DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LOS PRINCIPALES HEMOPARASITOS DEL GANADO BOVINO

 Afectan gravemente la producción
y el bienestar animal ocasionando
importantes pérdidas económicas
en países tropicales y
subtropicales, aunque se están
convirtiendo en un grave y
creciente problema en muchos
países de Europa.
 Son un grupo de patógenos (protozoarios y ricketssias)
transmitidos por diferentes especies de garrapatas y otros
insectos que causan enfermedades que tienen características
clínicas similares.
 La Piroplasmosis y la Anaplasmosis
son las de mayor relevancia, estando
su prevalencia y distribución geográfica
asociadas con los vectores
www.aleidavillaespinosa.com

Piroplasmida
Theileria sp.
Th annulata
Th parva
Babesiasp.
B. bigemina
B. bovis
B. major
B. divergens
Anaplasmas Anaplasmasp.
A. marginale
A. centrale
A. phagocytophylum

 DIAGNÓSTICO DE RUTINA
HEMATOLOGÍA.
FROTIS SANGUÍNEO
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
ELISA
IFAT.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
PCR, NESTED-PCR,
PCR EN TIEMPO REAL (qPCR)
RLB

 Introducir la PCR en tiempo Real en el
diagnóstico de rutina de Theileria. annulata,
Theileria parva, Babesia bigemina, Babesia
bovis, Anaplasma marginale, Anaplasma
centrale y Anaplasma phagocitophylum en
un formato multiparamétrico para el
ganado bovino.

PUREZA
CUANTIFICACIÓN
110 casos con sospecha de hemoparásitos procedentes de España y
Portugal n= 280 muestras:
248 sangres en EDTA
23 sueros
9 tejidos
Kit Genómico mini LGD 500 LabTurbo” y el equipo automático de
extracción “LabTurbo 36 Compact System C3620” (Taigen Bioscience
Corporation).
CONTROL DE
CALIDAD
Quawell UV Q500 Software 4.0

qPCR cuantitativa
Diluciones seriadas (105
a 100
) de plásmidos específicos.
Cut Off ≤ 45
qPCR PARA
HEMOPARÁSITOS
CADA MUESTRA DE DNA FUE INVESTIGADA
PARA 6 HEMOPARÁSITOS (1rxn/patógeno),
UTILIZANDO OLIGOS/SONDAS ESPECÍFICAS
BAJO EL MISMO PROTOCOLO TERMICO
PERFIL
MULTIPARAMÉTRICO
MiniOpticon System
Bio Rad, Software
CFX manager 2.0).
1 2 3 4
95.0 C
10:00
95.0 C
00:10
60.0 C
01:00
GO
TO
2
49 X

Resultados de la qPCR
 El 52% (57/110) de los casos evaluados resultaron
positivos para hemoparásitos:
En sangre 51%
En suero 17%
En tejidos (hÍgado y bazo) 22%
0
50
100
150
200
250
300
Sangre Suero Hig/Bazo
248
23
9
51 %
17 % 22 %
muestras
Tipo de muestra
Total muestras
% Positivos

Resultados de la qPCR
Coexistencia de hemoparásitos: 37% (21/57) de los casos
positivos
- A. marginale y Th. annulata 21% (12/52)
- Th. annulata, A.marginale y B. bigemina en un 14% (8/57).
Th. annulata 37% (34/93)
A. marginale 29% (26/90)
B. bigemina 17% (15/90)
B. bovis 2.2% (2/90)
Th parva 0% (0/55)
A. phagocytophylum 0% (0/54)
A. centrale 0% (0/67)

 El 91.2% (101/110) de los casos fueron
remitidos de 21 provincias españolas,
principalmente de las C.A. de Andalucía y
Cataluña.
Comunidad Total Nro. casos
Autonoma casos Positivos
Cadiz 12 9
Cordoba 8 3
Huelva 1 1
Jaen 2 0
Sevilla 5 3
28 16
Huesca 2 1
Teruel 1 1
Zaragoza 2 1
5 3
Cantabria Santander 10 2
Castilla
La Mancha
Avila 2 2
Burgos 1 1
Palencia 2 0
5 3
Barcelona 18 10
Lleida 4 0
Tarragona 1 0
23 10
Extemadura Caceres 4 3
A. Coruña 2 2
Lugo 6 2
8 4
Madrid Madrid 8 1
Valenciana Castellon 4 3
6 5
Andalucia
Aragón
Castilla y Leon
Cataluña
Galicia
Provincia
Ciudad Real

 El 91.2% (101/110) de los casos fueron
remitidos de 21 provincias españolas,
principalmente de las C.A. de Andalucía y
Cataluña.

La linearidad de los ensayos nos permitió
identificar hasta 2x108
copias de
equivalente genómico de cada
hemoparásito/ml de sangre, suero o
gramo de tejido con una eficiencia ≥ 95%.
CUANTIFICACIÓN
El valor umbral (Cq) de los Controles
Positivos oscilo entre 20-35 ciclos,
mientras que las muestras presentaron
Cq entre 15 y 40 ciclos.
El limite inferior de detección
de hemoparásitos en los
ensayos (6 qPCR) varió entre
2x100
a 2x101
copias/5µl

 Para introducir la qPCR en el diagnostico de rutina en el sector veterinario
es de vital importancia contar con un precio accesible para el ganadero, la
agrupación de las muestras y la conformación de paneles como el
realizado en el presente estudio permite racionalizar recursos logrando
un diagnóstico rápido y económico de estos patógenos.
 Una ventaja adicional del formato multiparamétrico es que no existe
competencia de múltiples cebadores por el ADN de la muestra por lo que
no ocurre agotamiento del ADN muestra sobretodo en las infecciones
mixtas.
 El formato multiparamétrico permite la inclusión de otros ensayos de
qPCR para completar el diagnóstico diferencial de hemoparásitos
utilizando simultáneamente las mismas condiciones y ciclos térmicos. Ej.
Leptospira patógenas, BLV, Erlichia ruminatum, trypanosoma spp. entre
otras.

 Hemos introducido la PCR en tiempo real en el diagnostico rutinario de las
principales enfermedades causadas por hemoparásitos en el ganado bovino
mediante el uso del formato multiparamétrico.
 El alto porcentaje de caso positivos encontrados en el presente estudio en
España y Portugal confirman la presencia de varias especies de
hemoparásitos y la importancia de estas enfermedades en Europa.
 La PCR cuantitativa es una excelente herramienta para monitorear el
tratamiento de estas hemoparasitosis y para la titulación de las cepas
empleadas en la elaboración de vacunas.

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