un écart plus grand que 0,2 micromètres. En effet, la résolution de ce type de microscope est limitée par
la longueur d’onde de la lumière utilisée ainsi que la qualité et le nombre de lentilles dans le microscope.
Par conséquent, même si l’on augmente indéfiniment le nombre de lentilles, la résolution sera toujours
limitée à cause de la longueur d’onde de la lumière (FEI Corporation, 2010). Toutefois, les électrons ont
une longueur d’onde 100 000 fois plus courte que celle de la lumière. Par conséquent, lorsqu’on utilise
un microscope électronique muni de lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour concentrer le
rayon d’électrons (FEI Corporation, 2010), cela permet d’avoir une résolution de 0,1 nanomètre, c’est-
à-dire à l’échelle atomique plutôt que cellulaire.
Dans le cadre de ce projet, le but est d’utiliser la microscopie électronique à balayage comme méthode
de caractérisation afin de déterminer la taille, la forme, et le nombre de nanoparticules présentes dans la
solution. En effet, à cause de sa résolution allant de 0,1 nm à 100 000 nm, ce type de microscopie sert
d’excellent outil de caractérisation (FEI Corporation, 2010).
La microscopie électronique à balayage (MEB) est surtout utilisée lorsqu’on souhaite observer la surface
de l’échantillon, plutôt que de le pénétrer afin d’en examiner l’intérieur (Zaluzec, 2009). Cependant, afin
d’obtenir une bonne résolution de l’image, il est nécessaire de préparer l’échantillon. Puisque le but de
cette caractérisation est simplement d’observer la surface de l’échantillon et de compter les nanoparti-
cules, il faudra les assécher avec la méthode de la lyophilisation (voir la section 2.2.3.1), puis les insérer
dans la chambre sous vide du microscope (AMMRF, 2012).
Puisque la MEB utilise des électrons, il est nécessaire de s’assurer que l’échantillon est assez conducteur
pour produire une image de qualité en évitant l’accumulation de charges. Pour ce faire, une des méthodes
les plus utilisées dans la littérature est la métallisation (coating) de nanoparticules à l’aide d’une fine
couche de carbone, d’or ou de platine ajoutée à la surface de l’échantillon. Le choix de la métallisation
dépend de l’image qui doit être obtenue. Si le but est d’obtenir une analyse compositionnelle des nano-
particules (c’est-à-dire une analyse des éléments qui les composent), l’utilisation d’une métallisation de
carbone est préférée puisque l’or ou le platine risquent de causer une interférence. Dans le cas d’une
analyse topographique, l’utilisation d’or et de platine est préférée (AMMRF, 2012).

14
La pulvérisation cathodique est une méthode utilisée lors de la métallisation utilisant de l’or et du palla-
dium. L’échantillon est d’abord déposé sur l’anode de la chambre à vide de l’appareil, alors que la ca-
thode contient le métal qui doit être utilisé pour la métallisation. Une fois la chambre purgée avec de
l’argon, un courant électrique est appliqué, permettant ainsi aux atomes de métal d’enrober en fine couche
l’échantillon. L’échantillon est ensuite prêt à être observé via microscopie électronique (Magny, Gitzho-
fer, 2000).
Une fois l’image obtenue, il sera possible de dénombrer les nanoparticules présentes dans l’échantillon,
puis de déterminer le nombre de nanoparticules total en utilisant le rapport volume de l’échantillon/vo-
lume total. En combinant ce nombre avec la masse de berbérine encapsulée (déterminée précédemment),
la quantité moyenne de berbérine se trouvant dans une nanoparticule (Q) pourra être trouvée (éq. 5) :
Q = masse de berbérine encapsulée/nombre de nanoparticules (éq. 5)
Puis, il sera possible de déterminer la taille des nanoparticules et, ainsi, de s’assurer que leurs dimensions
soient bel et bien de l’ordre du nanomètre. La forme ainsi que l'homogénéité des nanoparticules pourront
également être observées. La microscopie électronique laisse tout de même place à une marge d’erreur.
En effet, étant donné que seul un échantillon très limité est évalué, il est probable que cet échantillon ne
soit pas représentatif de la totalité de la solution, ce qui pourrait amener à des résultats différents de ceux
escomptés. Cependant, il est possible que la taille des nanoparticules soit plus grande que prévue, à cause
d'une erreur dans l’exécution du protocole. Si tel est le cas, il est possible qu'un microscope électronique
ne soit pas nécessaire et qu'un microscope photonique dont la résolution peut aller jusqu’à 0,2 micron
puisse être utilisé (FEI Corporation, 2010).
2.2.3.1 La lyophilisation
Même si les nanoparticules ont une grande utilité dans le domaine, leur faible stabilité en milieu aqueux
forme un obstacle à leur entreposage à long terme (Abdelwahed, 2006). En effet, des phénomènes comme
l’agrégation et/ou la fusion des particules, les réactions d’hydrolyse du polymère qui forme la nanopar-
ticule, la perte de la substance active, et autres, nuisent à la stabilité des nanoparticules. Pour pallier à ce
problème, il est nécessaire d’enlever l’eau du colloïde (Abdelwahed, 2006). Le produit final est donc un
échantillon de nanoparticules lyophilisées, donc sans trace d’eau à 99%. Cela est très utile non seulement
pour la conservation à long terme, mais aussi pour la caractérisation au microscope électronique, qui
requiert un échantillon lyophilisé (Abdelwahed, 2006).
La lyophilisation de nanoparticules se fait en trois étapes. Comme le principe de lyophilisation consiste
en la sublimation de l’eau, la première étape consiste donc à congeler le colloïde (Abdelwahed, 2006).
Dans la littérature, il est dit que la température du colloïde lors de la phase de congélation peut être au-
dessus du point de transition vitreuse sans que cela n’affecte la forme et la stabilité des nanoparticules
avec un agent cryoprotecteur (Beirowski, 2011). Pour cette étape, le lyophilisateur sera réglé à -40°C
pour 240 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’un colloïde de nanoparticules de chitosane, il faut
utiliser du tréhalose à une concentration de 15% et un ratio de poids de 1:1 avec les nanoparticules. Le
tréhalose est choisi car il est le plus efficace en tant qu’agent cryoprotecteur et agent lyoprotecteur pour
les biomolécules (Abdelwahed, 2006). Il est important d’effectuer la congélation à une haute vitesse pour
ne pas modifier les caractéristiques du produit pour pouvoir les analyser au microscope électronique.
Ainsi, le refroidissement à l’azote liquide peut être la meilleure option (Abdelwahed, 2006). Il peut rester
un petit pourcentage d’eau qui n’aura pas gelé, mais elle sera traitée à l'étape du séchage secondaire.
(Abdelwahed, 2006)

15
Par la suite, il faut effectuer un séchage primaire du colloïde gelé. Pour cela, il faut mettre l’échantillon
sous vide et régler la température à -35°C. La pression devrait être d’environ 150 mTorr. Il faut ensuite
laisser la glace sublimer pour 1020 minutes (Hirsjärvi, 2009). Dans le cas d’une solution de nanoparti-
cules, il n’est pas nécessaire de mettre la température sous le point Tc (collapse temperature), donc ce
n’est pas un paramètre à vérifier avant d’effectuer les manipulations (Beirowski, 2011).
Finalement, la troisième étape est d’effectuer un séchage secondaire du colloïde partiellement lyophilisé.
À cette phase, il ne devrait rester que 7-8% d’eau dans la solution de nanoparticules. Il s’agit de l’eau qui
n’a pas gelé (Labconco, 2010). Pour cette étape, il faut mettre la température à 20°C et la pression au
minimum possible. Dans la littérature, il est dit de la mettre à 50 mTorr. Le temps du séchage secondaire
est de 180 minutes (Hirsjärvi 2009). Une fois le colloïde lyophilisé, le produit obtenu est poreux dû au
fait des molécules de glace qui se sont évaporés entre les nanoparticules. La concentration en eau du
produit final devrait être de 1% et moins (Abdelwahed, 2006).
Les nanoparticules lyophilisées peuvent ainsi être conservé à la température pièce. Toutefois, pour maxi-
miser la quantité de berbérine au sein de nos nanoparticules après 12 mois, il est préférable de garder les
nanoparticules à 4°C (Abdelwahed, 2006). Pour réhydrater les nanoparticules, il faut ajouter la même
quantité d’eau qui a été retirée au départ. Il est donc nécessaire de conserver l’eau évaporée au cours du
processus pour connaître la quantité d’eau pour réhydrater (Abdelwahed, 2006).

16
3. RÉSULTATS ESCOMPTÉS
3.1 Résultats de la préparation des nanoparticules
Lors de la préparation des nanoparticules, des « pré-résultats » permettront de déterminer si les protocoles
explicités dans ce rapport fonctionnent. D’abord, les nanoparticules de chitosane sont préparées par la
méthode de la réticulation ionique. La préparation résultera par l’obtention d’une substance laiteuse. En
effet, successivement aux diverses manipulations, des nanoparticules homogènes sont formées au mo-
ment où la solution passe de claire à opaque. Les nanoparticules ainsi formées restent en suspension dans
la solution (Zhou et coll., 2014). De même, si des agrégations se forment entre les nanoparticules, un
amas sera facilement visible dans la solution de préparation. Après centrifugation de cette solution, le
surnageant sera composé principalement d’acide acétique, mais aussi de chlorure de berbérine (exceptant
lors de la préparation de nanoparticules vides), de STPP, de chitosane et de DMSO. Le culot sera, quant
à lui, composé de nanoparticules de chitosane.
3.2 Résultats de la caractérisation des nanoparticules
Ensuite, quelques caractéristiques des nanoparticules seront déterminées, soit leur taille, leur pourcentage
d’encapsulation et leur cinétique de libération. Premièrement, la taille des nanoparticules est déterminée
par la microscopie électronique à balayage (MEB). Tel que mentionné précédemment, plusieurs para-
mètres peuvent influencer la taille des nanoparticules préparées, soit, entre autres, le pH, la température,
le rythme d’ajout du STPP, la concentration du chitosane, la concentration du STPP et la quantité ajoutée
de chlorure de berbérine. Dans ce présent laboratoire, seule la quantité de berbérine ajoutée est modifiée.
Le pH, la température et le rythme d’ajout du STPP seront constants d’un essai à l’autre. La concentration
de chitosane restera de 1 % m/v et celle de STPP restera de 5 mg/ml. Selon l’étude de Chou et coll., avec
ces dernières concentrations, la taille moyenne des nanoparticules sèches de chitosane vides serait d'en-
viron 15 nm (Figure 7). Les nanoparticules "témoin" préparées selon le protocole A-1.2 devraient donc
avoir une taille similaire à cette valeur. Il est à noter que la colonne DLS de la Figure 7, soit la diffusion
dynamique de la lumière (une technique d'analyse spectroscopique), donne la taille des nanoparticules
lorsqu'elles se trouvent en solution (Fritsch, 2015). Dans le présent rapport, l'utilisation de cette technique
n'est pas prévue. Par contre, comme l'indique la Figure 7, la taille réelle des nanoparticules est sous-
estimée lorsqu'elle est déterminée par MEB puisque lorsque les nanoparticules voyagent en solution, une
couche de liquide les recouvre et augmente le rayon de ces dernières (rayon hydrodynamique) (Fritsch,
2015).
Figure 7: Taille des nanoparticules sans berbérine (Chou et coll., 2013).
Dans les protocoles du présent rapport, un ration de chitosane/STPP de 5:1 dans la solution de préparation
sera utilisé. Tel que mentionné précédemment, il s'agit du ratio pour lequel les nanoparticules obtenues
sont le plus homogène et, surtout, pour lequel les images de la MEB sont les plus faciles à interpréter. La
Figure 8 présente le type d'image qui devrait être obtenu si des agrégats sont formés (ii) ou non (iii).

17
Figure 8: Nanoparticules ne formant pas d'agrégats (ii) formant des agrégats (iii) (Chou et coll., 2013).
Des quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et 21.0 mg de chlorure de berbérine seront ajoutées à la solution d’acide
acétique et de chitosane pour la formation de nanoparticules renfermant l’agent actif. Selon l’étude de
Chou et de ses collaborateurs, les nanoparticules obtenues auront une taille moyenne comprise approxi-
mativement entre 60 et 110 nm, tel que présenté à la Figure 9. D'ailleurs, une augmentation de la quantité
de berbérine ajoutée induit une augmentation de la taille moyenne des nanoparticules.

Deuxièmement, tel que démontré à la colonne EE de la Figure 9 (encapsulation efficiency), pour des
quantités de 4.2, 8.4, 16.8 et de 21.0 mg de chlorure de berbérine, les pourcentages d’encapsulation at-
tendus sont d'environ 10 à 11%. D'ailleurs, il est possible de constater qu'une relation de variation inverse
est présente entre la quantité de berbérine ajoutée et le pourcentage d’encapsulation (Chou et coll., 2013).

Figure 9: Propriétés des nanoparticules selon les quantités de berbérine ajoutées (Chou et coll., 2013).

En ce qui concerne la cinétique de libération de la berbérine, les résultats de la littérature indiquent que
les nanoparticules préparées avec 8.4 mg et 16.8 mg de berbérine profitent d'une libération rapide dans
les 24h suivant leur préparation (effet « burst »). En effet, dans le PBS à 37°C et à un pH de 7.4, plus de
65% de la berbérine est relâchée dans cet intervalle de temps pour les nanoparticules à 16.8 mg et 52,85%
est relâchée pour les nanoparticules à 8.4 mg (Figure
10). La libération s'est ensuite poursuivie de manière
pratiquement constante sur trois jours. Les résultats montrent également que la cinétique de libération
des nanoparticules contenant 4.2 mg de chlorure de berbérine est significativement plus lente que celle
des précédentes.

18
Figure 10: Cinétique de libération des nanoparticules contenant de la berbérine (Chou et coll., 2013).
Les résultats escomptés diffèrent légèrement des résultats présentés à la Figure
10. En effet, les courbes
de cinétique de cette figure sont évaluées alors que les nanoparticules ont été resuspendues dans le PBS.
Cependant, à cause des groupements phosphate qu'il contient, il est possible que ce tampon ait déstabilisé
les nanoparticules et qu'il ait donc provoqué une libération plus rapide de la berbérine. En se basant sur
cette hypothèse, les cinétiques de libération observées dans le cadre du présent rapport pourraient être
plus lente en raison du fait que le tampon choisi (HEPES) n'est, en théorie, pas censé interagir avec les
groupements amine des chaînes de chitosane. D'ailleurs, les données des courbes présentées ont été éva-
luées à 37°C. Les protocoles de ce rapport prévoient également de tester les cinétiques de libération dans
des conditions de température de -80°C et 4°C. À ces températures, les vitesses de libération du chlorure
de berbérine pourraient être moindres (voir nulles pour les échantillons à -80°C) en raison du fait que ces
conditions rendent le chitosane plus visqueux et plus rigide (Wen et coll., 2011).

19
4. BUDGET
Le Tableau
2 présente les produits et les équipements consommables nécessaires à la réalisation du pro-
jet. Au total, 15 essais de préparation seront réalisés (5 concentrations de chlorure de berbérine réalisées
en triplicata) et, pour certains protocoles de la caractérisation, les échantillons seront décuplés à 375 (voir
l'annexe A-3.2). Les quantités requises indiquées dans la dernière colonne représentent les quantités né-
cessaires à la réalisation de tous les essais, multipliées par un facteur 2 afin d'assurer qu'aucun produit ne
soit en manque lors des manipulations.
Tableau 2: Liste d'épicerie de l'équipe 1B et coûts afférents.

Produit Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise
Acide acétique
glacial (≥ 99,7%)
Sigma-Aldrich 320099-500ML 59,70$ (500 mL) ≈ 150 ml
Chitosane Sigma-Aldrich 448869-250G 217,50$ (250 g) ≈ 120 g
Chlorure de
berbérine
Sigma-Aldrich PHR1502-500MG 112,40$ (500 mg) ≈ 320 mg
DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML 42,80$ (50 mL) ≈ 10 ml
HEPES (1M) Sigma-Aldrich H0887-100ML 67,60$ (100 mL) ≈ 60 ml
STPP Sigma-Aldrich 238503-500G 42,90$ (500 g) ≈ 40 g
Équipement Compagnie Numéro Prix affiché Quantité requise
Tube Falcon
50 mL
Sigma-Aldrich CLS4558-25EA 51,60$ (50)
Tube à centrifuger
5 mL
Sigma-Aldrich Z688223-200EA 110,60$ (400)
Embouts P200 Sigma-Aldrich Z740030-1000EA 32,70$ (1000)
Embouts P1000 Sigma-Aldrich Z740031-1000EA 40,20$ (1000)
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK 13,30$ (280)
Plaque 96 puits Sigma-Aldrich P8991-30EA 350,50$ (30)
Nacelle de pesée Sigma-Aldrich Z154849-1PAK 27,10$ (100)
Gants nitrile Sigma-Aldrich Z677272-100EA 65,70$ (100)
Unité de filtration Sigma-Aldrich Z370541-12EA 115,00$ (12)
TOTAL: 1350$

20
5. RISQUES ET MESURES DE SÉCURITÉ
Tableau 3: Mesures de prévention selon les produits utilisés.

Les manipulations nécessaires à la préparation des nanoparticules s'effectueront sous une hotte chimique,
ce qui peut remplacer les équipements de protection respiratoires nécessaires lors de l'utilisation d'acide
acétique glacial. Des gants en viton, caoutchouc, nitrile ou néoprène, un sarrau ainsi que des lunettes
avec protection latérale sont tout de même de mise (Brenntag Canada Inc) puisque l’acide acétique glacial
est un produit très corrosif (Brenntag Canada Inc). D’autre part, il est très important de tenir toute flamme
éloignée de ce produit puisqu’il est inflammable. Les vapeurs de l’acide acétique peuvent traverser de
grandes distances jusqu’à une source d’ignition et provoquer un retour de flamme qui pourrait par la suite
provoquer une explosion. Du fait même, le contact avec un agent oxydant peut provoquer le feu (Brenn-
tag Canada Inc). Pour le DMSO, les mêmes mesures pour les cas d’incendie sont nécessaires puisque ce
produit est autant inflammable que l’acide acétique (Anechmia Canada Inc). Le port des gants n’est pas
seulement pratique puisque le produit est corrosif, mais aussi puisqu’il peut être absorbé de plusieurs
façons soit par inhalation par le contact avec les yeux et par la peau (Brenntag Canada Inc). À des con-
centrations de 50 ppm dans le corps, il devient dangereux pour la vie (Brenntag Canada Inc). S’il y a
contact avec les yeux, le rinçage immédiat à l’aide d’une douche oculaire est de mise et doit durer au
moins une minute (Brenntag Canada Inc). S’il y a contact cutané, rincer immédiatement à grande eau
pendant 15 minutes tout en retirant les vêtements ou les chaussures contaminés (Brenntag Canada Inc).
S’il y a inhalation, apporter la victime à grande air et, si elle respire difficilement, administrer de l’oxy-
gène à l’aide d’un respirateur agréé (Brenntag Canada Inc). S’il y a ingestion, il est très important de ne
pas faire vomir la victime pour ne pas irriter son œsophage (Brenntag Canada Inc). Dans tous les cas
présentés, il est important d’obtenir de l’aide médicale le plus tôt possible (Brenntag Canada Inc).
Aux risques de manipulation des produits s'ajoutent les risques de manipulation des nanoparticules. En
effet, il a été prouvé que les nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 320 nm pénètrent la peau non
pas par les pores, mais par les follicules des poils et des cheveux (Lademann and Richter, 2006). Par
contre, étant donné que le chitosane et la berbérine sont des molécules non toxiques qui, par le fait même,
détiennent une très bonne pharmacocinétique d’excrétion (Lademann and Richter, 2006), il n’y a aucun
effet direct sur la santé des chercheurs s’il y a à avoir pénétration par les follicules. Toutefois, il est
possible que, lors de la formation des nanoparticules, des solvants (p. ex. l'acide acétique), des polluants
atmosphériques ou même des microorganismes se fixent aux nanoparticules. Si tel est le cas et qu'il y a

21
pénétration, ces agents pourraient atteindre les cellules et mettre en danger la santé du ou des manipula-
teurs (Mahérou et coll., 2014). Un équipement de protection individuel (gants, sarrau et lunettes à pro-
tection latérale) est donc obligatoire, d'autant plus qu'il a été démontré que le DMSO amplifie l'effet de
pénétration des nanoparticules (Ho, 2010). Enfin, lors de l’utilisation du microscope électronique à ba-
layage, il est important de laisser tout élément liquide le plus loin possible du microscope. Cette mesure
vise à prévenir les cas d'électrocution causés par le voltage très élevé qui est utilisé par cet appareil.
Afin d'assurer la sécurité de chacun des manipulateurs dans le laboratoire, une bonne communication est
de mise. Les manipulateurs devraient réduire leurs déplacements au stricte minimum dans le laboratoire
et avertir leurs coéquipiers lors du déplacement d'un produit dangereux. Chaque membre de l'équipe a
d'ailleurs la responsabilité d'identifier convenablement chacune des solutions préparées afin d'éviter les
mélanges fautifs et dangereux de solutions. Enfin, il est important de rappeler que le travail de laboratoire
à huit manipulateurs demande une organisation rigoureuse. Ainsi, au début de chaque séance de labora-
toire, les manipulateurs de l'équipe se regrouperont afin de faire une brève planification du déroulement
de la séance. Cela a pour objectif de limiter les pertes de temps et les accidents.
En ce qui concerne l’élimination des déchets chimiques, deux cruches seront nécessaires, soit une pour
jeter les nanoparticules et le tampon HEPES et l’autre pour jeter les produits restant, soit l’acide acétique,
le DMSO, le chlorure de berbérine, le STPP et le chitosane. Le premier contenant sera acheminé vers les
produits organiques solides ayant un pH de 7 et le second sera envoyé vers les produits organiques li-
quides ayant un pH inférieur à 7.

22
6. PLANIFICATION EXPÉRIMENTALE DE LA PROCHAINE SESSION
Le Tableau 4 présente les protocoles à effectuer selon les différentes semaines de la session Hiver 2016.
Au cours des deux premières semaines, la préparation des nanoparticules sans chlorure de berbérine sera
effectuée. Ceci a pour but de vérifier si les protocoles proposés dans le présent rapport permettent ou non
la formation de nanoparticules. Dans l'éventuel cas où des nanoparticules sont bel et bien formées, ces
deux semaines serviront également à voir si des agrégations se forment lors de la préparation. Si tout se
passe comme prévu, alors, dès la troisième semaine, des nanoparticules contenant de la berbérine seront
préparées. Étant donné que la libération de la berbérine peut débuter dès la fin des étapes de préparation,
il est nécessaire d'évaluer la cinétique de libération à chaque fois que de nouvelles nanoparticules sont
préparée (0, 15min, 30min, 1h et 2h). Les autres intervalles de temps de la cinétique de libération seront
évalués le lendemain (24h), le surlendemain (48h) et la semaine suivante (7 jours) avant de commencer
tout autre protocole.
Au cours de la neuvième semaine, aucune manipulation n'a été prévue puisqu'il s'agit de la semaine de
relâche et des entrevues pour les stages. Toutefois, si besoin est, certains membres de l'équipe pourraient
venir compléter certaines manipulations. Dans un même ordre d'idées, l'échéancier prévoit deux semaines
libres avant la fin des cours afin de compiler les résultats obtenus et en faire l'analyse finale.
Tableau 4: Protocoles à effectuer selon les semaines de la session.

23
7. CONCLUSION
Dans ce rapport, la méthodologie nécessaire à la préparation et à la caractérisation des nanoparticules de
chitosane renfermant de la berbérine a été explicitée. En effet, la méthode de la réticulation ionique avec
le tripolyphosphate de sodium sera employée pour la formation des nanoparticules. Cinq essais réalisés
en triplicata seront alors effectués et seule la concentration de chlorure de berbérine ajoutée diffèrera d'un
essai à l'autre. Cela permettra d'obtenir des nanoparticules dont la taille, le pourcentage d'encapsulation
et la cinétique de libération varieront. Les nanoparticules qui présentent le meilleur profil de libération
de chlorure de berbérine et qui en contiennent une quantité suffisante pour avoir des effets sur les cellules
B16F10 (≈ 50 µM) seront reproduites et stérilisées avec une unité de filtration sous vacuum pour ensuite
les transmettre à l'équipe 1C.
Le pourcentage d'encapsulation ainsi que la cinétique de libération des nanoparticules seront déterminés
par spectrofluorimétrie. Les pourcentages d'encapsulation attendus sont de l'ordre de 10 à 11%, alors
qu'il est prévu que les cinétiques de libération de chlorure de berbérine varieront significativement d'un
essai à l'autre. Les nanoparticules préparées avec une quantité plus élevée de chlorure de berbérine (8.4
mg et 16.8 mg) relâcheraient plus rapidement le principe actif en profitant d'un effet de « burst » dans les
24 premières heures suivant leur préparation. De même, les nanoparticules maintenues à 37°C devraient
relâcher le chlorure de berbérine plus rapidement que celles incubées à 4°C et à -80°C.
En ce qui a trait à la taille des nanoparticules, elle sera évaluée par la microscopie électronique à balayage.
Les échantillons de nanoparticules devront donc préalablement être séchés par la méthode de la lyophi-
lisation. Les tailles des nanoparticules sèches attendues sont d'approximativement 60 nm à 110 nm pour
celles ayant été préparées avec du chlorure de berbérine et de l'ordre de 15 nm seulement pour celles ne
comportant pas de principe actif.
Si les étapes de préparation et de caractérisation des nanoparticules se déroulent sans problème majeur,
alors le budget nécessaire à la réalisation des expériences est d'environ 1350,00 $. Ce montant considère
des quantités de produit deux fois plus élevées que ce qui est réellement requis afin d'assurer qu'aucun
produit ne vienne à manquer lors des manipulations. D'ailleurs, dans l'éventuel cas où l'équipement serait
déjà disponible au laboratoire de l'Université, alors le montant pourrait être revu à la baisse de 800,00$.
Il est important de rappeler que les nanoparticules préparées dans le cadre de ce laboratoire ne pourront
être utilisées à des fins biomédicales étant donné qu'elles ne rempliront pas les normes très élevées de ce
standard et qu'elles ne comportent pas de ligand pouvant reconnaître directement les cellules cancéreuses
par rapport aux cellules saines. Cependant, l'exécution des protocoles du présent rapport permettra aux
membres de l'équipe d'évaluer la facilité et l'efficacité de la préparation et de la caractérisation des nano-
particules produites. Ainsi, dans un contexte d'ingénierie, ils pourront discuter de la viabilité de la mé-
thode afin qu'éventuellement, des nanoparticules puissent être produites à grande échelle et être rendues
disponibles dans les établissements de santé comme alternative à la chimiothérapie.

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2015), p. 34–43.

30
ANNEXE
A-1. Protocoles de la préparation des nanoparticules (ionic cross-linking)
Précision : Les quantités utilisées sont valables pour un seul essai de préparation des nanoparticules.
A-1.1. Préparation des solutions
A-1.1.1 Solution de chitosane 1% (m/v) dissout dans l'acide acétique 1% (v/v)
Matériel :
• Fiole jaugée 500 mL
• Bécher de 250 et de 600 mL
• Cylindre gradué de 500 mL
• Barreau magnétique
• Plaque agitatrice
• Tige magnétique
• Balance analytique
• Spatule
• Nacelle de pesée
• Chitosane (4 g)
• Acide acétique glacial (≥ 99,7%) (5 ml)
• Eau distillée (≈ 500 mL)
Procédure :
1. Sous une hotte chimique, verser environ 400 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 500 mL.
2. Pipeter 5 mL d’acide acétique glacial (≥ 99,7%) et l’ajouter dans la fiole.
3. Compléter le volume à 500 mL avec de l’eau distillée.
4. Agiter par inversion (10 fois).
5. Transférer le contenu de la fiole dans le bécher de 600 mL.
6. Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL de la solu-
tion d'acide acétique 1% (v/v).
7. Peser 4 g de chitosane et l'ajouter dans le bécher de 250 mL.
8. Rincer les parois du bécher de 250 mL avec 50 mL de solution d'acide acétique.
9. Mettre le bécher de 250 mL sur une plaque agitatrice et démarrer l'agitation à 200 RPM. Laisser
agiter pour 1 minute.
10. Verser la solution contenue dans le bécher de 250 mL dans le cylindre gradué de 500 mL.
11. Compléter le volume à 400 mL avec la solution d'acide acétique 1% (v/v).
12. Laver et rincer la verrerie.
A-1.1.2. Solution de tripolyphosphate de sodium (STPP) 5 mg/mL
Matériel :
• Fiole jaugée de 250 mL
• Bécher de 250 mL
• Spatule
• STPP (1,25 g)
Procédure :
1. Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 250 mL et y verser environ 100 mL d'eau distillée.
2. Peser 1,25 g de STPP et l'ajouter dans le bécher.
3. Rincer les parois du bécher avec 50 mL d'eau distillée.
4. Mettre le bécher sur une plaque d'agitation et laisser agiter à 200 RPM pour 1 minute.

31
5. Transvider le contenu du bécher dans la fiole jaugée de 250 mL et compléter le volume avec de
l'eau distillée.
7. Laver puis sécher la verrerie.
A-1.1.3. Solution mère de chlorure de berbérine (60 mg/ml)
Matériel :
• Pipette jaugée de 5 mL
• Tube vortex
• Support pour tubes vortex
• Vortex
• Spatule
• Diméthylsulfoxyde (DMSO) (≥99,9%) (5 mL)
• Chlorure de berbérine (300 mg)
Procédure :
1. Peser environ précisément 300 mg de chlorure de berbérine. Noter la masse obtenue.
2. Identifier un tube vortex "SM CBRB (60 mg/mL)" et y transférer le chlorure de berbérine.
3. Pipeter 5 mL de DMSO et l’ajouter dans le tube en le laissant couler sur la paroi de verre.
4. Mélanger au vortex sous agitation modérée pendant 15 secondes (5 x 3 secondes).
5. Mettre le tube dans le support à tubes vortex. Boucher le tube et le conserver à 4 ºC à l'abri de la
lumière.
A-1.1.4. Tampon HEPES (20 mM)
Matériel :
• Fiole jaugée de 100 mL
• Micropipette P1000
• Embout pour micropipette
• HEPES 1M (2 mL)
Procédure :
1. Verser environ 80 mL d’eau distillée dans la fiole jaugée de 1000 mL.
2. Pipeter 2 mL de tampon HEPES 1M et l’ajouter dans la fiole.
3. Compléter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée.
A-1.2. Préparation des nanoparticules témoins (sans chlorure de berbérine)
Matériel :
• Cylindres gradués de 200 mL, 500 mL et 1 L
• Erlenmeyers de 250 mL et de 1L
• Micropipette P1000 + embout
• Pompe péristaltique + tube
• Support universel
• Bouteille de 1000 mL
• DMSO (210 µL)
• Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL)
• Solution de STPP (5 mg/ml)

32
Procédure :
1. Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL.
2. Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y verser le contenu du cylindre gradué.
3. Pipeter 210 µL de DMSO et l'ajouter dans l'erlenmeyer de 1 L.
4. Mettre l'erlenmeyer sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation.
5. Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser
le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL.
6. Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans
l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe
à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L.
7. Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h.
8. Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe.
9. Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu-
tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h).
10. Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer
et noter le volume obtenu.
11. Laver et sécher la verrerie.
A-1.3. Préparation des nanoparticules contenant de la berbérine
A-1.3.1. Ajout de la solution de chlorure de berbérine à la solution de chitosane
Précision : Le protocole suivant considère une masse de chlorure de berbérine ajoutée de 4,2 mg.
Les volumes de la solution mère à prélever pour les autres essais se trouvent dans le
tableau A-1.
Tableau A-1 : Volume de solution mère "SM CBRB (60 mg/ml) à prélever pour chacun des essais.
Essai Volume à prélever (µL) Pipette à utiliser
4,2 mg 70 P200
8,4 mg 140 P1000
16,8 mg 280 P1000
21,0 mg 350 P1000
Matériel :
• Solution de chitosane 1% (m/v) (400 mL)
• Solution de chlorure de berbérine
• Micropipette P200/P1000 + embout
Procédure :
1. Mesurer 400 mL de la solution de chitosane 1% (m/v) avec le cylindre gradué de 500 mL.
2. Mettre le barreau magnétique dans le bécher de 600 mL et y verser la solution contenue dans le
cylindre gradué.
3. Pipeter 70 µL du tube "SM CBRB (60 mg/ml)" et l'ajouter dans le bécher de 600 mL.
4. Mettre le bécher sur la plaque agitatrice et régler la vitesse d'agitation à 200 RPM.
5. Laisser sous agitation pendant 1 heure à la température de la pièce.
6. Laver et sécher la verrerie (hormis le bécher de 600 mL).

33
A-1.3.2. Ajout de la solution de STPP à la solution de chitosane et de chlorure de berbérine
Matériel :
• Cylindres gradués de 200 mL et 1 L
• Erlenmeyers de 250 mL et de 1 L
• Pompe péristaltique + tube
• Support universel
• Bécher de 600 mL contenant la solution en A-1.3.1.
• Solution de STPP 5 mg/ml (160 mL)
Procédure :
1. Mettre le barreau magnétique dans l'erlenmeyer de 1 L et y transvider la solution de chitosane
et de chlorure de berbérine contenue dans le bécher de 600 mL.
2. Mesurer 160 mL de la solution de STPP 5 mg/ml avec le cylindre gradué de 200 mL et verser
le volume dans l'erlenmeyer de 250 mL.
3. Mettre l'erlenmeyer de 1 L sur la plaque agitatrice. Ne pas démarrer l'agitation.
4. Placer le tube dans le socle de la pompe péristaltique. Mettre la première extrémité du tube dans
l'erlenmeyer de 250 mL et fixer la seconde sur le support universel de sorte que l'embout pointe
à la verticale dans l'erlenmeyer de 1 L.
5. Régler le débit d'écoulement de la pompe à 53 ml/h.
6. Démarrer l'agitation à 550 RPM et activer la pompe.
7. Laisser le système réactionnel sous agitation à la température de la pièce jusqu'à ce que la solu-
tion de STPP 5mg/ml se soit entièrement écoulée (≈ 3 h).
8. Transvider la solution contenue dans l'erlenmeyer de 1 L dans le cylindre gradué de 1 L. Mesurer
et noter le volume obtenu.
9. Laver et sécher la verrerie.
A-1.4. Purification des nanoparticules
A-1.4.1. Séparation des nanoparticules des solvants et des excès de réactifs
Matériel :
• Centrifugeuse
• Pipette volumétrique de 50 mL
• Tubes Falcon de 50 mL
• Bouteille d'entreposage de 1000 mL
• Solution contenant les nanoparticules (A-1.2 ou A-1.3)
Procédure :
1. Avec la pipette volumétrique de 50 mL, pipeter approximativement 50 mL de la solution con-
tenant les nanoparticules et ajouter le volume dans un tube Falcon.
2. Répéter l'étape 1 pour 5 autres tubes Falcon.
3. Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer
le rotor.
4. Régler la vitesse de centrifugation à 2000g et laisser centrifuger pendant 10 minutes à 4 ºC.
5. Vérifier qu'un culot est présent au fond des tubes. Si aucun culot n'est détectable, répéter l'étape
4 en augmentant la vitesse à 3000g, 4000g et ainsi de suite.

34
6. Noter la vitesse de centrifugation nécessaire à la formation du culot ainsi que le temps total de
centrifugation.
7. Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les conserver dans une bouteille d'entre-
posage de 1000 mL identifiée "Surnageants A-1.4 (masse de berbérine) (numéro de l'échantil-
lon)".
8. Répéter les étapes 1 à 7 en disposant les volumes de solution de nanoparticules dans les mêmes
tubes Falcon et en utilisant les paramètres de centrifugation définis à l'étape 6.
A-1.4.2. Lavage des nanoparticules
Matériel :
• Centrifugeuse
• pH-mètre
• Tubes Falcon (A-1.4.1)
• Eau distillée
• Tampon HEPES 20 mM (48 mL)
Procédure :
1. Resuspendre chacun des culots des 6 tubes Falcon du protocole A-1.4.1 dans 50 mL d'eau dis-
tillée.
2. Placer les tubes Falcon dans le rotor de la centrifugeuse. Disposer les tubes de façon à équilibrer
le rotor.
3. Centrifuger selon les paramètres établis à l'étape 6 du protocole A-1.4.1.
4. Avec la pipette volumétrique, retirer les surnageants et les transvider dans un bécher de 500 mL.
5. Tester le pH de la solution et verser le contenu du bécher de 500 mL dans une bouteille d'entre-
posage de 500 mL identifiée "Surnageants A-1.4.2 (masse de chlorure de berbérine) (numéro de
l'échantillon)". Si le pH n'est pas de 7,0, répéter les étapes 1 à 5 jusqu'à ce que ce soit le cas et
passer à l'étape suivante.
6. Resuspendre chacun des culots dans 8 mL de tampon HEPES 20 mM.
7. Pipeter les solutions des 6 tubes Falcon et mettre les volumes dans un cylindre gradué de 50 mL.
Noter le volume obtenu.
8. Transvider le contenu du cylindre gradué dans un autre tube Falcon identifié "NPs HEPES
(masse de chlorure de berbérine) (numéro de l'échantillon)".
9. Effectuer le protocole A-1.4.3.Filtration des contaminants.
A-1.4.3. Filtration des contaminants
Matériel :
• Unité stérile de filtration jetable (pores : 0,2 micron)
(filtration avec vacuum)
• Tampon HEPES 20 mM (50 mL)
• Nanoparticules lavées (A-1.4.2)
•
Procédure :
1. Filtrer les nanoparticules lavées dans l'unité de filtration.
2. Rincer le filtre avec 25 mL de solution tampon HEPES 20 mM.
3. Répéter l'étape 2 avec le volume restant de solution HEPES 20 mM.
4. Fermer le contenant de façon stérile. NB: Prochains protocoles effectués de façon stérile.

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