COMISAR: risultati del progetto

COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni
innovative nei settori agro-alimentare, nutraceutico, cosmetico
e ambientale – COMISAR: RISULTATI DEL PROGETTO
Progetto finanziato con fondi POR FESR 2014/2020 - ASSE PRIORITARIO I “RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO
TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”
Alessandro Concas, Veronica Malavasi, Santina Soru, Giacomo Fais, Massimo Pisu e Giacomo Cao
Relatore: Alessandro Concas

• Prof. Ing. Giacomo Cao (Coordinatore del Progetto – UNICA/CRS4)
• Dott. Ing. Alessandro Concas (Coordinatore per il CRS4)
• Dott. Giacomo Fais (Dottorando - CINSA)
• Dott.ssa Veronica Malavasi (Ricercatrice - CINSA)
• Dott. Ing. Massimo Pisu (Capo area M&S - CRS4)
• Dott.ssa Santina Soru (Ricercatrice - CINSA)
Gruppo di lavoro

Imprese coinvolte – aggregazione per settore economico
Agricoltura e
zootecnia
32%
Dermocosmesi
10%
Materiali per l'industria
16%
Chimica ed
ecologia per
l'ambiente
16%
Biocarburanti
5%
Professionisti
privati
5%
Formazione e ricerca
11%
Nutraceutica
5%

Oggi le microalghe costituiscono una materia prima tra le più promettenti per la produzione di
diversi prodotti ad elevato valore aggiunto in un contesto di bioraffineria ed economia circolare
Quadro di contesto

Gli obiettivi generali del progetto erano :
• Capire se in Sardegna esistessero ceppi autoctoni che potessero essere sfruttati a
livello industriale per applicazioni specifiche con risvolti in diversi settori di mercato.
• Sviluppare conoscenza e mettere a punto tecniche/tecnologie e metodi su scala di
laboratorio e/o pilota per l’eventuale sfruttamento dei ceppi sardi.
• Analizzare la fattibilità tecno-economica dei processi investigati per lo sfruttamento
• Connettere la ricerca nel settore con gli stakeholders del mondo imprenditoriale Sardo
• Promuovere l’utilizzo in Sardegna delle microalghe e la nascita di un tessuto
produttivo/imprenditoriale legato alle stesse
Obiettivi generali

Obiettivi specifici e articolazione del progetto

WP-1 Coordinamento del progetto
Il coordinamento ha garantito il corretto svolgimento delle attività in coerenza a quanto
riportato nel progetto nonché le interazioni tra i vari soggetti ed il rispetto del
cronoprogramma. Sono stati inoltre redatti i report semestrali e curate le interazioni con SR.
WP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1
2 100%
3
4 100%
5 100%
6
7 38%
8 84%
90%
80%
85%
Non sono emerse particolari criticità
nell’ambito di questo WP.

WP-2 Scelta dei ceppi microalgali Sardi da investigare
Individuazione, caratterizzazione e sperimentazione di ceppi
microalgali isolati in Sardegna.
WP.2.1
Individuazione di
ceppi algali adatti
e/o adattati alla
coltivazione in
Sardegna ...
WP.2.2.
Caratterizzazione,
anche genetica e
metabolica, dei
ceppi sardi ...
WP.2.3
Definizione
preliminare dei
pathway metabolici
coinvolti...
WP.2.4
Individuare le
potenzialità di
ottimizzazione dei
ceppi, .. attraverso ..
ingegneria
metabolica e/o
genetica.

WP.2.1-a Individuazione dei ceppi
Sono stati individuati n. 5 ceppi:
• SCCA 024
• SCCA 008
• Picochlorum sp. SCCA 034
• Coccomyxa melkonianii SCCA 048
• Chlorella sorokiniana SCCA 090
Ceppi mentenuti presso la:
Sardinian Culture Collectiono of Algae
(SCCA)

WP.2.1-b Individuazione dei ceppi – Coccomyxa melkonianii
Il lavoro si è focalizzato poi in
particolare sull’alga Coccomyxa
melkonianii, campionata nelle
acque contaminate del Rio Rivi
a Montevecchio.
Per la sua capacità di
accrescersi in condizioni
estreme che si associa alla
possibilità di coltivazione in
condizioni avverse e poco
controllate come quelle degli
open ponds.
Parameter Unit Value
T °C 21,62
pH 6,85
EH mV -14,2
Cd mg/l 1,43
Co mg/l 1,75
Total Fe mg/l 226,82
Mn mg/l 81,18
Ni mg/l 2,97
Pb mg/l 0,003
Zn mg/l 956,6
SO4 mg/l 3694
Sampling site
A
B
C
D
E
G
F

WP.2.2-a Caratterizzazione dei ceppi
• Alcuni ceppi (SCCA 034 e SCCA 090) sono stati caratterizzati geneticamente, si è
scelto di sequenziare l'rRNA 18S, una molecola molto utilizzata per lo studio della
filogenesi negli eucarioti, che ci ha permesso di collocare queste microalghe verdi
rispettivamente nei generi Picochlorum e Chlorella;
• Sono state effettuate le analisi dello screening metabolomico di Coccomyxa
melkonianii SCCA 048 e di Picochlorum sp. SCCA 034. I campioni sono stati estratti
con estrazione solido/liquido con solventi polari ed essiccati sotto flusso di azoto.
Gli estratti secchi sono stati derivatizzati e successivamente è stata eseguita
l’analisi GC-MS;
• Analisi metabolomica preliminare di C. melkonianii ha mostrato la presenza di
significative quantità di myo-inositolo, composto utilizzato nella produzione di un
gran numero di integratori presenti sul mercato;

WP.2.2-b Caratterizzazione dei ceppi - procedura
Foresta di Montarbu,
Località Arquerì.
Coccomyxa
melkonianii SCCA 048
Picochlorum sp.
SCCA 034
Rio Irvi , località Montevecchio-
Ingurtosu.

WP.2.2-c Caratterizzazione dei ceppi – risultati analisi metabolomica
• Individuati 90 metaboliti appartenenti
principalmente alle classi di
carboidrati, acidi organici e acidi
grassi.
• Coccomyxa melkonianii presentava
livelli più elevati di acido malico,
treonico, glutammico e mioinositolo.
• Picochlorum sp. possedeva livelli più
elevati acidi grassi.
PCA – diversità ceppi

WP.2.2-d Caratterizzazione dei ceppi – Usi commerciali metaboliti
Coccomyxa melkonianii SCCA 048
• Acido malico
• Acido treonico
• Mioinositolo
Picochlorum sp. SCCA 034
• Acido stearico
• Acido palmitico
• Acido nonanoico
Integratori, alimenti e farmaci
Saponi, cosmetici, additivi alimentari e biodiesel
Biofuels

WP.2.2-b Caratterizzazione dei ceppi – Altre informazioni
Caratterizzazione termo-gravimetrica
Caratterizzazioni
morfologiche
C H N
C. melkonianii 46,71± 0,47 7,94 6,013±0,16

WP.2.3 Definizione pathway metabolici..
• Si è optato di puntare sugli
acidi grassi / lipidi che
presentano una più ampia
gamma di potenziali
applicazioni e valori aggiunti
potenzialmente elevati.
• Scelta basata anche sulle
caratteristiche delle aziende
coinvolte che operavano nel
settore della cosmetica,
nutraceutica e biocarburanti
• L’analisi di letteratura ha premesso di identificare i principali pathway metabolici coinvolti
nella produzione degli acidi grassi e lipidi

WP.2.4-a Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi .
Allo stato attuale la ricerca nel settore della ingegnerizzazione genetica delle microalghe al
fine dell’incremento della sintesi lipidica non ha ancora fornito risposte univoche quindi
non è possibile definire le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi mediante questi metodi.
E’ stata però effettuata una review della letteratura per capire quali sono le tecniche usate
e quelle più promettenti. Essenzialmente queste tecniche si dividono in due macro-
categorie.
Tecniche di ingegnerizzazione dei ceppi
Mutagenesi Randomizzata:
Chemicals
Radiazioni UV, g, X, fasci di
ioni
Trasformazione nucleare
per mutagenesi
inserzionale e /o
espressione di transgeni
Editing genomico
CRISPR
(poco usato per microalghe)

WP.2.4-c Potenzialità di ottimizzazione con mutagenesi.

WP.2.4-c Potenzialità di ottimizzazione con metodi molecolari.

WP.2.4-c Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi..

WP.3 Ottimizzazione dei terreni di coltura
Ottimizzazione dei terreni di coltura
O.3.1
Individuazione di
specifiche composizioni
del terreno di coltura in
grado di indirizzare il
metabolismo algale
verso la produzione di
composti ad alto valore
aggiunto.
O.3.2
Individuazione di nuovi
mezzi di coltura che
consentano la
limitazione dei costi
operativi della
coltivazione.
O.3.3
Verificare l’uso di CO2
da gas di scarico per
arricchire in carbonio il
mezzo di coltura
necessario alle alghe
per la fotosintesi.

WP.3.1 Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dalla letteratura emerge che i terreni principalmente utilizzati per coltivare alghe sono tre:
WARIS-H Bold’s Basal Medium (BBM)
BG-11
Components and Final
Concentration in Culture
Medium
Stock Solution
Addition Per
Litre of
Culture
Medium
1. HEPES (1.00 mM) 238.10 g / l dH2O 1.ml
2. KNO3 (1.00 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml
3. MgSO4 x 7 H2O (81.1 µM) 20.00 g / l dH2O 1 ml
4. (NH4)2HPO4 (0.15 mM) 20.00 g / l dH2O 1 ml
5. Ca(NO3)2 x 4 H2O (0.42 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml
6. Vitamin Solution 1 ml
Vitamin B12 (0.15 nM) 0.20 mg / l dH2O
Biotin (4.10 nM) 1.00 mg / l dH2O
Thiamine-HCl (0.30 µM) 100.00 mg / l dH2O
Niacinamide (0.80 nM) 0.10 mg / l dH2O
7. P-II Metals 1 ml
EDTA (Titriplex III) (8.06 µM) 3.00 g / l dH2O
H3BO3 (18.43 µM) 1.14 g / l dH2O
MnCl2 x 4 H2O (0.73 µM) 144.00 mg / l dH2O
ZnSO4 x 7 H2O (73.00 nM) 21.00 mg / l dH2O
CoCl2 x 6 H2O (16.80 nM) 4.00 mg / l dH2O
8. Fe-EDTA 1 ml
EDTA (Titriplex II) (17.86 µM) 5.22 g / l dH2O
FeSO4 x 7 H2O (17.90 µM) 4.98 g / l dH2O
1 N KOH 54.00 ml / l dH2O
9. Soil extract 10 ml
EDTA (Titriplex II) and FeSO4 x 7 H2O is heated for 30 min (100o
C);
KOH is added to the cooled mixture.
pH of the Vitamin Solution should be around pH 7
Dissolve EDTA and boric acid in dH2O, then add metals one after the
other.

WP.3.1-a Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
• In virtù delle concentrazioni di N molto basse il BBM era il mezzo che avrebbe garantito la
massima produzione di lipidi e acidi grassi, ossia dei prodotti utili scelti.
• Infatti la carenza di N in soluzione è in grado di innescare la sintesi lipidica a causa di uno
sbilanciamento tra i ratei di assimilazione di C e N portando ad un accumulo del primo
che viene quindi stoccato dalla cellula in forma di lipide (cfr. Figura).
Concas et al., 2016

WP.3.1-b Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dalla letteratura emerge inoltre che per le
alghe filogeneticamente vicine a quelle di
interesse il mezzo più utilizzato è il BBM.
Pertanto è stato individuato nel Bold’s Basal
Medium (BBM) il mezzo che massimizzava i
prodotti utili.

WP.3.1-c Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dopo individuazione del mezzo sono state effettuate prove sperimentali in foto-bioreattori
batch con mezzi di tipo BBM nei quali veniva variata la concentrazione d’azoto per verificare
le risposte dell’alga sarda C. melkonianii in termini di concentrazione lipidica totale.
1/5N BBM 5N
10
20
30
40
50 Contenuto lipidico
qL,(%wt)
1/5N BBM 5N
0.0
0.5
1.0
1.5
Concentrazione biomassa
Cx,(gL-1
)
1/5N BBM 5N
15
20
25
Concentrazione lipidi
CL,(gL-1
)
Risultati ottimali con BBM

WP.3.2 Terreni di coltura che minimizzano i costi
Il confronto tra le stime dei costi per la
realizzazione, inclusi costi dei reagenti e
del personale per la preparazione, per i tre
mezzi di coltura tipicamente utilizzati ha
fatto cadere la scelta sul BBM.
Qualora l’obiettivo della produzione fosse
costituito da biocarburanti o bioplastiche la
minimizzazione potrebbe essere ottenuta
su larga scala attingendo a macro- nutrienti
presenti in acque di rifiuto.
Tuttavia le aziende coinvolte nel progetto sono risultate maggiormente interessate al settore
nutraceutico/alimentare nell’ambito del quale la legge impedisce il ricorso ad acque reflue
come mezzi di coltura. Tale ipotesi pertanto non è stata perseguita in COMISAR
Primary
clarifier
Secondary
clarifier
Aeration Tank
WW
Anaerobic
digester
Photobioreactors /
Open raceways
Lipid
extraction
Recycled sludge
Sludge
Sludge
Algae
Exausted
algae
Algae
harvesting
Methane
Compost
Lipids
Water discharge
N, P, S removal
Oxygen
Carbon dioxide
Biofuels
Lubricants
Other chemicals
Seawate

WP.3.3 Verifica potenzialità di utilizzo di CO2 da gas di scarico
Da sperimentazioni effettuate con altri ceppi, nonché dalla letteratura, si è verificato che
l’utilizzo di alte concentrazioni di CO2 non determina l’incremento della produzioni di
lipidi o acidi grassi e al contrario può inibire la crescita algale.
E’ necessario inoltre precisare che nel settore nutraceutico – alimentare la legge non
consente il ricorso a gas di rifiuto e pertanto essendo questa la vocazione principale
all’utilizzo delle alghe da parte delle aziende, la sperimentazione non avrebbe avuto
senso nell’ambito del progetto.
Pertanto le verifica non è avvenuta a livello sperimentale ma solo in termini di analisi di
dati di letteratura.

WP.4 Analisi delle cinetiche di crescita
Analisi delle cinetiche di crescita in fotobioreattori e/o open ponds.
WP.4.1
Stabilire velocità di
crescita e produttività
dei ceppi scelti e
individuare gli
accorgimenti per la sua
massimizzazione.
WP.4.2
Individuare
configurazioni
reattoristiche che
massimizzano il
compromesso tra
produttività e costi di
gestione.
WP.4.3
Definire protocolli per la
coltivazione in diverse
tipologie di
fotobioreattore che
consentano di ottimizzare
l’utilizzo del flusso
luminoso, massimizzare
la captazione di CO2 e
minimizzare l’utilizzo di
nutrienti.

O.4.1 Stabilire velocità di crescita e produttività dei ceppi scelti
Attraverso l’integrazione di attività sperimentale condotta in multiwells e interpretazione
modellistica, è’ stata analizzata sulla la velocità di crescita di Coccomyxa Melkonianii al
variare di diversi parametri di processo.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Experimental data
Fitting of Michaelis Menten kinetics
m(h-1
)
CNO
-
3, (mg L-1
)
(a)
2 4 6 8 10 12
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Experimental data
Fitting kinetics model by Tan et al., 1998
m(h-1
)
pH
(b)
Effetto pH su velocità di
crescita
Effetto concentrazione azoto
su velocità di crescita

WP.4.1-a Crescita di C. melknonianii in PBRs batch con BBM
• L’analisi cinetica in
fotobioreattori batch ha poi
consentito di valutare anche
le produttività di biomassa e
lipidiche a diverse quando si
utilizzava il BBM.
• Come si vede allo stato
stazionario si otteneva una
concentrazione di biomassa
di ca 1,4 g L-1 e un
contenuto lipidico di circa
25 %wt.
• L’interruzione della crescita
è ascrivibile all’esaurimento
dell’azoto.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
Experimental data (BBM)
pH,(-)
Time (h)
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Exerimental data (BBM)
Biomassconcentration,(gL-1
)
Time (h)
(b)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
5
10
15
20
25
30
35 Experimental data BBM
Lipidcontent,(wt%)
Time (h)
(d)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Experimental data BBM
[NO-
3],(gL-1
)
Time (h)
(c)

WP.4.1-b Crescita d C. melkonianii in PBRs batch con BBM modificato
• E’ stato valutato l’effetto
della variazione della
concentrazione di azoto e si
sulle cinetiche di crescita e di
sintesi lipidica.
• Si osserva che indicendo
fenomeni di starving da
azoto il contenuto lipidico
aumenta ma la
concentrazione di biomassa
si riduce.
• La produttività lipidica
pertanto non aumenta al
diminuire dell’azoto
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8 Experimental data 5N
Experimental data 1/5N
Biomassconcentration,(gL-1
)
Time (h)
(b)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
Experimental data 5N (BBM)
Experimental data 1/5N (BBM)
pH,(-)
Time h
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
10
20
30
40
50
60
Experimental data 5N
Lipidcontent,(wt%)
Time (h)
(d)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.00
0.05
0.10
0.15
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6 Experimental data 5N
[NO-
3],(gL-1
)
Time (h)
(c)

WP.4.1-c Qualità del prodotto utile e produttività
• Il prodotto utile è stato caratterizzato in
termini di composizione in FAMEs (fatty
acids methyl esters) dei lipidi estratti
• A seconda del tipo di coltivazione (con
più o meno azoto) l’olio estratto
presenta diverse composizioni.
BBM 5N 1/5N
0
20
40
60
80
100
NFA
(C20:1)
(C20:0)
(C18:3)
(C18:2)
(C18:1)
(C18:0)
(C17:0)
(C16:1)
(C16:0)
(C8:0)
Fattyacidcompositionoflipids,(%wt)
L'acido palmitico ha proprietà emollienti e
lipogelificanti. Viene anche utilizzato come
ingrediente intermedio per l'ottenimento di numerose
materie prime cosmetiche ➔ USO IN COMSESI
Acido gamma linolenico. Della famiglia omega
6, possiede importanti proprietà antinfiammatorie
➔ USO IN NUTRACEUTICA E SETTORE FOOD
L'acido stearico viene utilizzato principalmente come
fattore di consistenza nelle formulazioni cosmetiche ➔
USO IN COMSESI
Prodotto ‘aggiustabile’ cambiando
il tipo di coltivazione

WP.4.1-d Effetto del pH sulla velocità di crescita in batch
Oltre alle prove in cui veniva variato il contenuto di azoto sono state effettuate delle
prove in cui il pH veniva stabilizzato a diversi valori.
Confermando le prove in multiwell, la velocità di crescita migliore si è osservata ad un valore
di pH vicino alla neutralità. Si osserva però che anche a pH molto bassi non si ha significativa
riduzione della velocità di crescita.

WP.4.1-e Produttività in biomassa e lipidiche a differenti pH
Anche le analisi di produttività in
biomassa e lipidiche sono
massime a valori di pH circa
neutrali.
E’ importante sottolineare però
che valori di pH molto bassi non
influenzano molto la produttività
e pertanto il ceppo si adatta a
coltivazioni in open ponds
utilizzando strategie di
coltivazione selettiva (pH bassi)
che consentono di abbattere
competitori, batteri, predatori,
rodofiti etc.

WP.4.1-f Produttività in biomassa e lipidiche a differenti pH
In questo caso oltre ai FAMEs
precedentemente discussi, in
alcune condizioni si è osservata
una buona concentrazione di
oleico e linoleico utili anche nella
prevenzione del colesterolo.
Coltivando a pH 4 si possono
ottenere anche importanti
quantità di acido eptadecenoico.
Oltre alle applicazioni sono
possibili utilizzi nel settore
bioenergetico e delle
mangimistica.

WP.4.2 Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
Sono state testate diverse tipologie reattoristiche su diversa scala
Multiwell  2 mL
Batch  2 L
Flasks  250 mL Sacchi PET  20 L
BIOCOIL  10 L
Raceway chiuso fino a  50 L

WP.4.2-a Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
• Le prime due configurazioni considerate sono utilizzabili solo su scala di laboratorio
mentre la altre si prestano anche all’utilizzo su scala industriale
• La configurazione batch trova un equivalente industriale nella cosiddetta configurazione
«bubble column» abbastanza nota.
• La configurazione BIOCOIL si è rivelata poco adatta al ceppo sardo che tendeva ad
aderire sulle pareti del COIL e a formare aggregati algali mucillaginosi limitando la
penetrazione della luce.
• La configurazione a sacchi sarebbe sicuramente la più vantaggiosa in termini di costi di
investimento e processo ma non consente un controllo adeguato della coltura e quindi
l’ottenimento di adeguate produttività.
• La configurazione ritenuta più vantaggiosa è quella del cosiddetto raceways chiuso
che unisce i bassi costi realizzativi dei gestione degli open ponds alle possibilità di
controllo e limitazione della contaminazione che caratterizzano i PBR chiusi

WP.4.2-b Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
• La configurazione ‘closed raceway’ è
stata pertanto considerato quella col
migliore bilancio costi-benefici essendo
il beneficio quantificato in termini di
produttività lipidica.
• Il ‘closed raceway’ è stata pertanto la
configurazione scelta per la
realizzazione dell’impiantino pilota.
• Esperimenti preliminari su
configurazioni non ancora ottimizzate
di ‘closed raceway’ chiuso hanno
mostrato che i risultati ottenuti su scala
di laboratorio sono opportunamente
riprodotti in questo tipo di reattore

WP.4.3 Definire protocolli per la coltivazione ottimale
Sulla base delle evidenze
sperimentali è stato
individuato un set di valori
ottimali delle variabili
operative comune a tutte
le tipologie reattoristiche
investigate che pertanto
costituisce il protocollo
comune per la coltivazione
di Coccomyxa Melkonianii
al fine dell’ottenimento
delle migliori produttività
dei prodotti utili.
Perametro operativo Valore Unità di misura
Mezzo di coltura Bold Basal Medium -
Concentrazione iniziale NaNO3 0,25 g L-1
pH 6,8 -
Flusso luminoso* 80-100 mE m
-2
s
-1
Temperatura 25-28 °C
Flusso d'aria*° 20 mL min
-1
L
-1
Concentrazione CO2 nel flusso 0,04 %vol
Tempo di scarico per batch 1 mese
Dilution rate per fed-batch*** 0,01 hr
-1
Dilution rate per fed-batch**** 0,005 hr
-1
* Da garantire su tutta la superficie del PBR
** Riferito all'unità di volume di reattore
*** Per massimizzazione produzione biomassa
**** Per massimizzazione produzione lipidi

WP.5 Sviluppo e ottimizzazione di tecnologie di estrazione dei composti
Sviluppo e ottimizzazione di tecnologie di estrazione dei composti
intracellulari ad elevato valore aggiunto.
WP.5.1
Sviluppare tecniche di
estrazione dei
composti utili dalle
alghe che consentano
di perseguire il
compromesso ottimale
tra resa di estrazione,
purezza finale del
composto e costi del
processo di estrattivo
WP.5.2
Massimizzare la
purezza del prodotto
estratto in modo da
incrementare il prezzo
di vendita
WP.5.3
Individuare solventi e/o
miscele “environmental
friendly” per limitare gli
impatti ambientali di tale
fase operativa.

WP.5.1 Tecniche di estrazione
• E’ stata sviluppata una
tecnica di estrazione
innovativa in cui
l’operazione di ‘cell
disruption’ consisteva in
una fase di congelamento
seguita da un reazione con
reattivo di Fenton.
• Questo consente sia di
rompere la parte cellulare
facilitando le fasi successive
di diffusione del solvente e
contro-diffusione del
complesso lipide-solvente

WP.5.1-a La tecnica di estrazione

WP.5.1-b La tecnica di estrazione – ottimizzazione e risultati
Effetto del congelamento
Effetto del peso di solido (rapporto S/L)
Biomassa fresca Dopo trattamento termico
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Lipidiestratti,%wt
1/1 1/2 1/4
0
5
10
15
20
25
Lipidiestratti,%wt
Peso

WP.5.1-c La tecnica di estrazione – vantaggi
• La tecnica, facilitando le fasi di estrazione
con solvente grazie all’azione di rottura
delle cellule promossa dal ciclo di
congelamento/scongelamento e dalle
reazioni radicaliche del reattivo di Fenton
consente di limitare il ricorso a solventi
(esano ed etanolo).
• Questo riduce sia i costi del processo e
limita i potenziali effetti dannosi sulla
salute e sull’ambiente.
• Una possibile trasposizione industriale
della sola fase estrattiva (escluso ciclo
termico e disruption) della tecnica è quella
riportato in Figura.
Centrifuge
PURIFIED
CRUDE OIL
Ethanol (polar)
n-hexane
(non-polar)
Microalgae
• disrupted concentrate
• dried powder
Contact time > 18 h
Supernatant
Residual biomass
n-hexane water
Bi-phasic solution
Phase
separation
Acqueous/alcoholic
phase (chlorphylls, proteins etc.)
Organic phase
(with lipids)

WP.5.2 Massimizzare la purezza del prodotto estratto
La tecnica finora esposta
consentiva di ottenere lipidi
caratterizzati da elevata purezza,
infatti dalle analisi
cromatografiche le percentuali di
estratto non ascrivibile alla classe
dei FAMEs risultava compresa tra
il 20 e lo 0.1 %wt con purezze
quindi variabili tra 80 % e 99 % se
si ragiona in termini di lipidi totali.
Non risultava pertanto necessario
purificare oltre il prodotto BBM 5N 1/5N
0
20
40
60
80
100
NFA
(C20:1)
(C20:0)
(C18:3)
(C18:2)
(C18:1)
(C18:0)
(C17:0)
(C16:1)
(C16:0)
(C8:0)
Fattyacidcompositionoflipids,(%wt)
NFA (not fatty acids) = Aliquota di olio estratto non
ascrivibile ad acidi grassi e quindi considerabili impurità

WP.5.2-a Eventuale frazionamento del prodotto
Qualora si puntasse alla vendita
non dell’olio algale ma di un acido
grasso specifico sarebbe
necessario il frazionamento
cromatografico.
Questo è stato fatto nell’ambito
del progetto a scopo analitico ed
era caratterizzato dalla seguente
procedura.
Parametro/ condizione operativa Valore/descrizione
Gascromatografo:
Trace (Thermo Finnigan, Rodano, Milano, Italia)
dotato di un rilevatore FID
Autocampionatore: AS 800 e un iniettore split-splitless
Colonna Capillare:
CP-WAX 57CB di Varian (60 m di lunghezza, 0,25 mm
di diametro e 0,25 mm di spessore del film, Varian
Inc., Palo Alto, CA) operante da 50 a 220 ° C (13
min) a 3 ° C / min
Temperatura iniettore : 200 °C
Temperatura rivelatore: 280°C
Fluido di trasporto: Elio a 120 kPa
Fluido di trasporto per replica: Azoto a 180 kPa
Metodo di analisi dei FAMES:
I composti standard in olio estratto sono stati
identificati confrontando i loro tempi di ritenzione
relativi con quelli della miscela FAME MIX C4-C24
CRM47885 utilizzata come riferimento.
Procedura analitica per l’analisi cromatografica dei FAMEs

WP.5.3 Individuare solventi e/o miscele “environmental friendly”
A tal proposito, in collaborazione
col Dipartimento di Chimica
dell’Università di Cagliari, è stata
effettuata una sperimentazione
spot di estrazione con CO2
supercritica da un campione di
biomassa algale di Chlorella.
Schema dell'impianto di estrazione da laboratorio con fluidi supercritici: B
bombola di CO2 con tubo pescante; M1 - M5 manometri; BT crio-termostato; H
pre-riscaldatore; P pompa per liquidi; RD disco di scoppio; D, polmone; Tc1 - Tc3
termocoppie; E estrattore; Vm1, Vm2 valvole micrometriche; S1, S2 separatori;
FM flussimetro; CdF misuratore di portata.
Pmax = 350 bar

WP.5.3-a Risultati ottenuti con estrazione supercirtica
Le condizioni operative sono state:
• 300 bar e 40 °C nella sezione di estrazione;
• 20 bar e 40 °C nella sezione di separazione;
• portata del CO2 pari a 1.2 kg h-1 per una durata di 4 h.
A 300 bar e 40 °C il CO2 possiede un’elevata densità e potere solvente mentre a 20 bar e
40 °C il CO2 ritorna allo stato di gas sub-critico, perde il suo potere solubilizzante e rilascia
l’estratto all’interno del separatore. Aprendo la valvola inferiore del separatore è possibile
raccogliere l’estratto finale da cui, a pressione e temperatura ambiente il CO2 gassoso si
allontana spontaneamente.
Nella prova effettuata, nell’estrattore sono stati caricati 278 g di biomassa algale. L’estratto
ottenuto, 3.4 g (resa 1.2 %, w/w) era costituito da una fase semisolida di colore verde
scuro. Il campione è stato trasferito in una boccetta e conservato in frigorifero a +4 °C.

WP.6 Modelli matematici, tools e software…
Modelli matematici, tools e software, per la
progettazione, il controllo e l’ottimizzazione dei
fotobioreattori.
WP.6.1
Interpretazione
quantitativa dei
dati sperimentali
per l’inferenza di
informazioni utili
al miglioramento
della tecnologia.
WP.6.2
Simulazione
delle
performances
del processo in
condizioni
differenti da
quelle
investigate
WP.6.3
Individuazione
delle condizioni
operative
ottimali.
WP.6.4
Ingegnerizz. e
ottimizzazione
tecno-
economica delle
unità
impiantistiche
coinvolte nel
processo.
WP.6.5
Sviluppare tools
informatici per
la simulazione,
l’ottimizzazione
e il controllo dei
fotobioreattori
investigati

WP.6.1 Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
Equation Significance
Bilancio biomassa algale in PBR batch
Dipendenza della velocità di crescita dalla
concentrazione di nitrati
Dipendenza della velocità di crescita dal
flusso luminoso
Dipendenza della velocità di crescita dal
pH.
Densità media del flusso fotonico
all’interno della coltura in fotobioreattori
cilindrici di raggio R investiti da un flusso
incidente I0.
Bilancio di massa sui nitrati in fase bluk
Bilancio di massa sulla concentrazione
lipidica

WP.6.1-a Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
Experimental data (BBM)
Interpolation for model input
pH,(-)
Time (h)
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Exerimental data (BBM)
Model fitting
Biomassconcentration,(gL
-1
)
Time (h)
(b)
1
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Experimental data BBM
Model fitting
CNO
-
3
,(gL
-1
)
Time (h)
(c)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
5
10
15
20
25
30
35 Experimental data BBM
Model fitting
Lipidcontent,qL
(wt%)
Time (h)
(d)
2
Interpretazione dei dati
sperimentali mediante ‘tuning ‘ dei
parametri modellistici (Fitting)
Parameter Value Units Reference
𝑲 𝑪 5.76 × 101
𝐿 𝑔−1
𝑚−1
Jeffryes et al. 2013
𝑰 𝟎 1.00 × 102
𝜇𝐸 𝑚−2
𝑠−1
Experimentally measured
𝑰 𝑲 2.70 × 102
𝜇𝐸 𝑚−2
𝑠−1
This work
𝒏 1.70 × 100
- Grima et al., 1994
𝒒 𝑳,𝒎𝒂𝒙 4.80 × 101
𝑤𝑡% Evaluated as reported by Concas et al., 2016
𝑹 4.00 × 10−2
𝑚 Experimentally measured
𝒀 𝑵𝑶 𝟑
− 1.95 × 10−1
- This work
𝜶 1.50 × 10−2
- This work
𝝍 5.00 × 10−2
𝑔 𝐿−1
This work
1

WP.6.1-b Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
Valutazione della capacità predittiva
del modello mediante simulazione
di nuovi dati sperimentali, ottenuti
in condizioni operative differenti,
senza aggiustare alcun parametro
del modello rispetto a quelli
riportati precedentemente.
Il modello predice bene i risultati
sperimentali e può essere utilizzato
per valutare ex-ante diverse
condizioni operative
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
Experimental data, 5N
Experimental data, 1/5N
Interpolation for model input
pH,(/)
Time h
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Model Prediction
Biomassconcentration,(gL
-1
)
Time (h)
(b)
1
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,00
0,05
0,10
0,15
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6 Experimental data 5N
Model prediction
CNO
-
3
,(gL
-1
)
Time (h)
(c)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
10
20
30
40
50
60
Model prediction
Lipidcontent,qL
(wt%)
Time (h)
(d)
2

WP.6.1-c Utilizzo del modello per valutare produttività
L’utilizzo del modello insieme ai dati sperimentali sulla composizione degli oli permette
anche di valutare le potenziali produttività dei diversi acidi grassi (ossia del prodotto da
commercializzare) ottenibili lavorando in batch
C8:0 C16:0 C16:1 C17:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
0.11
Lipidproductivity(mgL-1
h-1
)
BBM
5N
1/5N

WP.6.2 Simulazione performances del processo in condizioni differenti
Il modello in questo caso tiene conto della
dilution ratio = rapporto tra portata estratta
in continuo e volume del reattore
Sono state simulate condizioni di funzionamento del PBR in modalità fed-batch (non
utilizzata nelle prove sperimentali) in modo da avere informazioni sulle produttività
massime ottenibili a livello industriale. La modalità operativa fed-batch è infatti più adatta
all’utilizzo su scala industriale

WP.6.3 Individuazione delle condizioni operative ottimali.
Grazie al modello sono state quindi ottenute opportune mappe di ottimizzazione che
forniscono le coppie di valori di concentrazione iniziale d’azoto e il «dilution rate» che
massimizzano le produttività sia in termini di biomassa sia in termini di lipidi
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Dilution rate, D (h
-1
)
Initialnitrogenconcentration,C
0
NO3
0
2,500E-5
5,000E-5
7,500E-5
1,000E-4
Lipid productivity (mg L
-1
h
-1
)
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Biomass productivity (g L
-1
h
-1
)
Dilution rate, D (h
-1
)
IntialNO3
concentration,C
0
NO3
(gL
-1
)
0
0,001750
0,003500
0,005250
0,007000
Le zone in rosso individuano le condizioni operative ottimali per quanto concerne ‘dilution
rate’ e concentrazione d’azoto nel mezzo di coltura

WP.6.4 Ottimizzazione tecno-economica
• E’ stato sviluppato un tool, in excel, che consente di valutare le rese dei
fotobioreattori e dei sistemi di estrazione al variare di diversi parametri di
processo, comprese le caratteristiche meteo climatiche del sito di ubicazione.
• A tali valutazioni si affiancano quelle economiche di valutazione dei costi di
investimento e di gestione per gli impianti, sia quelli di coltivazioni che quelli di
estrazione.
• Lo stesso tool poi consente di avere un prima valutazione dei prezzi unitari a cui
si deve vendere il prodotto (biomassa o olio) al fine di avere un tempo di ritorno
dell’investimento pre-stabilito.
• Facendo diverse valutazioni attraverso questo tool si può ovviamente pervenire
alle configurazioni ottimali

WP.6.4-a Ottimizzazione tecno-economica sezione di coltivazione
Riassunti annuali (valori per anno)
Input Valore Unità Consumi specifici Valore Unità
Energia radiante 28974 GJ Biomassa/kWh 0.008 kg/kWh
Acqua integrazione 14965 m3 Biomassa/m3 water 0.924 kg/m3
Pioggia 2825 m3 Biomassa/kg N 9.30 kg/kg
Digestato 0 m3 Biomassa/kWhe 0.051 kg/kWh
Azoto 1488 kg Biomassa/kWhh 0.0093 kg/kWh
Elettricità 270946 kWh
CO2 (flue gas) 54783 kg
Calore 1492913 kWh
Personale (LQ) 2191 hr
Personale (HQ) 93 hr Rese specifiche Valore Unità
Ingombro 0.55 ha Biomassa algale secca 25.0 ton/ha
Carboidrati 5.1 ton/ha
Output Valore Unità Proteine 14.0 ton/ha
Biomassa 13834 kg dw Lipidi 2.5 ton/ha
Acque da integrare 14965 m3 Residuo secco 2.1 ton/ha
CO2 (rest flue gas) 27391 kg Anioni organici e ceneri 1.3 ton/ha
00
500
1'000
1'500
2'000
2'500
Gen Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Set Ott Nov Dic
Biomnassa(kg/mese)
Produzionemensiledi biomassaalgale
0,2 m/s
10 x
1x

WP.6.4-b Ottimizzazione tecno-economica sezione di coltivazione
Numero Ponds utilizzati 5
Costi d'investimento sezione coltivazione Superficie totale impianto (m2
) 6000 Costi variabili unitari (per anno)
Costo Valore Costo €/kg/anno
Costruzione pond € 13'133 Fertilizzanti (N) 0.12
Miscelatore € 23'639 Fertilizzanti (P) 0.01
Scambiatori calore € 73'543 Acqua 0.95
Sparging € 70'916 Elettricità 2.10
Illuminazione € 0 Personale LQ 1.83
Controllo processo 1 € 39'398 Personale HQ 0.17
Infrastruttura 1 € 196'990 Acque di rifiuto 0.07
Totale coltivazione € 417'618 Ammortam/manutenz/Assic/inter 8.23
Terra 0.04
Costi d'investimento sezione raccolta Totale 14
Costo Valore
Centrifuga € 151'572
Controllo processo 2 € 26'265 Risultati economici
Infrastruttura 2 € 43'505 Dati Economici Valore
Essicatore € 26'265 Ricavi totali € 261'277
Totale raccolta € 247'607 Costi totali € 186'948
Guadagni totali € 74'329
Investimento totale € 665'225 Ricavo / 100€ costi 140
Prezzo unitario di vendita (€/kg) € 18.89
Costo unitario di produzione € 13.51
Investimento totale € 776'306
Ritorno sugli investimenti (ROI) 20%
Tempo di ritorno (anni) 5.0
Inserire Tempo di ritorno desiderato (anni) 5.00
Check valore di mercato
€ 18.9
€ '0
€ 50'000
€ 100'000
€ 150'000
€ 200'000
€ 250'000
€ 300'000
€ 350'000
€ 400'000
€ 450'000
Totale coltivazione Totale raccolta
Costruzione
pond
2%
Miscelatore
3%
Scambiatori
calore
11%
Sparging
11%
Illuminazion
e
0%
Controllo
processo 1
6%
Infrastruttur
a coltivaz
30%
Centrifuga
23%
Infrastruttur
a 2
6%
Essicatore
4%
Incidenze sui costi
di investimento
Fertilizzanti
(N)
0.01
Acqua
7%
Elettricità
15%
Personale
LQ
14%
Personale
HQ
1%
Acque di
rifiuto
1%
Ammortam
/manutenz/
Assic/inter
61%
Incidenze sui
costi variabili
Calcola prezzo di vendita

WP.6.4-c Ottimizzazione tecno-economica sezione di estrazione
Biomassa algale (20 %H20) CO2+ Olio
Umida 93143 kg/y Tempo di resid. 1 h
Secca 74514 kg/y 10 L Reattore/miscelatore Capacità 20 L
Olio 25% Operation: Semi-Batch T 40 - 80 °C Sedimentatore Elettricità (tot) 547 KWh/y
8 kg/batch P 30 - 35 MPa Tempo batch 8 h
11643 batches/y Energia 74514 kWh/y
Raffreddamento H2O 708 kg/y
Capacità Compressore /condensazione
11.643 kg/h Residuo estrazione H3PO4 1.8 kg/y
56817 kg/y
Consumo energetico NaOH 5.4 kg/y
139342 kWh/y Biomassa trattata
Secca 74514.3 kg/y Separazione C6H8O7 1.0 kg/y
Efficienza di rottura CO2 olio grezzo
95% Recuperata
80% Olio raffinato
Funzionamento: Batch 18442 L/y
Olio grezzo
Integrazione CO2 17697 kg/y Acqua di rifiuto
46592 kg/y Riscaldamento 0.90 m3/y
CO2
Capacità 1 colonna
CO2 + Olio algale
Ball mill
Estrattore CO2
Evidenziati nei rettangolo rossi i flussi valorizzabili. Si tenga conto che anche la biomassa residua, in quanto
ricca di proteine, è valorizzabile nel settore della mangimistica per zootecnia o per acqua coltura.
In seguito si ipotizzerà di venderla a 0.35 €/kg

WP.6.4-d Ottimizzazione tecno-economica sezione di estrazione
Costi di investimento sezione estrazione olio Costi variabili unitari annuali (per Litro d'olio)
Costo Valore Costo Valore (€/L)
Mulino a sfere € 33'369 Biomassa algale 35.0
Estrattore CO2 supercritica € 400'429 Acqua di processo 0.0
Raffinazione olio € 48'159 Elettricità 4.2
Sistema di controllo € 48'196 Reagenti 0.0
Infrastruttura € 100'107 CO2 2.7
Totale estrazione olio € 630'259 Smaltimento acque 0.0
Personale non qualificato 8.8
Personale qualificato 0.2
Costi fissi e variabili di gestione (per anno) Ammort/Manutenz/assic/interes 3.8
Costo Valore Vendita biomassa residua -1.1
Biomassa algale € 645'507 Totale unitari 53.5
Acqua di processo € 15
Elettricità € 76'793 Risultati Economici
Reagenti € 12 Dati Economici Valore
CO2 € 49'299 Ricavi totali € 1'058'019
Smaltimento acque € 0 Costi totali (gia decurtati vendita residuo) € 986'391
Personale non qualificato € 161'424 Guadagni totali € 71'628
Personale qualificato € 3'072 Ricavo / 100€ costi 107
Ammort/Manutenz/assic/interes € 70'154 Prezzo unitario di vendita (€/L) € 57.37
Vendita resido estrazione -€ 19'886 Costo unitario di produzione € 53.49
Totale variabili € 986'391 Investimento totale € 630'259
Prezzo biomassa residua (€/kg) 0.35
€ 57.37
Confronto con valori di mercato
Mulino a sfere
5%
Estrattore CO2
supercritica
63%
Raffinazione
olio…
Sistema di
controllo
8%
Infrastruttura
16%
Incidenze sui
costi di investimento
Biomassa algale
64%
Elettricità
8%
Personale
non
qualificato…
Personale
qualificato
0%
Ammort/
Manutenz
/assic/inte
res
7%
Incidenze sui
costi di unitari
Calcolo prezzo di vendita olio

WP.6.5 Sviluppare tools informatici..
I tools informatici sono costituiti dai codici sorgente in Fortran 90 del modello e dal
file excel utilizzati per le valutazioni tecno-economiche:
Calculation of production Gen Feb
In operation? yes yes
monthly daylight energy 1271 1554
average temperature ponds 20 20
Temperature factor for growth 0,90 0,90
Glucose production (kg) 1471,6 1799,3
biomass production potential (dry weight; kg) 836,8 1023,2
biomass production realised (dry weight) 708,5 866,2
biomass production (volume) 1771,1 2165,5
lost biomass by crashes (dry weight) 128,4 157,0
lost biomass by crashes (volume) 321,0 392,5
waste water by crashes 320,9 392,3
evaporation (volume) 357,5 375,8
rainfall (volume) 300,0 270,0
heat use 307133 232498
electricity air sparging 9270 9270
electricity paddle wheel 4635 4635
electricity heat supply 927 927
Centrifuge
biomass to centrifuge (dry weight) 708,5 866,2
biomass production volume/month 1771,1 2165,5
volume of pond(s) 1500,0 1500,0
maximum algae concentration 0,400 0,400
number of days 31 28
m3 harvested each day 60,1 81,4
required maximum capacity centrifuge (m3/day) 216,7 216,7
energy use 2330 2849
harvested biomass volume 4,72 5,77
harvested biomass (dry weight) 708,5 866,2
water returning to pond 1673,7 2046,3
waste water centrifuge 186,0 227,4

WP.7 Realizzazione e messa in opera di un piccolo impianto pilota
Realizzazione e messa in opera di un piccolo impianto pilota
WP.7.1
Dimostrazione della
fattibilità del processo
su scala diversa da
quella di laboratorio
WP.7.2
Definizione delle linee
guida per la
progettazione e
realizzazione degli
impianti su scala
industriale
WP.7.3
Definizione delle
redditività del processo e
della sua sostenibilità
ambientale su diverse
scale

WP.7.1 Dimostrazione fattibilità del processo su scala pilota
Per dimostrare la fattibilità del processo su una scala superiore a quella di laboratoio è
stato realizzato un mini-impianto pilota di tipo ‘Closed Raceway’ per la coltivazione e
la valutazione delle cinetiche di crescita a parametri controllati di temperatura,
intensità luminosa e flusso di CO2.
• La tipologia reattoristica proposta unisce la semplicità realizzativa e gestionale degli
open ponds alla possibilità di ridurre la contaminazione di agenti esterni tipica dei
fotobioreattori chiusi;
• Consente di dimostrare la fattibilità del processo di coltivazione di microalghe su
una scala maggiore di quella di laboratorio;
• Permette di stabilire criteri di progettazione di impianti per aziende interessate alla
produzione di biomassa algale e/o aziende interessate ai prodotti per scopi
nutraceutici/cosmetici che quindi richiedono un tipo di coltivazione che preservi la
qualità della biomassa coltivata (coltura monospecifica).

WP.7.1-a Disegno originale e modifiche successive
Vasca in pexiglas ( 100 x 50 x 45 cm)
4 Lampade a led bianchi e blu da 11 W di tipo SMD5050, da 20/22 lumen/led montate su rack
Tubo semirigido microforato e 4 aeratori a pastiglia per la distribuzione aria e CO2
Pompa da 400 L/hr regolabile e dotata di flussimetri

WP.7.1-b Realizzazione e messa dell’ impiantino pilota
Il progetto
originale è stato
poi leggermente
modificato per
ottimizzare la
produzione.

WP.7.1-c Realizzazione e messa dell’ impiantino pilota
Crescita di Coccomyxa melkonianii nel pilota

WP.7.1-d Risultati ottenuti e confronti con dati letteratura
• Strain scelta: Coccomyxa melkonianii SCCA 048
• Terreno di coltura BBM standard,
• Parametri regolati di intensità luminosa e
temperatura costante
• Durata totale esperimento: 29 giorni
• Max concentrazione di biomassa ~1,5 g/L
Tipologia di reattore Concentrazione di
biomassa
Bibliografia
Open ponds 0.5-1 Kg/m3 Kumar et al. 2015
Photobioreactor 2–9 Kg/m3 Kumar et al. 2015
Miniraceway
(closed pond)
1.5 Kg/m3 Questo studio
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Closed raceway
Concentrazionebiomassa,gL-1
Tempo, giorni
0 5 10 15 20 25 30
0
2
4
6
8
Closed raceway
Produttivitàbiomassa,mgL-1
d-1
Tempo, giorni

WP.7.1-e Risultati ottenuti e confronti con gli esperimenti in lab
Sono ben riprodotti i dati ottenuti in laboratorio in termini di concentrazioni massime di
biomassa ottenute.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Closed raceway
Lab batch PBR
Concentrazionebiomassa,gL-1
Tempo, giorni
Con l’impianto pilota però i valori
stazionari sono ottenuti in quasi la
metà del tempo ➔ la coltura è più
veloce ➔ maggiore produttività.
Probabilmente dovuta alla
migliore distribuzione dell’aria e
della luce nel nuovo sistema

WP.7.1-f Risultati ottenuti e confronti con gli esperimenti in lab
0 10 20 30
6.8
7.2
7.6
8.0
8.4
8.8
9.2
9.6
10.0
Closed raceway
Lab batch PBR
pH,/
Tempo, giorni
pH più bassi indicano una migliore
dissoluzione della CO2 nel reattore pilota
0 10 20 30
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25 Closed raceway
Lab batch PBR
CNO3,gL-1
Tempo, giorni
In virtù delle maggiori velocità di crescita
i nitrati sono consumati più velocemente

WP.7.1-g Risultati ottenuti e confronti con gli esperimenti in lab
Evoluzione delle forme di azoto nel
raceway
Evoluzione CO2 disciolta

WP.7.1-g Risultati ottenuti e confronti con gli esperimenti in lab
Le prove su scala pilota hanno pertanto riprodotto i risultati ottenuti su scala di
laboratorio con l’unica (positiva) differenza consistente in una maggior velocità di
crescita e quindi maggior produttività del processo quando le variabili operative erano
impostate a certi valori ottimali.
L’analisi lipidomica dimostra poi
che approssimativamente
vengono sintetizzati gli stessi
acidi grassi rilevati durante le
prove effettuate su
fotobioreattori batch operanti su
scala più piccola (2 L).

WP.7.2 Definizione linee guida per progettazione e realizzazione ..
Le linee guida per la progettazione e realizzazione di impianti su scal industriale sono
riassumibili nelle seguenti:
• Adottare configurazione di tipo closed raceway (utilizzando proporzioni
dimensionali analoghe a quelle considerate nel presente progetto e gli stessi
materiali costruttivi)
• Garantire le variabili operative utilizzate nell’ambito della sperimentazione pilota
(Intensità luminosa, mezzo di coltura, flusso d’aria e concentrazione di CO2)
• Utilizzare un modo operativo di tipo fed-batch per garantire una produzione
continua.
• Nel caso invece di operatività di tipo batch effettuare la raccolta della biomassa
dopo almeno 30 giorni.

WP.7.3 Definizione delle redditività e sostenibilità ambientale
Per l’analisi della redditività è stata calcolata l’efficienza fotosintetica di C. melkonianii
nel raceway mediante la seguente equazione (Grima et al., 1997).
( )0
0.0471
1 exp
b b
e b
D C Q
I
K C L
L


 
= 
  − −    
Introducendo questi dati nel tool di calcolo in excel sviluppato e inserendo i dati
climatici di Cagliari si possono fare le seguenti valutazioni economiche
C H N
C. melkonianii 46,71± 0,47 7,94 6,013±0,16
Composizione biomassa
wt%
(g /gbiomassa)
Metedo
Proteine 0,38 Calcolato
Lipidi 0,25 Misurato
Caqrboidrati 0,37 Calcolato come complementoa 1
Parametro Simbolo Valore U.M Rif.
Dilution rate D 0,005 1/hr condizione operativa
Conc biomassa Cb 1200 g/m3
condizione operativa
Luce incidente I0 432000 mE / m2
/ hr Valore prossimo a quello medio outodoor
Spessore lama d'acqua L 0,08 m condizione operativa
Calore id combustione biomassa Qb 21000 J/g Grima et al., 1997
Conversione E to J alf 0,4950495 J/mE Gonçalves dos Reis and Ribeiros, 2019
Coefficiente assorbimento ka 0,18 m2
/g Grima et al., 1997
Dall’analisi CHN è stato poi ottenuta la seguente analisi elementare.

WP.7.3-a Definizione delle redditività impianto 1ha Coccomyxa
Solo
coltivazione e
vendita
biomassa in
raceways da
1000 m2
ciascuno con
prezzo
unitario di
sola
costruzione
del raceways
stimato in
20000
€/raceway
(solo scaffold)
Numero Ponds utilizzati 10
Costi d'investimento sezione coltivazione Superficie totale impianto (m2
) 12000 Costi fissi e variabili di gestione unitari (per anno)
Costo Valore Costo €/kg/anno
Costruzione pond € 126'191 Fertilizzanti (N) 0.07
Miscelatore € 56'786 Fertilizzanti (P) 0.01
Scambiatori calore € 176'668 Acqua 0.33
Sparging € 170'358 Elettricità 1.00
Illuminazione € 0 Personale LQ 0.73
Controllo processo 1 € 126'191 Personale HQ 0.07
Infrastruttura 1 € 473'218 Acque di rifiuto 0.02
Piping, fitting, pumps € 190'000 Ammortam/manutenz/Assic/inter 3.84
Totale coltivazione € 1'319'414 Terra 0.02
Totale 6
Costi d'investimento sezione raccolta
Costo Valore
Centrifuga € 362'390 Risultati economici
Controllo processo 2 € 63'096 Dati Economici Valore
Infrastruttura 2 € 104'509 Ricavi totali € 645'507
Essicatore € 63'096 Costi totali € 453'100
Piping, fitting, pumps € 78'568 Guadagni totali € 192'407
Totale raccolta € 671'658 Ricavo / 100€ costi 142
Prezzo unitario di vendita (€/kg) € 8.66
Costo unitario di produzione € 6.08
Investimento totale € 1'991'072
€ 8.7
€ 0
€ 200'000
€ 400'000
€ 600'000
€ 800'000
€ 1'000'000
€ 1'200'000
€ 1'400'000
Totale coltivazione Totale raccolta
Costruzione pond
6%
Miscelatore
3%
Scambiatori calore
9%
Sparging
9%
Illuminazione
0%
Controllo processo 1
6%
Infrastruttura
coltivaz…Centrifuga
18%
Infrastruttura 2
5%
Essicatore
3%
Tubazioni,
fittings, 14%
Incidenze sui costi
di investimento
Fertilizzanti (N)
0.01
Acqua
6%
Elettricità
16%
Personale LQ
12%
Personale HQ
1%Acque di rifiuto
Ammortam
/manutenz/
Assic/inter
63%
Incidenze sui
costi variabili
Calcola prezzo di vendita

WP.7.3-b Definizione redditività impianto di estrazione (cf. WP6-4)
Estrazione con CO2 supercritica.
Per avere un tempo di ritorno
dell’investimento di 5 anni è
necessario vendere l’olio a 58 €/Litro
Costi di investimento sezione estrazione olio Costi variabili unitari annuali (per Litro d'olio)
Costo Valore Costo Valore (€/L)
Mulino a sfere € 33'369 Biomassa algale 35.0
Estrattore CO2 supercritica € 400'429 Acqua di processo 0.0
Raffinazione olio € 48'159 Elettricità 4.2
Sistema di controllo € 48'196 Reagenti 0.0
Infrastruttura € 100'107 CO2 2.7
Totale estrazione olio € 630'259 Smaltimento acque 0.0
Personale non qualificato 8.8
Personale qualificato 0.2
Costi fissi e variabili di gestione (per anno) Ammort/Manutenz/assic/interes 3.8
Costo Valore Vendita biomassa residua -1.1
Biomassa algale € 645'507 Totale unitari 53.5
Acqua di processo € 15
Elettricità € 76'793 Risultati Economici
Reagenti € 12 Dati Economici Valore
CO2 € 49'299 Ricavi totali € 1'058'019
Smaltimento acque € 0 Costi totali (gia decurtati vendita residuo) € 986'391
Personale non qualificato € 161'424 Guadagni totali € 71'628
Personale qualificato € 3'072 Ricavo / 100€ costi 107
Ammort/Manutenz/assic/interes € 70'154 Prezzo unitario di vendita (€/L) € 57.37
Vendita resido estrazione -€ 19'886 Costo unitario di produzione € 53.49
Totale variabili € 986'391 Investimento totale € 630'259
Prezzo biomassa residua (€/kg) 0.35
€ 57.37
Mulino a sfere
5%
Estrattore CO2
supercritica
63%
Raffinazione
olio…
Sistema di
controllo
8%
Infrastruttura
16%
Incidenze sui
costi di investimento
Biomassa algale
64%
Elettricità
8%
Personale
non
qualificato…
Personale
qualificato
0%
Ammort/
Manutenz
/assic/inte
res
7%
Incidenze sui
costi di unitari
Calcolo prezzo di vendita olio

WP.7.3-c Articolazione costi ricavi
Sezione estrazione e vendita olioSezione produzione e vendita biomassa

WP.7.3-d Competitività del prodotto
L’utilizzo del tool sviluppato consente di confrontare i prezzi di vendita calcolati con
quelli attualmente proposti sul mercato

WP.7.3-e Competitività del prodotto
I prezzi di vendita ottenuti sono abbastanza compatibili con quelli attuali di mercato (in bulk) .

WP.7.3-f Competitività del prodotto
Il prodotto sarebbe quindi venduto (in bulk) a prezzi simili a quelli di mercato e
quindi il processo potrebbe essere competitivo soprattutto se collocato nel mercato
della cosmetica e delle nutraceutica
D’altra parte è necessario tenere conto che:
• Le valutazioni effettuate sono semplificate e probabilmente i costi di produzione
della biomassa potrebbero essere più alti incidendo sui prezzi a cui è necessario
vendere.
• Potrebbero allungarsi i tempi di payback
• La possibilità di collocazione sul mercato è poi fortemente legata a operazioni di
marketing e alla creazione del brand ‘microalghe sarde’

WP.7.3-g Sostenibilità ambientale del processo di coltivazione
Consumi idrici e acque di rifiuto
Voce
Consumi
(m3
)
Integrazione acqua evaporata 15563
Intergazioni acuq biomassa 422
Integrazoni acque esauste 6643
Integrazioni perdite durante crash 5590
Totale consumo idrico 28219
Consumi energetici annuali (macro-voci)
Consumi idrici annuali (macro-voci)
Rifiuti prodotti annualmente (macro-voci)
Rifiuti prodotti
Voce
Quantità
(ton)
CO2 scaricata -147538
Acque di rifiuto 6643
Biomassa persa durante crash 14
La sezione di coltivazione è sicuramente
una sezione a bassissimo impatto
ambientale con l’importante vantaggio
diportare alla captazione di importanti
quantitativi di CO2
Tipo energia Unità dell'impianto
Consumi
(kWh)
Elettrica Raceway (sparging) 222480
Calore Raceway (riscaldamento) 3267852
Elettrica Raceway (riscaldamento) 22248
Elettrica Centrifuga 83657
Elettrica Miscelatore (Eventuale) 111240
Calore Essicatore 253383
Totale Impianto coltivazione 3960859

WP.7.3-g Sostenibilità ambientale del processo di estrazione
• La sezione di estrazione è anch’essa a
basso impatto. Anche in questo la CO2 è
utilizzata piuttosto che prodotta.
• Con il sistema SFE si evita la produzione
di pericolosi solventi organici esausti.
• I consumi idrici sono limitati.
• Tra i rifiuti il residuo di estrazione è
potenzialmente recuperabile
Tipo energia Unità dell'impianto
Consumi
(kWh)
Elettrica Mulino a sfere 139342
Elettrica Estrattore 74514
Elettrica Reattore/miscelatore 547
Totale Impianto estrazione 214403
Voce
Consumi
(m3
)
Integrazione perdite a corpo 1
Totale 1
Voce
Quantità
(ton)
CO2 scaricata -46592
Acque di rifiuto 1
Residuo di estrazione* 56817
* potenzialmente valorizzabile
Consumi energetici annuali (macro-voci) Consumi idrici annuali (macro-voci)
Rifiuti prodotti annualmente (macro-voci)

WP.8-a Disseminazione e divulgazione dei risultati: pubblicazioni
• Articoli pubblicati su riviste internazionali ‘peer reviewed’:
1. V. Malavasi, S. Soru and G. Cao, " Extremophile Microalgae: the potential for biotechnological
application," Journal of Phycology, Vol. 56, 559-573, (2020)
2. S. Soru, V. Malavasi, A. Concas, P. Caboni, and G. Cao, "A novel investigation of the growth and lipid
production of the extremophile microalga Coccomyxa melkonianii SCCA 048 under the effect of
different cultivation conditions: Experiments and modeling," Chemical Engineering Journal, vol. 377,
120589, (2019,) https://doi.org/10.1016/j.cej.2018.12.049
3. A. Concas, G.A. Lutzu, M. Pisu and G. Cao,” Biofuel production from Pseudochloris wilhelmii cultivated
in sea-wastewatermixtures: modeling and experiments, Journal of Environmental Chemical
Engineering, vol.7 (5), 103301 (2019), https://doi.org/10.1016/j.jece.2019.103301.
4. S. Soru, V. Malavasi, A. Concas, P. Caboni, and G. Cao, “Effect of nitrogen starvation and pH variation
on the cultivation of the extremophile microalga Coccomyxa melkonianii SCCA 048.,” Chemical
Engineering Transactions., vol. 76, In press, (2019).
5. S. Soru, V. Malavasi, P. Caboni, A. Concas, and G. Cao, “Behavior of the extremophile green alga
Coccomyxa melkonianii SCCA 048 in terms of lipids production and morphology at different pH
values,” Extremophiles, vol. 23, no. 1, pp. 79–89, (2019).

WP.8-a Disseminazione e divulgazione dei risultati: presentazioni
• Poster e presentazioni a convegni:
1. Veronica Malavasi, Santina Soru, Alessandro Concas, Massimo Pisu, Giacomo Fais, Pierluigi Caboni, Giacomo Cao -
Extremophile microalgae for biotechnological applications. 92° Congresso SIBS – Sassari, 2-4 dicembre 2019.
2. Soru S, Malavasi V, Concas A, Caboni P, and Cao G, “Effect of nitrogen starvation and pH variation on the cultivation
of the extremophile microalga Coccomyxa melkonianii SCCA 048.,” ICheaP-14, 14th International Conference on
Chemical & Process Engineering, Bologna, 26-29 Maggio 2019.
3. Soru S, Malavasi V, Concas A, Caboni P, and Cao G, “Growth and lipid production of the novel extremophile microalga
Coccomyxa melkonianii SCCA 048 under nitrogen starvation conditions: experiments and modeling,” ISCRE-25, 25th
International Conference on Chemical Reaction Engineering, Firenze, 20-23 Maggio 2018.
4. Malavasi V, Soru S, Concas A, Montinaro S, Afzal M, Pisu M and Cao G, “Preliminary Study of the Effect of Iron on the
Growth and Morphology of Extremophile Green Alga Coccomyxa melkonianii SCCA 048” Gruppo Algologia, Società
Botanica Italiana, Catania, 16-17 Novembre 2018.
5. Veronica Malavasi, Santina Soru, Alessandro Concas, Massimo Pisu, Giacomo Fais, Giacomo Cao (2019) - Cultivation
of Sardinian microalgal strains for innovative applications in the agri-food, nutraceutical, cosmetic and environmental
sectors: The COMISAR PROJECT. Posters, European Journal of Phycology, 54:sup1, 1-109,
DOI:10.1080/09670262.2019.1626628
6. Giacomo Fais, Veronica Malavasi, Pierluigi Caboni, Santina Soru, Giacomo Cao (2019) - A preliminary comparative
study of metabolic and morphological changes of two unicellular trebouxiophyceae (Chlorophyta) from SCCA.
Posters, European Journal of Phycology, 54:sup1, 1-109,

Interazioni principali con le aziende - a
Azienda: Milis Energy
Core business: Produzione microalghe
Interessi nel settore alghe: Produzione di esopolisaccaridi,
saccaridi, polisaccaridi e acidi grassi polinsaturi da microalghe
e collocazione nel mercato nutraceutico
Ceppi potenzialmente interessati: Chlorella, Scenedesmus,
Spirulina, etc.
Potenzialità di utilizzo dei ceppi sardi (generi): Buone per
Coccomyxa melkonianii in relazione alla composizione dei suoi
lipidi e in particolare all’elevato contenuto di linolenico (omega
6) che li rende collocabili sul mercato come integratore.
Aspetti limitatamente critici: Bassa velocità di crescita del
ceppo. Nel caso di applicazioni in nutraceutica tale aspetto
però diventa marginale

Interazioni principali con le aziende - d
Azienda: Juveniis
Core business: Cosmesi
Interessi nel settore alghe: Impiegare specifici b-glucani
presenti nelle alghe (Paramylon) per la produzione di prodotti
cosmetici in virtu' dei loro effetti positivi su dermatiti atopiche.
Interesse per la “brand reputation” di un prodotto cosmetico
completamente sardo.
Ceppi potenzialmente interessati (generi): Scenedesmus,
Picochlorum, Coccomyxa, Chlorella e Desmodesmus
Potenzialità di utilizzo dei ceppi sardi: Buone potenzialità del
genere Coccomyxa fanno pensare a buone potenzialità del
ceppo Coccomyxa melkonianii sardo.
Aspetti critici: Non rilevati

Interazioni principali con le aziende - b
Azienda: Alga Bio
Core business: Produzione microalghe
Interessi nel settore alghe: Produzione di biocarburanti da
microalghe
Ceppi potenzialmente interessati: Chlorella, Scenedesmus e
Dunaliella, etc.
Potenzialità di utilizzo dei ceppi sardi (generi): Buone in
relazione alla composizione in acidi grassi anche se andrebbe
ridotto il tenore di insaturi mediante tecniche di
Hydrocarcking per utilizzo come biocarburante-
Aspetti critici: Bassa velocità di crescita del ceppo. In questo
caso tale aspetto può diventare rilevante vista la necessità di
produzioni massive

Interazioni principali con le aziende - c
Azienda: Agricola biologica Orrù ed eredi
Core business: Agricoltura biologica
Interessi nel settore alghe: Impiegare le microalghe come
fertilizzanti e/o antiparassitari nella coltivazione biologica degli
orticoli.
Ceppi potenzialmente interessati: Chrysanthemum spp.,
Gracilaria coronopifolia, Microcystis aeruginosa
Potenzialità di utilizzo dei ceppi sardi: Non verificata ma
l’impresa è interessata a valutare le potenziale di alghe
autoctone cresciute «in situ» per utilizzi anche diversi da quelli
sopra descritti.

Interazioni principali con le aziende - d
Azienda: HerbSardinia
Core business: Cosmesi
Interessi nel settore alghe: screening e la successiva verifica della
possibilità di utilizzare le microalghe per la produzione di
cosmetici biologici additivati con filtri UV, antiossidanti o altri
composti di origine algale che possano dare valore aggiunto al
prodotto di base.
Ceppi potenzialmente interessati (generi): Chlorella vulgaris,
Nostoc, Spirulina platensis, Haematococcus, Dunaliella
Potenzialità di utilizzo dei ceppi sardi: L'alga verde SCCA 024
sarebbe il miglior candidato per proseguire le analisi sui
polisaccaridi utilizzabili nel settore della cosmetica.

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