Laporan praktikum ini membahas tentang isolasi DNA kasar dari buah mangga dengan menggunakan beberapa jenis deterjen. Deterjen yang memberikan hasil terbaik adalah rinso cair karena mangga memiliki kadar air sedang. Namun DNA tidak terpisah dan tetap berada di permukaan larutan. Jenis deterjen dan kandungan kimianya mempengaruhi proses isolasi DNA.
1. LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ ISOLASI DNA KASAR ”
Disusun Oleh:
Nama
: Muhammad Guruh Arif Zulfahmi
NIM
: 105040201111091
Kelompok
: Senin, 06.00
Asisten
: Khoirun Enisa
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
FAKULTAS PERTANIAN
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
MALANG
2012
2. I.
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung
membentuk nukleotida. Materi genetik yang terdapat di dalam
inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga.
Bukan tangga yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi
tangga dihubungkan oleh anak tangga. Pada DNA, hanya ada
dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh
pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa
Guanin-Citosin (G-C). Molekul DNA ini terikat membentuk
kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan
kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan
nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix),
dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling
berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen
dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain
dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam
setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru
kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai
pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein
dan proses metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi
dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.
1.2 Tujuan
Untuk pengetahui pengertian isolasi DNA
Untuk mengetahui macam-macam metode isolasi DNA
Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA
Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA
1.3 Manfaat
Praktikum isolasi DNA dilakukan, bermanfaat untuk
mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap
kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi.
3. II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Isolasi DNA
isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya
strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam
bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih.
(Aditia, 2010)
DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for
subsequent molecular or forensic analysis.
(Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan
DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)
(Doyle, 1987)
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakanmetodeisolasiKarsinahet
al.(2002)
yang
telahdimodifikasidenganlangkahkerjasebagaiberikut :
1. Tabungeppendorfdiisidengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB
(CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M danTris-HCl 0,1M)
dan 5 μlmercaptoethanol.
2. DaunBawangmerahdisterilisasidenganalkoholdanditimbang
0,5 gram.
3. 0,5
gram
daunbawangmerahdigerusdalam
mortar
denganbantuan nitrogen cairdanditambah PVP 10 mg,
kemudiandimasukkankedalameppendorf yang sudahberisi 1
ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 μlmercaptoethanol.
Setelahituekstrakdaundivortexhinggahomogen.
4. Ekstrakdaundiinkubasidalamsuhu
65oC
selama
30
menitsambildibolak-baliktiap
10
menit.
Kemudianditambahkan
700
μlChloroform
:Isoamylalcohol/CHISAM
(24:1).
Setelahituekstrakdaundivortexhinggahomogen.
5. Ekstrakdaunkemudiandisentrifugasiselama
10
menitdengankecepatan
6000
rpm.
Supernatandimasukkantabungbarudanditambahkan 700 μl
CHISAM.
4. 6. Larutansupernatandan CHISAM disentrifugasiselama 10
menitdengankecepatan
6000
rpm.
Faseatasdimasukkantabungbaruditambah isopropanol dingin.
Larutantersebutdibolak-balikperlahanhinggatampakbenangbenangputihdalamlarutan. Larutandiinkubasidalam freezer
selama 30 menit.
7. Setelahdiinkubasi,
larutandisentrifugasiselama
10
menitdengankecepatan
6000
rpm
setelahitusupernatandibuangdenganhati-hati agar endapan
DNA pellet tidakikutterbuang.
8. Endapan
DNA
pellet
dicucidengan
buffer
pencucidengancaramenambahkan
200
μl
buffer
pencucikedalam
tube,
kemudiancairan
di
buang.
Pencucianinidilakukan 2 kali. Setelahituendapan DNA pellet
dikeringanginkan.
9. Endapan DNA kemudiandiresuspensidengan 500 μl buffer
TE laluditambah 1 μlRNAse.
10. Larutan DNA yang sudahditambahRNAsediinkubasiselama
30 menitpadaSuhu 37ºC.
11. Setelahlarutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol
absolute dingindandibolak-balikperlahan.
12. Larutan DNA laludiinkubasipada freezer selama 30 menit.
13. Setelahinkubasiselesaikemudiandisentrifugasiselama
10
menitpadakecepatan
6000
rpm.
Peletkemudiandikeringanginkan.
14. Peletdiresuspensidengan
100
μl
buffer
TE
dandisimpandalamlemaries.
(Zubaidah, 2004)
2.3 Tahap Isolasi DNA
a. Perusakandindingsel
Penggunaan nitrogen cair
b. Lisismembransel
Penggunaandetergenkationik (CTAB)
c. Pemurnian
Beberapakontaminansepertisenyawasekunder
polisakarida, RNA,dan protein
d. Presipitasi
(fenol)
5. Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol dingin
(Puspita, 2010)
2.4 ManfaatIsolasi DNA
Menghancurkan membran sel.
Disosiasi protein sel.
Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya.
(Puspita, 2010)
6. III. METODOLOGI
3.1 Alat, bahan, danfungsi
3.1.1 Alat
Pisau
: untukmembelahmangga
Mortal danpastle : untukmenghaluskanmangga
Botol
: untuktempatmencampurkanbahan
Sendok
: untukmengaduklarutan
Tabungreaksi : untuktempatlarutan
Timbangananalitik : untukmenimbangbahan
Saringan : untukmenyaringbahan
Gelasukur : untukmengukur volume larutan
3.1.2 Bahan
Buahmangga : sebagaispesimen yang akandiamati
Detergen : untukmelisissel
Garam
: untukmemisahkan air dengankotoran
Etanol 96% :untukmempresipitasi
Aquades :untukmencucipermukaanalat
3.2 Cara Kerja
Mangga
Kupas
Ambil 5 gram
Gerus dengan mortal dan pestele
Mangga halus
+2.5 gr garam
+2.5 gram detergen
+aqudest 50ml
Diaduk
Biarkan 10 menit
saring
7. ambil 5ml
+6ml etanol
Amati supernatan
3.3 AnalisaPerlakuan
Pada isolasi DNA kasar bahan yang digunakan adalah
buah manga.pertama-tama mangga dikupas setelah itu ambil 5
gram gerus dengan mortal damn pestle.setelah mendapatkan
mangga halus.lalu tambahkan 2,5 gr garamdan tambahkan 2,5
gram detergen.detergen yang diambil adalah rinso cair,rinso
bubuk,bukrim,lalu setelah itu diaduk dan biarkan selama 10
menit setelah itu saring dan ambil 5 ml dan tambahkan 6 ml
etanol lalu amati supermatan.
8. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
No.
Dokumentasi
Keterangan
1.
Mangga dihaluskan
dengan
menggunakan
mortar dan pestle
2.
Mangga yang
sudah dihaluskan
dimasukkan ke
dalam botol
9. 3.
Ditambah garam,
rinso cair,
aquadesh, diaduk
dan didiamkan
selama 10 menit
4.
Ditambah garam,
rinso bubuk,
aquadesh, diaduk
dan didiamkan
selama 10 menit
5.
Ditambah garam,
bu cream,
aquadesh, diaduk
dan didiamkan
selama 10 menit
11. 9.
Ditambah etanol
96% sebanyak 6 ml
10.
Hasil
4.2 Pembahasan
Dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui bahwa
jenis detergen berpenuh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis
detergen tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap
jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda.dari hasil
praktikum dapat diketahui bahwa detergen yang paling
berpengaruh dalam proses isolasi DNA kasar pada buah mangga
ini adalah rinso cair, karena mangga mempunyai kandungan
kadar air yang sedang. Namun pada praktikum kali ini, DNA
12. tidak mau muncul keatas dan tetap berada pada permukaan
larutan. Perbedaan detergen dalam mempengaruhi tingkat
pemunculan DNA dalam isolasi DNA ini disebabkan karena
kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat
yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium
EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang
biasanya ada dalam detergen.
Menurut Jamilah (2005) diantara detergen bubuk
menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen
krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan
warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA
yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat.
Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang
menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya
prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan
viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat
kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan
konsentrasi air tinggi.
Sedangkan untuk mengetahui fungsi detergen dalam isolasi
DNA ini menurut Jamilah (2005) dalam proses isolasi DNA,
detergen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel
secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu
merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang
dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan
kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang
berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk
mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta
menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA
(ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa
"memakan" DNA).
Kecepatan pembentukan DNA juga dipengaruhi oleh jenis
detergen yang digunakan, dalam hal ini detergen cair memiliki
kualitas paling baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak
buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa
kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang
lebih tinggi daripada detergen jenis lain.
13. V. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dalam praktikum tentang isolasi DNA kasar pada buah
mangga ini dapat disimpulkan bahwa detergen cair memiliki
kualitas paling baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak
buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa
kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang
lebih tinggi daripada detergen jenis lain.
5.2 Saran
Untuk praktikum:
Semoga UAPnya nanti, soal yang diberikan mudah dan
dapat terjawab dengan baik dan benar
Untuk asisten :
Semoga lebih baik dari sebelumnya.
14. DAFTAR PUSTAKA
Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/2010/03/i
solasiDNA.html Diakses 01Desember 2012
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure
for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19:
11-15.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan
Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr)
Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai
Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak
diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang
Puspita, 2010.TahapanIsolasi DNA. http://puspitt .multiply.com
/journal/item/14/ISOLASI-DNA? &show_interstitia l=1
&u=%2Fjournal%2Fitem. Diaksestanggal 01 Desemb- er
2012
Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru
pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans.
Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir,
Bandung, Juni 2004.
