clase No 3 y 4 Cromosomas y tecnica FISH

1. CROMOSOMAS
Dra. Fedra N. Prieto M.

2. Un examen de la historia de la Genética y su relación
con los fenómenos sociales, aporta varias lecciones,
entre ellas que los planteamientos de los genetistas son
rápidamente asimilados por el público y pueden ser
trasladados a la vida social, a veces con consecuencias
negativas; sobre todo si los genetistas, atrapados por el
entusiasmo de los éxitos de la Biología Molecular,
contribuyen a dar un punto de vista no balanceado
sobre el rol de la Genética en la aparición de las
enfermedades. Los genetistas tienen un papel clave y
una responsabilidad, en asegurar que los progresos en
este campo, no sean usados para hacer daño, sino para
el beneficio del hombre.

3. CROMOSOMAS
• Son estructuras filamentosas situadas en el
nucleo celular.
• Etimologia chroma= color y Soma=cuerpo.
• Estan constituidos por genes
• Son los vehiculos que facilitan la reproduccion
y la perpetuacion de la especie.

4. ESTRUCTURA

5. CLASIFICACION
• MORFOLOGIA
• Metacentrico
• Submetacentrico
• Acrocentrico (satelites nucleolo)
• LONGITUD
• Grandes
• Medianos
• Pequenos

6. CLASIFICACION
• Por la posición del centromero

7. SUBDIVISION
• A=1–3
• B=4–5
• C = 6 – 12 + X
• D = 13 – 15
• E = 16 – 18
• F = 19 – 20
• G = 21 – 22 + Y

8. NUMERO
• El numero de cromosomas se relaciona con la
especie. Asi por ejemplo:
• Gusano intestinal = 2 cromosomas
• Crustaceo = 1500 – 1600 cromosomas
• Mono Titi = 46 cromosomas
• Chimpance = 48 cromosomas
• Hombre = 46 cromosomas

9. NUMERO
• 46 Cromosomas en su totalidad
• 44 cromosomas autologos
• 2 cromosomas sexuales
• Los Gametos (0vulo y espermatozoide)
• 23 Cromosomas en su totalidad
• 22 cromosomas autologos
• 1 cromosoma sexual
• En 1956 Tijo y Levan determinaron 46
cromosomas el numero de cromosomas para la
especie humana.

10. CROMOSOMAS SEXUALES
• Son los cromosomas X - Y que juegan un
papel crucial en la determinacion del sexo.
• CROMOSOMA X.- Se lo denomino asi por la
incertidumbre respecto a su funcion.
• CROMOSOMA Y.- Es mucho mas pequeno que
el cromosoma X y contiene unicamente unos
cuantos genes de importancia funcional

11. METODOS PARA EL ANALISIS
CROMOSOMICO
• Objetivo: Se busca analizar la constitucion
cromosomica de un individuo.
• CARIOTIPO.- fotomicrografia de los
cromosomas individualizados y ordenados en
forma estandarizada. O tambien constitucion
cromosomica de un individuo.

12. CARIOTIPO

13. PREPARACION DE LOS CROMOSOMAS
• Se requieren celulas vivas nucleadas, por lo
general se utilizan linfocitos de circulacion
periferica. O bien celulas de la piel, medula
osea, vellosidades corionicas o amniocitos.

14. PREPARACION DE CROMOSOMAS
1.- Aislar linfocitos.
2.- Cultivo con fitohemaglutinina. 37⁰C 3 dias.
3.- Colchicina.
4.- Solucion Hipotonica.
5.- Montar, fijar y secar.

15. BANDEO CROMOSOMICO
• Bandeo G.- Giemsa.

16. BANDEO CROMOSOMICO
- Bandeo Q – Quinacrina

17. BANDEO CROMOSOMICO
- Bandeo R – Reverso

18. BANDEO CROMOSOMICO
- Bandeo C – Heterocromatina Centromerica

19. BANDEO CROMOSOMICO
- Bandeo de alta resolución

20. ANALISIS CROMOSOMICO
- Contar numero de cromosomas en un numero
especifico de células (extensiones de
metafases). 10 a 15 células.
- Análisis del Patrón de Bandas de cada
cromosoma individual en esas células.3 a 5
extensiones de metafases.
- Mosaicismos, 30 o mas células.

21. ANALISIS CROMOSOMICO
- IDIOGRAMA = cariotipo ideal estilizado .
Muestra los cromosomas ordenados en pares
y en orden descendente según el tamaño.

22. IDIOGRAMA

23. CITOGENETICA MOLECULAR
• HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
Fluorescent in situ hibridization
Es una técnica de marcaje de cromosomas
mediante la cual los cromosomas son
hibridados con sondas que emiten
fluorescencia y que gracias a ello permiten la
visualización, distinción y estudio de los
cromosomas así como de las anomalías que
puedan presentar.

24. FISH
• Usa segmentos de una única hebra de ADN que
son tintados, o etiquetados, con una sustancia
fluorescente que puede ligarse a un cromosoma
específico; estos segmentos de ADN son
llamados sondas.
• Los cromosomas que son usualmente utilizados
con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo,
como son posibles marcados adicionales del
cromosoma, otros cromosomas pueden ser
visualizados con esta técnica.

25. FISH

26. TECNICA FISH
• Desnaturalización del DNA para separar la doble
hélice.
• Añadir la sonda de interés (fragmento de ADN
marcado fluorescentemente).
• Las sondas hibridan a regiones específicas.
• Se tiñen los núcleos con un color de contraste
inespecífico.
• Las sondas de DNA pueden marcarse con
moléculas fluorescentes (método directo) o no
fluorescentes que se detectan con anticuerpos
fluorescentes (método indirecto).

27. TECNICA FISH

28. TECNICA FISH
• La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en
metafase o en interfase.
• En metafase se utiliza para detectar microdeleciones
específicas, translocaciones o para identificar material
extra de origen desconocido. Los tipos de sondas
usadas son cósmidos, satélites alfas y sondas
completas (painting probes).
• En interfase se emplea sobre todo para la detección de
aneuploidias o grandes delecciones, duplicaciones o
translocaciones en células fetales o tumorales.

29. FISH EN METAFASE
• Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con
fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de
microdeleciones.
• Las sondas satélites están formadas por secuencias
altamente repetidas que se encuentran cerca de lo
centrómeros. En la mayoría de los casos son
específicas de cada cromosoma. Se usan para
determinar aneuploidias o para identificar el origen de
cromosomas marcadores.
• Las sondas completas consisten en la suma de varias
sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma

30. OTRAS TECNICAS FISH
• FISH múltiple, FISH en hebra y FISH inverso.
• FISH multiple (pintar cromosomas) Mezcla de
sondas de diferentes partes de un
cromosoma, el cromosoma entero fluorece.
• FISH inverso (pintar a la inversa) Este tipo
tendrá la peculiaridad de ser el ADN problema
el que se marque.

31. FISH MULTIPLE

32. CITOMETRIA DE FLUJO
• La citometría de flujo es una técnica de
análisis celular que implica medir las
características de dispersión de luz y
fluorescencia que poseen las células conforme
se las hace pasar a través de un rayo de luz.

33. CITOMETRIA DE FLUJO
• Debido a las diferencias en tamaño y
composición del ADN, los cromosomas se unen a
diversas cantidades de colorantes fluorescentes,
algunas de las cuales son especificas para
secuencias G-C (gen rico) y otras para secuencias
A-T (gen pobre).
• Esta propiedad de uniones diferentes permite
que los cromosomas se puedan separar mediante
el proceso de citometria de flujo o separacion
celular activada por fluorescencia (FACS)

34. FACS
• Fluorescent activated cell sorting
• Consiste en teñir los cromosomas metafasicos
con un colorante de ADN fluorescente.
• Los cromosomas se proyectan como finas gotas a
través de un haz de laser que los excitan hasta
que fluorescen.
• Un fotomultiplicador mide la intensidad de la
fluorescencia y un ordenador analiza los
resultados, elaborando un histograma con el
tamaño cromosómico: CARIOTIPO DE FLUJO

35. CITOMETRIA DE FLUJO