2. Bioanalytik
Inhaltsverzeichnis:
GebrÀuchliche Einheiten.................................................................................................................................... 4
SubstanzquantitÀt, Volumen und Konzentration......................................................................................................4
VerdĂŒnnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])...............................................................................5
Kohlenhydrate..................................................................................................................................................... 7
Die glycosidische Bindung.......................................................................................................................................... 7
AminosÀuren und Proteïne................................................................................................................................. 9
Biuret-Test..................................................................................................................................................................... 9
Molekularmasse von ProteĂŻnen................................................................................................................................. 10
Denaturierung von ProteĂŻnen.................................................................................................................................... 11
Lipide.................................................................................................................................................................. 13
Biologische Membranen................................................................................................................................... 15
Die 3 hÀufigsten Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15
NucleïnsÀuren.................................................................................................................................................... 17
pH-Messung und Titration................................................................................................................................ 19
Berechnung des pH-Wertes einer schwachen SĂ€ure.............................................................................................19
Berechnung des pH-Wertes von Wasser..................................................................................................................19
Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen SÀure mit einer starken Base..........20
Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung......................................................................................................20
Ampholyte.................................................................................................................................................................... 21
Elektrophorese.................................................................................................................................................. 23
Chromatographie............................................................................................................................................... 25
Ionenaustauscher-Chromatographie........................................................................................................................ 25
Gelchromatographie................................................................................................................................................... 26
Photometrie........................................................................................................................................................ 29
Gesetz von Lambert-Beer.......................................................................................................................................... 29
Konzentrationsbestimmung durch Photometrie.....................................................................................................29
Photometer und Spektralphotometer....................................................................................................................... 29
Enzymreaktionen............................................................................................................................................... 31
AbhÀngigkeit der EnzymaktivitÀt von der Substratkonzentration........................................................................31
Molekularbiologische Methoden...................................................................................................................... 39
Plasmide...................................................................................................................................................................... 39
Restriktionsenzyme.................................................................................................................................................... 39
Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................................................... 40
Restriktionskarten...................................................................................................................................................... 40
Restriktionsfragment-LĂ€ngenpolymorphismus......................................................................................................41
Polymerase-Kettenreaktion....................................................................................................................................... 41
Radioaktive Isotope........................................................................................................................................... 43
In Biochemie und Medizin gebrÀuchliche Radioisotope:......................................................................................43
Bestimmung der RadioaktivitÀt................................................................................................................................ 43
Messmethodik............................................................................................................................................................. 43
âBackground".............................................................................................................................................................. 44
ZĂ€hlstatistik................................................................................................................................................................. 44
Einheiten der RadioaktivitÀt...................................................................................................................................... 44
Spezifische RadioaktivitÀt.......................................................................................................................................... 44
Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie..........................................................44
Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen.....................................................................45
Immunologische Bestimmungsmethoden...................................................................................................... 47
Anhang............................................................................................................................................................... 49
Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 49
Formelverzeichnis...................................................................................................................................................... 50
Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 51
Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 52
-3-
3. Bioanalytik
GebrÀuchliche Einheiten
SubstanzquantitÀt, Volumen und Konzentration
SubstanzquantitÀt wird als Masse oder als Stoffmenge angegeben.
Masse: Basiseinheit ist das Kilogramm. GebrÀuchliche Einheiten sind:
kg = 10 3 [g]
g = 10 0 [g]
mg ( milli) = 10 â3 [g]
ÎŒg ( mikro ) = 10 â6 [g]
ng (nano ) = 10 â9 [g]
pg (pico ) = 10 â12 [g]
fg ( femto ) = 10 â15 [g]
Gleichung 1 : GebrÀuchliche Masse-Einheiten
Stoffmenge: Basiseinheit ist das mol. Ein mol ist die Stoffmenge, die der Molekularmasse einer Substanz in
Gramm entspricht. GebrÀuchliche Einheiten sind:
mol = 10 0 [mol]
mm ( milli) = 10 â3 [mol]
ÎŒm ( mikro ) = 10 â6 [mol]
nm (nano ) = 10 â9 [mol]
pm (pico ) = 10 â12 [mol]
fm ( femto ) = 10 â15 [mol]
Gleichung 2 : GebrÀuchliche Stoffmengen-Einheiten
Beispiel zur Umrechnung von Masse in Stoffmenge und umgekehrt:
ïŁź g ïŁč
Glucose = 180 ïŁŻ ïŁș
ïŁ° mol ïŁ»
45[ g]
45[ g] Glucose = = 0,25[mol]
ïŁź g ïŁč
180 ïŁŻ ïŁș
ïŁ° mol ïŁ»
ïŁź g ïŁč
0,05[mol] Glucose = 0,05[mol] â 180 ïŁŻ ïŁș = 9[ g]
ïŁ° mol ïŁ»
Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa
Volumen: Basiseinheit ist der Liter. GebrÀuchliche Einheiten sind:
[
1[l] = 1 dm 3 ]
1[ml] = 10 â3 [l] = 1 cm 3 [ ]
1[ÎŒl] = 10 â6
[l] = 1[mm ]
3
Gleichung 4 : GebrÀuchliche Volumen-Einheiten
Konzentration wird als Massenkonzentration oder Stoffmengenkonzentration angegeben.
Massenkonzentration: Basiseinheit ist Kilogramm gelöste Substanz pro Liter Lösung. GebrÀuchliche Einheiten
sind:
-4-
4. Bioanalytik
ïŁź kg ïŁč ïŁźgïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 1ïŁŻ ïŁș
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ml ïŁ»
ïŁźgïŁč ïŁźgïŁč ïŁź mg ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 â3 ïŁŻ ïŁș = 1ïŁŻ ïŁș
ïŁ°l ïŁ» ïŁ° ml ïŁ» ïŁ° ml ïŁ»
ïŁź mg ïŁč â6 ïŁź g ïŁč ïŁź ÎŒg ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 ïŁŻ ml ïŁș = 1ïŁŻ ml ïŁș
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ïŁ» ïŁ° ïŁ»
ïŁź ÎŒg ïŁč ïŁźgïŁč ïŁź ng ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 â9 ïŁŻ ïŁș = 1ïŁŻ ïŁș
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ml ïŁ» ïŁ° ml ïŁ»
ïŁź ng ïŁč ïŁźgïŁč ïŁź pg ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 â12 ïŁŻ ïŁș = 1ïŁŻ ïŁș
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ml ïŁ» ïŁ° ml ïŁ»
Gleichung 5 : GebrÀuchliche Massenkonzentrations-Einheiten
Stoffmengenkonzentration: Basiseinheit ist mol gelöste Substanz pro Liter Lösung.
Beispiel: 1 mol/l Glucose = 180 g Glucose gelöst in H2O und durch weitere Zugabe von H2O auf 1 Liter gebracht.
GebrÀuchliche Einheiten und Symbole sind:
ïŁź mol ïŁč ïŁź mmol ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 1ïŁŻ ml ïŁș = 1[M] ( molar )
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ïŁ»
ïŁź mmol ïŁč â3 ïŁź mol ïŁč ïŁź ÎŒmol ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 ïŁŻ l ïŁș = 1ïŁŻ ml ïŁș = 1[mM] ( millimolar )
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ïŁ» ïŁ° ïŁ»
ïŁź ÎŒmol ïŁč â6 ïŁź mol ïŁč ïŁź nmol ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 ïŁŻ l ïŁș = 1ïŁŻ ml ïŁș = 1[ÎŒM] ( mikromolar )
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ïŁ» ïŁ° ïŁ»
ïŁź nmol ïŁč â9 ïŁź mol ïŁč ïŁź pmol ïŁč
1ïŁŻ ïŁș = 10 ïŁŻ l ïŁș = 1ïŁŻ ml ïŁș = 1[nM] ( nanomolar )
ïŁ° l ïŁ» ïŁ° ïŁ» ïŁ° ïŁ»
Gleichung 6 : GebrÀuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten
Beispiele: Eine 1 M Lösung von Glucose enthÀlt 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml oder 1 ”mol/”l. Eine 1 mM Lösung von
Glucose enthÀlt 1 mmol/l bzw. 1 ”mol/ml oder 1 nmol/”l.
Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration
Eine Lösung von 9 g/l Glucose ist:
ïŁźgïŁč
9ïŁŻ ïŁș
ïŁ°lïŁ» = 0,05M â 50mM
ïŁź g ïŁč
180 ïŁŻ ïŁș
ïŁ° mol ïŁ»
Eine 10 nM Lösung von Glucose hat eine Massenkonzentration von:
ïŁź nmol ïŁč ïŁź ng ïŁč ng ÎŒg
10 ïŁŻ
ïŁ° l ïŁ» ïŁș â 180 ïŁŻ nmol ïŁș = 1.800 l â 1,8 l
ïŁ° ïŁ»
Beachten Sie die verschiedene Bedeutung
VerdĂŒnnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])
Volumen des Ansatzes
VerdĂŒnnungsfaktor =
Volumen der Ausgangslösung
[S Ausgangslösung ]
= [ S verdĂŒnnt ] â VerdĂŒnnungsfaktor
Beispiele:
Zur Bestimmung einer EnzymaktivitÀt werde 1,9 ml einer Enzymlösung (11 ”g/ml) zu 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 ml
Substratlösung (5 mM) gegeben. Das Substrat wird 25-fach (2,5 ml Ansatz / 0,1 ml Substratlösung) verdĂŒnnt. Im
Messansatz ist die Substratkonzentration 0,2 mM und die Enzymkonzentration 8,4 ”g/ml (VerdĂŒnnungsfaktor:
2,5 ml / 1,9 ml = 1,32). Wenn im Messansatz eine EnzymaktivitÀt von 14,4 U/ml bestimmt wird, ist die AktivitÀt der
verwendeten Enzymlösung (14,4 U/ml x 1,32) = 19,0 U/ml.
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5. Bioanalytik
Zu 0,5 ml Serum werde eine Substanz durch Zugabe einer bestimmten Menge FÀllungsreagens quantitativ ausgefÀllt,
der Ăberstand nach Zentrifugation verworfen und das PrĂ€zipitat in 1,5 ml Puffer aufgelöst. Die gesamte Menge Substanz,
die in 0,5 ml Serum enthalten war, ist nun in 1,5 ml enthalten (Volumen des PrÀzipitats ist vernachlÀssigbar klein).
VerdĂŒnnung der Substanz: (1,5 ml/ 0,5 ml) = 3-fach.
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6. Bioanalytik
Kohlenhydrate
Kohlenhydrate sind primÀre Oxidationsprodukte mehrwertiger Alkohole. Es sind entweder Polyhydroxyaldehyde
(Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Sie werden eingeteilt in Monosaccharide, Oligosaccharide (Disaccharide,
Trisaccharide usw.) und hochmolekulare Polysaccharide.
Monosaccharide sind Aldehyde oder Ketone, die entsprechend der Anzahl ihrer C-Atome in Triosen, Pentosen,
Hexosen usw. unterteilt werden. Monosaccharide und Oligosaccharide mit gleicher Anzahl C-Atome werden aufgrund
der sterischen Anordnung (Konfiguration) der Substituënten an den C-Atomen unterschieden.
Monosaccharide und Oligosaccharide sind gut wasserlöslich. Gewisse Polysaccharide können in heiĂem Wasser gelöst
werden.
Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur
Viele Eigenschaften der Monosaccharide sind auf ihre Aldehyd- bzw. Ketogruppe zurĂŒckzufĂŒhren. Diese Gruppen
sind im Unterschied zu gewöhnlichen Aldehyd- und Keto-Funktionen nur zum kleineren Teil in freier Form vorhanden,
gröĂtenteils liegen sie als Cyklohalbacetal (-ketal) vor. Die Ringe entstehen durch Kondensation der Aldehyd- oder
Ketogruppe mit einer alkoholischen OH-Gruppe desselben Monosaccharids. Zucker mit fĂŒnfgliedrigen Ringen werden
Furanosen, solche mit sechsgliedrigen Pyranosen genannt wegen ihrer Ăhnlichkeit zu Furan und Pyran. Freie Pentosen
und Hexosen haben in der Regel Pyranosestruktur.
Dagegen liegt in Saccharose die Fructose und in NukleïnsÀuren die Ribose und Desoxyribose in der Furanoseform vor.
Bei der Ringbildung sind am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom 2 verschiedene rÀumliche Konfigurationen
möglich, die als α- und ÎČ-Formen bezeichnet werden (= anomere Formen). Beide gehen leicht ineinander ĂŒber
(Mutarotation). Der Ăbergang erfolgt ĂŒber die offenkettige Form.
Abbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und ÎČ-Form)
Die glycosidische Bindung
Glycoside sind Zuckerderivate, bei welchen die OH-Gruppe am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom mit
einem organischen Rest (R) kondensiert ist. Je nach Konfiguration der dabei entstehenden Acetalgruppe unterscheidet
man anomere α- und ÎČ-Glycoside, je nach Art der R-Gruppe O- oder N-Glycoside.
Beispiel: Glycoside von Glucose.
Abbildung 2 : Glykoside von Glucose
-7-
7. Bioanalytik
Die wichtigsten Glycoside sind die Oligo- und Polysaccharide. Bei den einfachsten Oligosacchariden, den
Disacchariden, lassen sich 2 Bindungstypen unterscheiden. Bei der Saccharose erfolgt die glycosidische Bindung
zwischen den hemiacetalischen (bzw. hemiketalischen) OH-Gruppen beider Zuckerreste. Solche Zucker tragen deshalb
keine freie Halbacetalgruppe. Bei der Maltose erfolgt die Bindung zwischen einer hemiacetalischen und einer
alkoholischen OH-Gruppe. Disaccharide des Maltose-Typs besitzen noch eine freie Halbacetalgruppe (Pfeil in
untenstehenden Formeln).
Abbildung 3 : Disaccharide
Chemisch können glycosidische Bindungen mit SÀure gespalten werden, gegen Basen sind sie stabil. Im Organismus
werden Polysaccharide und Oligosaccharide enzymatisch gespalten.
Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend
Freie Aldehyde und Ketone in Zuckern sowie die entsprechenden Hemiacetale und Hemiketale werden durch milde
Oxidationsmittel oxidiert. Weil bei dieser Reaktion das Oxidationsmittel durch den Zucker reduziert wird, spricht man
von reduzierenden Zuckern. Alle Monosaccharide sind reduzierend. Disaccharide und Oligosaccharide dagegen sind
nur reduzierend, wenn sie noch eine freie Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe besitzen. Disaccharide vom Saccharose-Typ
sind demgemÀss nicht reduzierend. Hochmolekulare Polysaccharide wie StÀrke und Glycogen wirken nicht reduzierend,
weil in Polysaccharidlösungen die Konzentration der reduzierenden MolekĂŒlenden sehr niedrig ist.
In der Benedictschen Probe wird 2-wertiges Kupfer (alkalische Lösung von CuSO 4 in Natriumcarbonat und
Natriumcitrat) zur Oxidation von Zucker verwendet gemÀss
Cu 2 + + Glucose â Cu + + Oxidationsprodukte von Glucose
Formel 1 : Benedict-Probe
WĂ€hrend der Reaktion entsteht aus dem blauen 2-wertigen Kupfer zuerst gelbes 1-wertiges Kupferhydroxid (CuOH)
und spÀter schwerlösliches Kupfer-(I)-oxid (Cu 2O) als roter Niederschlag. Der Benedict-Test ist eine einfache
Nachweismethode fĂŒr reduzierende Zucker. Neben reduzierenden Zuckern geben aber auch andere reduzierende
Substanzen eine positive Benedict-Reaktion. FĂŒr den spezifischen Nachweis einzelner reduzierender Zucker sind deshalb
enzymatische Methoden notwendig. Zum spezifischen Nachweis von Glucose wird Glucoseoxidase aus Schimmelpilz
verwendet, die folgende Reaktion katalysiert:
Glucose + O 2 + H2 O ïŁ§Glucoseoxi dase âGluconsĂ€ure + H2 O 2
ïŁ§ïŁ§ïŁ§ïŁ§ïŁ§ïŁ§ ïŁ§
Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1
Das entstehende Wasserstoffperoxid wird in einer gekoppelten Reaktion dazu benutzt, eine farblose Verbindung
(Chromogen) zu einem Farbstoff zu oxidieren. Die Reaktion wird durch eine Peroxidase katalysiert.
Peroxidase
H2 O 2 + Chromogen ïŁ§ïŁ§ïŁ§ïŁ§ïŁ§ âFarbstoff + H2 O
ïŁ§
Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2
FĂŒr den semiquantitativen Glucosenachweis z.B. im Urin dient ein TeststĂ€bchen (Diabur-Test), das mit den beiden
Enzymen und dem Chromogen imprĂ€gniert ist. FĂŒr die quantitative Glucosebestimmung wird aus einer nicht
absorbierenden Verbindung eine im UV-Bereich absorbierende Indikatorverbindung gebildet, deren Konzentration
photometrisch gemessen wird.
-8-
8. Bioanalytik
AminosÀuren und Proteïne
Zwanzig verschiedene AminosĂ€uren sind die ĂŒblichen Bausteine der ProteĂŻne. Man unterscheidet saure, neutrale und
basische AminosÀuren oder apolare (aliphatische, aromatische) und polare AminosÀuren. In den Proteïnen sind die
AminosĂ€uren durch Peptidbindungen miteinander verknĂŒpft.
Formel 4 : Peptidbindung in ProteĂŻnen
Die AminosÀurensequenz (PrimÀrstruktur) bestimmt die 3-dimensionale Anordnung der Peptidkette im Raum
(SekundÀr- und TertiÀrstruktur). HÀufig sind 2 und mehr Peptidketten mit ausgebildeter SekundÀr- und TertiÀrstruktur zu
stabilen oligomeren MolekĂŒlen zusammengelagert (QuartĂ€rstruktur).
PrimÀre Aminogruppen von AminosÀuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-
Reaktion nachgewiesen
Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primÀren Aminogruppen zu einem blauen Farbstoff.
Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion
α-AminosÀuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise reagiert auch
die Δ-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteïne eine positive Ninhydrin-Reaktion. Zur
quantitativen Bestimmung von AminosÀuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe photometrisch gemessen. Die Trennung
verschiedener AminosĂ€uren durch Ionenaustauscher-Chromatographie und die anschlieĂende photometrische
Konzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. AminosĂ€urenanalysator vollautomatisch durchgefĂŒhrt
Biuret-Test
Peptidbindungen bilden blau-violette Cu 2+-Komplexe
In stark alkalischer Lösung entstehen aus Proteïnen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu 2+-Ionen
und benachbarten Amid-Stickstoffatomen von Peptidbindungen. Biuret (H 2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachste
Verbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativen
photometrischen Proteïnbestimmung. Die Farbe des Komplexes ist in der Regel unabhÀngig von der Art des Proteïns, so
dass eine fĂŒr Serumalbumin bestimmte photometrische Kalibrierkurve auch fĂŒr viele andere ProteĂŻne benutzt werden
kann.
Tryptophan und Tyrosin geben den ProteĂŻnen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei
280 nm. Wie die Spektren in Abb. 4 zeigen, trÀgt Tryptophan am meisten und Phenylalanin kaum zur Absorption der
ProteĂŻne im nahen UV-Bereich bei.
Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen AminosÀuren
-9-
9. Bioanalytik
In Abb. 4 bedeutet ΔmM âmillimolarer ExtinktionskoĂ«ffiziĂ«ntâ. Der millimolare ExtinktionskoĂ«ffiziĂ«nt ist die
Absorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden AminosÀure. Je nach dem Gehalt an aromatischen
AminosÀuren Àndert die UV-Absorption von Proteïnen. In Abbildung 5 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicher
Massenkonzentration (mg/ml) von Lysozym, Îł-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und ProteĂŻne
absorbieren sehr stark bei 220 nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die 3 ProteĂŻne enthalten unterschiedlich viel Tyrosin
und Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden, wegen des
variablen Gehalts an aromatischen AminosĂ€uren gilt jedoch eine Kalibrierkurve nur fĂŒr ein bestimmtes ProteĂŻn. Manche
ProteĂŻne absorbieren sichtbares Licht. FĂŒr das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich
(HĂ€m, Flavin, etc.).
Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen AminosÀuren
Die Spektren wurden mit Proteïnlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen.
ProteĂŻn Tryptophangehalt Tyrosingehalt
Lysozym (HĂŒhnereiweiĂ) 8,6 4,0
Ovalbumin (HĂŒhnereiweiĂ) 1,3 3,8
Ribonuclease (Rind) 0,0 7,9
Tabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g AminosÀure pro 100 g Proteïn
GroĂmolekulare ProteĂŻne werden von kleinen MolekĂŒlen durch Dialyse oder
Gelchromatographie abgetrennt
Gewisse Cellophanmembranen sind fĂŒr groĂe MolekĂŒle undurchlĂ€ssig, fĂŒr Wasser und andere kleine MolekĂŒle
durchlĂ€ssig. Wird eine ProteĂŻn-Salzlösung in einem Cellophanschlauch fĂŒr lĂ€ngere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht,
so stellt sich fĂŒr die frei passierbaren MolekĂŒle durch Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht ĂŒber das gesamte
FlĂŒssigkeitsvolumen ein. Die groĂen ProteĂŻnmolekĂŒle werden im Schlauch zurĂŒckgehalten. Der Vorgang wird Dialyse
genannt. Durch Dialyse können Proteïnlösungen entsalzt werden, oder ein Proteïn in einem Puffer A kann durch Dialyse
in einen neuen Puffer B gebracht werden. Die HĂ€modialyse (kĂŒnstliche Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit der
Gelchromatographie ist eine feinere Trennung von MolekĂŒlen unterschiedlicher GröĂe möglich als mit der Dialyse.
Molekularmasse von ProteĂŻnen
Die meisten ProteĂŻne haben eine Molekularmasse (M r) im Bereich 10.000 bis 100.000.
ProteĂŻn Molekularmasse
Glucagon (ein Peptid) 4.500
Ribonuclease 13.700
Myoglobin 17.000
Chymotrypsin 25.000
HĂ€moglobin 64.500
Serumalbumin 69.000
Aldolase 160.000
Phosphorylase a 390.000
Tabelle 2 : Molekularmasse einiger ProteĂŻne
- 10 -
10. Bioanalytik
GebrÀuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteïnen sind Gelchromatographie, SDS-
Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Die heute gebrÀuchlichste Methode ist die SDS-
Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld
fast ausschlieĂlich eine Funktion der MolekĂŒlgröĂe. ProteĂŻne mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solche
mit hoher Molekularmasse. Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der ĂŒblichen ProteĂŻnelektrophorese,
bei der native ProteĂŻne aufgrund ihrer Ladung getrennt werden.
Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusĂ€tzlich Information ĂŒber die
Form und den Aggregationszustand von ProteĂŻnmolekĂŒlen. Im kĂŒnstlichen Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist die
Sedimentationsgeschwindigkeit Vs der Partikel von ihrer GröĂe abhĂ€ngig gemĂ€ss Vs = S@Î. Die ZentrifugalfeldstĂ€rke Î
wird bestimmt durch den Radius der Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die fĂŒr die untersuchte Partikel
charakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemÀss der obigen Gleichung bestimmt werden kann.
S ist unter anderem eine Funktion der MolekĂŒlmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten S
berechnet werden. Die Beziehung lautet:
ïŁ« Ï ïŁ¶
M â D â ïŁŹ1 â m ïŁ·
ïŁŹ Ïp ïŁ·
S= ïŁ ïŁž
R âT
Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten
M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, Ïm und Ïp = Dichte von Medium und Partikel, R = Gaskonstante,
T = Temperatur (absolut). Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten [S] (1 Svedberg = 10-13 sec)
ausgedrĂŒckt und auf Ïm von Wasser und 20 °C normalisiert (S20,w). Typische Werte sind:
Myoglobin 2
Ribosomen- 40
Untereinheiten 60
Viren 200
Zellen (komplett) 1000
Tabelle 3 : Typische Werte fĂŒr S
Denaturierung von ProteĂŻnen
Die native Struktur von Proteïnen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu gehören WÀrme,
Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, SÀuren, Basen, Schwermetallionen oder hohe Konzentration
von Harnstoff. Die fĂŒr die SekundĂ€r-, TertiĂ€r- und QuartĂ€rstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werden
teilweise oder ganz gelöst, wĂ€hrend die fĂŒr die PrimĂ€rstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben.
Man bezeichnet diesen Prozess der partiellen oder vollstÀndigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Ein
denaturiertes Proteïn hat die gleiche PrimÀrstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche rÀumliche Struktur und
andere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern beim Kochen).
Bei der Denaturierung geht die biologische AktivitÀt verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von Enzymen und
ProteĂŻnhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein.
Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteïne. Denaturierte Proteïne werden von Proteasen
leichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.
Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich
Die Löslichkeit der Proteïne variiert stark. GlobulÀre Proteïne wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinen
gut, Faserproteïne (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteïne sind Polyelektrolyte. Elektrostatische KrÀfte
zwischen ProteĂŻnmolekĂŒlen einerseits und zwischen ProteĂŻnmolekĂŒlen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen die
Löslichkeit. Proteïne mit vielen geladenen Gruppen sind hÀufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteïns ist am
geringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das MolekĂŒl gleich viele positive wie
negative Ladungen trÀgt. Man bezeichnet den pH-Wert der wÀssrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, als isoelektrischen
Punkt (IEP) des ProteĂŻns. Manche ProteĂŻne fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei pH-Werten ĂŒber und unter dem
IEP bewirken negative bzw. positive Ăberschussladungen gegenseitige AbstoĂung der ProteĂŻnmolekĂŒle und damit bessere
Löslichkeit.
- 11 -
11. Bioanalytik
Abbildung 6 : Löslichkeit von ÎČ-Lactoglobulin (IEP 5,2) in AbhĂ€ngigkeit vom pH-Wert bei 25 °C.
Die Löslichkeit ist bei pH 6,0 mehr als 40 mal gröĂer als bei pH 5,2.
Proteïne werden aus wÀssrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischen
Lösungsmitteln oder bestimmten SÀuren ausgefÀllt
Zur Isolierung und Reinigung werden ProteĂŻne hĂ€ufig ausgefĂ€llt. Solche FĂ€llungen mĂŒssen reversibel sein, soll das
Proteïn seine biologische AktivitÀt behalten: Ein isoliertes Enzym muss nach der FÀllung wieder gelöst werden können
und unverminderte AktivitÀt besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteïne; sie werden deshalb
irreversibel ausgefÀllt (z.B. durch ein FÀllungsreagens wie PerchlorsÀure oder TrichloressigsÀure) und durch
Zentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteïnisierung" ist z.B. nötig bei der Bestimmung von Glucose im Serum.
Die meisten FĂ€llungen beruhen auf der Ănderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen
ProteĂŻnmolekĂŒlen. So werden ProteĂŻne aus wĂ€ssrigen Lösungen durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausgefĂ€llt,
weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung der geladenen ProteĂŻnmolekĂŒle gröĂer wird (ProteĂŻne
haben ein unregelmĂ€Ăiges Muster von positiven und negativen Ladungen auf ihrer OberflĂ€che). GemĂ€ss dem
Coulombschen Gesetz ĂŒber die Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehung
mit abnehmender DiëlektrizitÀtskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine niedrigere
DiëlektrizitÀtskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die FÀllung von Blutplasmaproteïnen mit Alkohol und
Aceton (Cohn-Fraktionierung). Die FĂ€llung geschieht bei tiefen Temperaturen, damit die PlasmaproteĂŻne nicht
irreversibel denaturiert werden.
Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteïnlösung bewirkt die Erniedrigung der effektiven
Konzentration (AktivitĂ€t) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der fĂŒr die Lösung des ProteĂŻns verfĂŒgbaren
Wassermenge. Das Proteïn wird ausgefÀllt. Man bezeichnet die durch Salzzugabe bewirkte AusfÀllung als Aussalzung.
Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird fĂŒr die Aussalzung
Ammoniumsulfat verwendet, weil es besonders gut löslich ist. Zur AusfÀllung von verschiedenen Proteïnen werden
unterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteïngemisch kann deshalb durch schrittweises
ZufĂŒgen von Ammoniumsulfat aufgetrennt werden.
- 12 -
12. Bioanalytik
Lipide
Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen gemeinsam. Lipide
sind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die Lipide können unterteilt werden in
einfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oder
Triacylglycerole. Es sind hÀufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werden
z.B. die Membranbestandteile Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezÀhlt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge des
Isoprens und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und GallensÀuren. Cholesterin ist ein
universeller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt fĂŒr die Biosynthese von GallensĂ€uren, Steroidhormonen
und Vitamin D.
Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur der
FettsÀuren bestimmt
Die Fette und Ăle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerole. Triacylglycerole sind Verbindungen,
die aus einem MolekĂŒl Glycerol, verestert mit 3 MolekĂŒlen FettsĂ€ure, bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu den
komplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischen
Eigenschaften der Neutralfette sind je nach FettsÀurenzusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fetten
um so niedriger, je kĂŒrzer die FettsĂ€uren und je gröĂer die Zahl der ungesĂ€ttigten Bindungen. Ăle enthalten vorwiegend
Triacylglycerole mit ungesÀttigten FettsÀuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt, der etwas unter der
physiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fett
aus dem Innern des Körpers.
FettsÀuren und Lipide, die ungesÀttigte FettsÀuren enthalten, werden leichter oxidiert als gesÀttigte FettsÀuren. Das
Ranzigwerden von Fetten beruht zum Teil auf oxidativer Spaltung an den Doppelbindungen, wobei stark riechende
Aldehyde oder SÀuren geringerer KettenlÀnge entstehen.
Seifen, Detergentiën und GallensÀuren emulgieren wasserunlösliche Lipide
In Haushalt und Labor werden wasserunlösliche Lipide mit Seifen oder Detergentiën emulgiert. Im tierischen
Organismus haben die GallensÀuren eine Àhnliche Aufgabe. Die 3 Verbindungen sind aus einem hydrophoben, apolaren
KohlenwasserstoffgerĂŒst und einem hydrophilen, polaren âKopfteilâ aufgebaut. Solche Verbindungen lösen sich in
organischen Lösungsmitteln in der protonierten Form, im Wasser als Anionen. Sie sind amphiphil. In Ăl-
Wasser Gemischen reichern sich amphiphile Verbindungen an der GrenzflĂ€che zwischen Ăl und Wasser an. Sie sind
oberflĂ€chenaktiv, d.h. sie erleichtern die VergröĂerung von GrenzflĂ€chen und ermöglichen so die Bildung
mikroskopisch kleiner Ăltröpfchen im Wasser; das Ăl wird emulgiert. Im Unterschied zu einer echten Lösung sind aber
die LipidmolekĂŒle in der Emulsion nicht direkt von WassermolekĂŒlen umgeben, sondern von einer HĂŒlle aus Seife,
Detergens- oder GallensĂ€uremolekĂŒlen.
Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und GallensĂ€uremolekĂŒlen
Nur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden
Im DĂŒnndarm werden Neutralfette durch die Pankreaslipase in Monoacylglycerole und freie FettsĂ€uren gespalten. Die
Lipase, ein ProteĂŻnmolekĂŒl, ist nur in wĂ€ssriger Phase löslich und aktiv. Die physiologische Funktion der GallensĂ€uren
besteht darin, die Neutralfette zu kleinen Tröpfchen zu emulgieren, so dass eine groĂe GrenzflĂ€che fĂŒr den Angriff der
Lipase zur VerfĂŒgung steht.
Im Blut werden wasserunlösliche Lipide an Proteïne gebunden transportiert. FettsÀuren werden an Serumalbumin
gebunden, Neutralfette, Cholesterin und Phospholipide an spezielle LipoproteĂŻne. Low Density LipoproteĂŻne (LDL) als
hauptsÀchliche TrÀger von Cholesterin und Cholesterinestern sind besonders bedeutsam. Erhöhte Blutcholesterin-Werte
sind ein Risikofaktor fĂŒr die Entstehung von Arteriosklerose. Die Chylomikronen sind lichtmikroskopisch sichtbare
Aggregate von Neutralfetten, umgeben von weniger hydrophoben Phospholipiden und hydrophilen ProteĂŻnen. Es sind
Transportvehikel fĂŒr schwerlösliche Lipide aus der DĂŒnndarmmucosa via Lymphe in die Blutbahn.
- 13 -
13. Bioanalytik
Biologische Membranen
Biologische Membranen verschiedener Herkunft (Plasmamembran, ER 1, Mitochondriënmembran, Golgi-Apparat,
u.a.) können sich nicht nur in ihrer Proteïnzusammensetzung, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung stark
unterscheiden. Ebenso können sich je nach Zelltyp die Gesamtmenge und die Anteile der verschiedenen biologischen
Membranen unterscheiden. Die Erythrozytenmembran besteht wie andere biologische Membranen hauptsÀchlich aus
Lipiden und Proteïnen. Die Lipid-Doppelschicht ist 6-7 nm dick und enthÀlt in einem Feld von 1 ”m2 etwa 5 x 106
LipidmolekĂŒle. Die speziellen Eigenschaften der Membranlipide ermöglichen, dass sich die LipidmolekĂŒle spontan
aneinander lagern und durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Lipidfraktion umfasst
polare Lipide, vor allem Glycerolphosphatide, aber auch Sphingolipide sowie Cholesterin. Die Grundstruktur der
Glycerolphosphatide ist die mit einem Alkohol (R-OH) veresterte PhosphatidsÀure.
Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide
R1 und R2 sind langkettige FettsÀuren. R2 ist meist eine ungesÀttigte FettsÀure, hÀufig die hochungesÀttigte
ArachidonsÀure (20:4), die nach Abspaltung aus Phospholipiden als unmittelbare Vorstufe zur Synthese hormonÀhnlicher
Lipidsubstanzen dient (Prostaglandine, Thromboxane einerseits und Leukotriëne andererseits). Die polare Kopfgruppe X
bestimmt den Typ des Phospholipids.
Die 3 hÀufigsten Phospholipidtypen
Phospholipidtyp âKopfgruppeâ (-X)
â CH2 CH2N( CH3 ) 3
+
Phosphatidylcholin PC
+
Phosphatidylethanolamin PE â CH2 CH2NH3
Phosphatidylserin PS (
â CH2 CH2 NH3 COO â
+
)
PhosphatidsĂ€ure âH
Tabelle 4 : Phospholipidtypen
Die Kohlenwasserstoffketten (Acylgruppen) der Membranlipide können entweder in starrem, geordnetem Verband
oder in relativ ungeordnetem, âflĂŒssigemâ Zustand existieren. Der starre Zustand wird begĂŒnstigt durch gesĂ€ttigte
FettsÀuren, wÀhrend ungesÀttigte FettsÀuren infolge der cis-Doppelbindung(en) die geordnete Packung der Acylketten
stören. Biologische Membranen sind asymmetrisch aufgebaut. WÀhrend PC vorwiegend und Glycolipide fast
ausschlieĂlich auf der extrazellulĂ€ren Seite der Lipidmembran gefunden werden, befinden sich PE und PS hauptsĂ€chlich
auf der cytoplasmatischen Seite. Einige der neutralen Glycolipide sind fĂŒr die BlutgruppenspezifitĂ€t von roten Blutzellen
verantwortlich.
Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht
Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht, die in der Darstellung eine flĂŒssigkeitsĂ€hnliche Packungsdichte der Kohlenwasserstoffketten aufweist. Im dargestellten 30x30 Ă groĂen
Schnitt befinden sich sechs CholesterinmolekĂŒle, fĂŒnf GlycerophospholipidmolekĂŒle (3 Typen) und vier SphingolipidmolekĂŒle (2 Typen). Die OH-Gruppe des CholesterinmolekĂŒls
sitzt an der OberflĂ€che der Lipid-Doppelschicht, wĂ€hrend das Steroid-Ringsystem sich im Ă€uĂeren Anteil der Lipid-Doppelschicht befindet und mitverantwortlich ist fĂŒr eine
Versteifung der Doppelschicht in diesem Bereich.
1
Endoplasmatisches Retikulum
- 15 -
14. Bioanalytik
Abbildung 8 : Diffusion von PhospholipidmolekĂŒlen in einer Lipid-Doppelschicht
Die spontane âFlip-Flop-Bewegungâ ist ein Ă€uĂerst seltenes Ereignis.
- 16 -
15. Bioanalytik
NucleïnsÀuren
Zur Reinigung und Trennung groĂmolekularer NucleĂŻnsĂ€uren, deren Aufbau und Struktur hier nicht behandelt
werden soll, dienen Ă€hnliche Methoden wie fĂŒr ProteĂŻne; die Gelchromatographie zur Trennung nach MolekĂŒlgröĂe und
die SDS-Gelelektrophorese zur Molekularmassebestimmung. Oligonucleotide können aufgrund ihres Gehalts an negativ
geladenen Phosphatgruppen durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. NucleïnsÀuren sind gut
wasserlöslich, fallen aber in saurem Milieu aus. Gegen WÀrme oder organische Lösungsmittel sind NucleïnsÀuren
wesentlich stabiler als Proteïne. Chemisch können NucleïnsÀuren durch Kochen in SÀure in die Bausteine Phosphat,
Pentose und Nucleïnbasen zerlegt werden. Im Organismus werden sie durch Nucleasen verschiedener SpezifitÀt zu Oligo-
und Mononucleotiden hydrolysiert. Pankreatische Ribonuclease spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphatgruppe
eines Pyrimidinnucleotids und dem C 5 der Ribose des nÀchsten Nucleotids. Es entstehen freie Pyrimidin-3'-phosphate und
Oligonucleotide mit einem Pyrimidin-3'-phosphat am einen Ende.
Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm
Das Absorptionsmaximum ist um rund 20 nm im kurzwelligeren Bereich des Spektrums als dasjenige der ProteĂŻne.
Die Extinktionskoëffiziënten der Purine und Pyrimidine sind wesentlich höher als diejenigen von Tryptophan und
Tyrosin. Im allgemeinen sind die Spektren aller NucleïnsÀuren gleich, allerdings gibt es gewisse von Struktur und
Konformation abhÀngige Unterschiede. Zum Beispiel Àndert sich das Spektrum von DNA bei der Denaturierung von
doppelstrÀngiger zu einstrÀngiger DNA.
Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotiden
wird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt
Pyridinnucleotide (NAD+âNADP+) absorbieren ebenfalls maximal bei 260 nm, der Nicotinamidrest zeigt zusĂ€tzlich
eine vom Redoxzustand (NAD+âNADH) abhĂ€ngige Absorption im lĂ€ngerwelligen UV. Enzymreaktionen, die mit den
Reaktionen NAD+âNADH oder NADPâ+NADPH gekoppelt sind, können daher bequem photometrisch verfolgt
werden. Die Methode, historisch als âOptischer Test nach Warburg" bekannt, wird im klinisch-chemischen Labor
auĂerordentlich hĂ€ufig angewandt.
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16. Bioanalytik
pH-Messung und Titration
Eine SÀure kann nach Brönsted definiert werden als eine Substanz, die in Lösung in ein Wasserstoffion und die
konjugierte Base A- dissoziiert. Eine Base ist eine Substanz, die ein Wasserstoffion aufnehmen kann und dadurch zur
konjugierten SĂ€ure wird. Diese Beziehungen sind gegeben durch die folgenden Gleichgewichte:
AH â A + + H â ( SĂ€ure )
B + H + â BH + (Base )
Formel 8 : Brönstedsche SÀure-Base-Definition
Je nach Lage des Gleichgewichts kann eine SÀure in wÀssriger Lösung in der undissoziierten, der dissoziierten Form
oder einer Mischung der beiden vorliegen. Wasserstoffionen existieren in wÀssriger Lösung nur in hydratisierter Form als
H3O+. Aus GrĂŒnden der Vereinfachung wird aber im folgenden auf diese Schreibweise verzichtet.
Bei der acidimetrischen Titration von SĂ€uren werden sowohl die freien wie auch alle potentiell dissoziierbaren
Wasserstoffionen (undissoziierte saure Ăquivalenzen) erfasst. Bei der pH-Messung (pH = -log (H+)) wird nur die freie
H+-Konzentration (bzw. AktivitÀt) gemessen.
Starke SÀuren sind in wÀssriger Lösung vollstÀndig dissoziiert. Eine 0,1 M HCl-Lösung liegt beispielsweise
vollstÀndig in Form von H+ und Cl--Ionen vor und ergibt daher eine H+-Konzentration von 0,1 M = 10-1 M, also einen pH-
Wert von 1. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern in diesem Fall das gleiche Resultat.
Bei einer schwachen SÀure ist die Dissoziation unvollstÀndig. Das Gleichgewicht zwischen der dissoziierten und
undissoziierten Form ist gegeben durch die SĂ€uredissoziationskonstante Ka:
[ A ] + [H ] =K
â +
[ AH ] a
Gleichung 8 : Definition der SĂ€uredissoziationskonstante
Je schwÀcher eine SÀure, desto kleiner ist Ka. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern ungleiche Resultate.
Eine 0,1 M EssigsÀurelösung ist z.B. nur zu 1,5 % dissoziiert. Ihr pH-Wert ist etwa 2,85. Gl. 8 gestattet die Berechnung
des pH-Wertes von wÀssrigen Lösungen schwacher SÀuren, von Wasser, von wÀssrigen Lösungen von Salzen einer
schwachen SÀure und einer starken Base und von Mischungen der Lösungen solcher Salze und der zugehörigen
schwachen SÀure (Pufferlösungen).
Berechnung des pH-Wertes einer schwachen SĂ€ure
Wenn eine schwache SĂ€ure der Hauptlieferant von H+ ist, dann ist [H+] = [A-]. Gl. 8 wird somit umgeformt in:
[H ] + 2
= Ka
[ AH ]
[ H ] = K [ AH ]
+ 2
a
2 â log[ H ] = log K + log[ AH ]
+
a
Gleichung 9 : SĂ€uredissoziationskonstante einer schwachen SĂ€ure
Bei einer schwachen SĂ€ure in einer Konzentration > 10 * Ka entspricht [AH] fast der ursprĂŒnglichen
Gesamtkonzentration c [mol/l], somit
[ ]
log H + = ( log K a + log c ) / 2
pH = ( pK a â log c ) / 2
Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen SĂ€ure
wobei pKa = -log Ka. Damit lĂ€sst sich der pH-Wert einer schwachen SĂ€ure angenĂ€hert berechnen. FĂŒr 0,01 M
EssigsÀure (pKa 4,7) ist der berechnete pH-Wert 3,35.
Berechnung des pH-Wertes von Wasser
Wasser ist eine sehr schwache SĂ€ure und die Konzentration der undissoziierten Form (H 2O) ist praktisch in allen
wÀssrigen Lösungen konstant (55 M). Das Dissoziationsgleichgewicht ist somit
[ H ] â [OH ] = 1,7 â10
+ â
â16
= KA
55
Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser
Daraus ergibt sich das Ionenprodukt, Kw, des Wassers
- 19 -
17. Bioanalytik
[H ] â [OH ] = 10
+ â â14
= K W ( 25°C )
Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers
In Abwesenheit anderer H -Donatoren ist [H+] = [OH-], und daher [H+]2 = l0-14, bzw. pH = 7. Dies ist der pH-Wert von
+
reinem Wasser. Wegen der Aufnahme von KohlensÀure aus der Luft ist der pH-Wert von destilliertem Wasser jedoch
meist niedriger (â pH 5).
Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen
SĂ€ure mit einer starken Base
Salze starker SÀuren mit starken Basen sind in wÀssriger Lösung annÀhernd neutral; hingegen sind Salze schwacher
SÀuren mit starken Basen leicht alkalisch. Ein solches Salz ist in wÀssriger Lösung vollstÀndig dissoziiert: XA = X+ + A-.
A- reagiert mit H2O gemÀss A- + HOH = AH + OH-. Da die Menge von AH gleich der Menge des gebildeten OH- ist, und
da [A-] praktisch gleich der Salz-Konzentration [Salz] ist, folgt aus Gl. 8
[ H ] = [ AHA] â]K
+ a
=
[OH ] â K
â
a
[ â
[ Salz ]
[OH ] = [ K ]
â
H
W
+
[ H ] = [ HK ] â [K ]
+ â
+
a
Salz
W
[ ]
log H + = log
KW K
+ log a â log
[ Salz ]
2 2 2
pH = 7 +
pK a
+ log
[ Salz ]
2 2
Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen SÀure mit einer starken Base
Nach Gl. 13 ist der pH-Wert von 0,1 M Na-Acetat 8,85.
Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung
Lösungen, die eine schwache SÀure (AH) und deren Salz (X+, A-) enthalten, werden Pufferlösungen genannt. Sie
können dank dem gleichzeitigen Vorhandensein der konjugierten SÀure (AH) und Base (A-) Wasserstoffionen binden
oder abgeben. Sie vermögen deshalb Ănderungen der H+-Konzentration bei Zugabe von SĂ€uren oder Basen innerhalb
enger Grenzen abzudÀmpfen. Dieses als Pufferwirkung bezeichnete Verhalten spielt eine grundlegende Rolle bei der
Aufrechterhaltung des pH-Wertes in physiologischen Systemen und auch bei der Kontrolle des pH-Wertes in
Experimenten.
Pufferlösungen können durch partielle Neutralisierung einer schwachen SÀure mit einer starken Base (z.B. NaOH),
oder praktischer durch Vermischen einer Lösung der SÀure und der Lösung eines ihrer Alkalisalze hergestellt werden.
Der pH-Wert einer Pufferlösung bekannter Zusammensetzung lÀsst sich nach Gl. 8 berechnen. Unter der Annahme,
dass [AH] der zugegebenen totalen SĂ€urekonzentration und [A-] der zugegebenen totalen Salzkonzentration entspricht
(diese Annahme ist nur gĂŒltig im Bereich, wo der Anteil von SĂ€ure oder Salz mehr als 5 % oder weniger als 95 % ihrer
Summe ausmacht), ergibt sich:
[ H ] = K [[AH]] = K [ SĂ€ure] ]
+
A
a â
[ Salz a
ïŁ« [ SĂ€ure] ïŁ¶
log[ H ] = logïŁŹ K
+
ïŁŹ ïŁ·
[ Salz ] ïŁ·
ïŁ
a
ïŁž
pH = pK a + log
[ Salz ] = pK + log A â [ ]
[ SĂ€ure] a
[ AH ]
Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung
Aus Gl. 14 folgt, dass pH = pKa, wenn [A-] = [AH]; d.h. der pH-Wert einer zur HĂ€lfte neutralisierten schwachen
SÀurelösung entspricht ihrem pK a-Wert.
Beispiele:
Zu 10 ml 0,1 M EssigsĂ€ure werden 5 ml 0,1 M NaOH zugefĂŒgt. Damit wird die HĂ€lfte der EssigsĂ€ure in die Salzform
ĂŒbergefĂŒhrt, so dass [Salz]/[SĂ€ure] = 5/5 wird.
- 20 -
18. Bioanalytik
5
pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 1 = 4 ,7( pH = pK a )
5
Zu 10 ml 0,1 M EssigsĂ€ure werden 0,2 ml 1 M NaOH zugefĂŒgt. Das entspricht der Addition von 2 ml 0,1 N NaOH.
Damit wird 1/5 der EssigsĂ€ure in die Salzform ĂŒbergefĂŒhrt, so dass [Salz]/[SĂ€ure] = 1/4 wird.
1
pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 0 ,25 = 4,7 + 0 ,4 â 1 = 4,1
4
Zu 10 ml 0,15 M Na2HPO4 werden 5 ml 0,15 M NaH2PO4 zugefĂŒgt (pKa2 = 7,2)
10
pH = 7 ,2 + log = 7 ,2 + 0,3 = 7 ,5
5
Aus je 0,3 M Na2HPO4 und NaH2PO4 soll eine 0,15 M Phosphatpufferlösung mit pH = 7,4 hergestellt werden.
7 ,4 = 7 ,2 + log
[ Salz ]
[ SĂ€ure]
log
[ Salz ] = 7 ,4 â 7 ,2 = 0,2 = [ Salz ] = 1,58
[ SĂ€ure] [ SĂ€ure]
Also mĂŒssen 1,58 Teile 0,3 M Na2HP04, 1 Teil 0,3 M NaH2P04 und 2,58 Teile H20 gemischt werden.
Ampholyte
Substanzen, welche sowohl saure wie basische Gruppen enthalten, nennt man Ampholyte, z.B. AminosÀuren sind
Ampholyte. Bei SÀurezusatz verhalten sich AminosÀuren wie Basen, bei Basenzusatz wie SÀuren (Zwitterionen):
Formel 9 : Ampholyt
Am isoelektrischen Punkt (IEP) liegen sie als Zwitterionen vor. Der isoelektrische Punkt ist derjenige pH-Wert, bei
welchem die Nettoladung der AminosÀure gleich Null ist. Bei diesem pH-Wert wandert die AminosÀure in einem
elektrischen Feld nicht. Da Proteïne aus AminosÀuren zusammengesetzt sind, sind Proteïne auch amphoter und weisen
auch einen IEP auf. Der IEP eines Proteïns wird durch Elektrophorese bestimmt: Der pH-Wert der Proteïnlösung wird so
lange variiert, bis keine Wanderung im elektrischen Feld mehr feststellbar ist.
Berechnung des isoelektrischen Punktes einer AminosÀure
Der pKa-Wert der Carboxylgruppe wird pK1 genannt, derjenige der Aminogruppe pK2. Am isoelektrischen Punkt ist
1
pH = â ( pK 1 + pK 2 )
2
Glycin:
pK 1 = 2,34
pK 2 = 9 ,60
IEP = 5,97
Gleichung 15 : IEP einer AminosÀure
Saure und basische AminosÀuren haben 3 pKa-Werte:
Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen AminosÀuren (Aspartat)
pK1 = 1,88, pK2 = 3,65, pK3 = 9,60, IEP = 2,77
- 21 -
19. Bioanalytik
AminosĂ€ure Carboxylgruppe Î-Aminogruppe Seitenkettengr.2 IEP
(protonierte Form)
Glycin 2,30 9,60 5,95
AsparaginsĂ€ure 1,90 9,60 3,70 (ÎČ-COOH) 2,80
GlutaminsÀure 2,20 9,70 4,30 (α-COOH) 3,50
Tyrosin 2,20 9,10 10,10 (-OH) 5,65
CysteĂŻn 1,90 10,70 8,40 (-SH) 5,15
Histidin 1,80 9,20 6,0 (Imidazolium) 7,60
Lysin 2,20 9,00 10,5 (Δ-NH3+) 9,75
Arginin 2,20 9,00 12,5 (Guanidinium) 10,75
Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger AminosÀuren
Titrationskurven zeigen die AbhÀngigkeit des pH-Wertes vom VerhÀltnis Base / SÀure
Der Verlauf der Titrationskurve einer einzelnen protonierbaren Gruppe wird von der Henderson-Hasselbalchschen
Gleichung vorausgesagt. Die Titrationskurve eines Gemisches von AminosÀuren oder einer Proteïnlösung ist die Summe
der Titrationskurven der einzelnen ionisierbaren Gruppen. In der Praxis wird statt des VerhÀltnisses Base / SÀure die
Menge der zugegebenen Base gegen den pH-Wert aufgetragen. Titrationskurven zeigen anschaulich, dass bei Zugabe
einer gleich groĂen Menge Base oder SĂ€ure die pH-Ănderung im Bereich der pK-Werte gering, im Bereich der
Ăquivalenzpunkte groĂ ist. Als Faustregel gilt: AminosĂ€uren (aber auch andere SĂ€uren und Basen) puffern gut im pH-
Bereich von pK ±0,5.
pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-
protonierte Form verschiedenfarbig sind
Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pK a ĂŒber ein Intervall von 1-2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration am
pH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel des
Indikators erkannt werden.
2
In Proteïnen gelten oft andere pK-Werte, weil im Proteïnverband rÀumlich benachbarte Seitenketten sich gegenseitig beeinflussen können. Beispiel: -COO -,
NH3+-, pKNH2 steigt, pKCOO- sinkt.
- 22 -
20. Bioanalytik
Elektrophorese
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen Feld. Je nachdem,
ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur Kathode (negativer Pol) oder zur Anode
(positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung Ă€uĂern sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit und
können so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zur
Trennung von AminosÀuren, Peptiden und Proteïnen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen je
nach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder zur Anode. Wenn der
pH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung.
Die gebrÀuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine kleine Menge des
zu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getrĂ€nkten TrĂ€ger aufgetragen. Ăbliche
TrÀgermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den Elektrophorese-TrÀger wird eine Gleichspannung
angelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur rÀumlichen Auftrennung der
Komponenten, die durch geeignete AnfÀrbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können.
Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen
a) angefÀrbter Elektrophoresestreifen
b) die bei der photometrischen Auswertung der FarbbÀnder entstandene Extinktionskurve; die Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten an, die durch
Integration der FlÀchen unter den einzelnen Peaks der Extinktionskurve ermittelt werden.
Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel MolekĂŒle aufgrund
ihrer Ladung und ihrer GröĂe aufgetrennt werden. WĂ€hrend auf Agarose die SerumproteĂŻne nur in die gröĂeren Gruppen
Albumin, α1- und α2-, ÎČ1- und ÎČ2-, und Îł-Globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Dutzende verschiedener SerumproteĂŻne zu unterscheiden. AusschlieĂlich nach der GröĂe aufgetrennt werden ProteĂŻne in
der SDS-Gelelektrophorese.
Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladener
Teilchen im elektrischen Feld
Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q*E, so dass die
Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q*E/f betrĂ€gt. FĂŒr den Idealfall einer Kugel ist der ReibungskoĂ«ffiziĂ«nt
f = 6*Ïηr (r = Stokes'scher Radius, η = ViskositĂ€t des Mediums). Gl. 8 zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit
proportional zum Spannungsabfall (= FeldstÀrke = Spannung pro LÀngeneinheit des Elektrophoresestreifens, V/cm) und
proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei AminosÀuren und Proteïnen vom pH-Wert
abhĂ€ngig. Der Reibungskoeffizient f ist abhĂ€ngig von Form und GröĂe der Teilchen und von der ViskositĂ€t des Mediums.
Bei der Elektrophorese entsteht WÀrme. Die pro Zeiteinheit gebildete WÀrme H betrÀgt R*I2 (R = elektrischer
Widerstand, I = StromstÀrke). Bei der Hochspannungselektrophorese (FeldstÀrken bis einige 100 V/cm und StromstÀrken
von gegen 1 AmpĂšre) wird die entstehende WĂ€rme mit einem KĂŒhlsystem abgefĂŒhrt.
- 23 -
21. Bioanalytik
Chromatographie
Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nach
ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationÀren und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Die
verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, DĂŒnnschicht-,
Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, AffinitÀtschromatographie) und
Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu
trennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nicht-kovalente
BindungskrĂ€fte zwischen den zu trennenden Substanzen und den MolekĂŒlen der einzelnen Phasen. In der
Gelchromatographie beruht die Trennung auf der rĂ€umlich begrenzten ZugĂ€nglichkeit der verschiedenen Phasen fĂŒr
unterschiedlich groĂe MolekĂŒle. WĂ€hrend der chromatographischen Trennung werden die stationĂ€re und die mobile
Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flĂŒssigen und gasförmigen Phasen sind je
nach Chromatographietyp möglich. Eine Ăbersicht gibt die folgende Tabelle.
Phase 1 Phase 2
Typ
(stationÀr) (mobil)
H2O in Cellulosematrix des
Papierchromatographie organisches Lösungsmittel
Papiers
DĂŒnnschichtchromatographie (TLC, organische Lösungsmittel (im Gemisch
Aluminiumoxid, Kieselgel etc.
HPTLC) mit SĂ€uren oder Laugen)
Gaschromatographie (GC) Silikone auf inertem TrÀger H2, He, N2
FlĂŒssigkeitschromatographie organische Lösungsmittel (im Gemisch
Modifizierte Kieselgele, etc.
(HPLC) mit SĂ€uren oder Laugen)
Ionenaustauschchromatographie
Ladungen auf inertem TrÀger Elektrolyt (Puffer)
(IC)
Spezifischer Ligand auf
AffinitÀtschromatographie Puffer, Lösungsmittel
inertem TrÀger
Puffer im Raum innerhalb der
Gelchromatographie Puffer auĂerhalb der Partikel
Partikel
Tabelle 6 : Chromatographietypen
Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptions- oder
Gelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auch
Adsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorption
an die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert.
Der Rf-Wert ist ein MaĂ fĂŒr die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier-
und DĂŒnnschichtchromatographie
Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront.
Startpunkt bis Fleckenmitte
Rf =
Startpunkt bis Lösungsmittelfront
Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes
Der Rf-Wert ist fĂŒr eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperatur
charakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz im
gleichen Chromatogramm zuverlÀssiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem Rf-Wert
entsprechende GröĂe.
Ionenaustauscher-Chromatographie
Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlösliches
Gegenion auf einem festen TrÀger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die EnthÀrtung von Wasser,
bei der Ca2+ des âharten" Wassers gegen Na + von unlöslichem Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird.
Der entstehende Ca-Zeolith kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolith
regeneriert werden.
Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppen
enthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurer
Kationenaustauscher kann z.B. -S0 3 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO - Gruppen. Den Austausch kann
man sich folgendermaĂen vorstellen:
Harz â SO3 Na + + R â NH 3 â Harz â SO3 H 3 N â R + Na +
â + â
Harz â NH 3 Cl â + R â COO â â Harz â NH 3 OOC â R + Cl â
+ +
Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz
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22. Bioanalytik
Abbildung 10 : Trennung von zwei AminosÀuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz
Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehr
langsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalb
schneller als A1.
Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einem
Kationenaustauscher der pH-Wert oder die IonenstÀrke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich
(Gradientenelution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. Die
AminosÀuren eines Proteïnhydrolysats werden im automatischen AminosÀuren-Analysator durch
Ionenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (s. Abb. 11).
Abbildung 11 : Analyse von AminosÀuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-Harz
Die FlÀche unter jedem Signal des Chromatograms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen AminosÀure proportional.
Gelchromatographie
Vernetztes Dextran (âSephadexâ) bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das FlĂŒssigkeitsvolumen innerhalb
der Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur fĂŒr gelöste MolekĂŒle unterhalb einer bestimmten GröĂe
zugĂ€nglich. Die Verteilung von gelösten MolekĂŒlen innerhalb und auĂerhalb der Gelpartikel ist somit abhĂ€ngig vom
zugÀnglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-SÀule ist die Summe des
Volumens auĂerhalb der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens der
Gelsubstanz selbst (Vg):
Vt = V0 + Vi +V g
Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-SĂ€ule
Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhĂ€ngig von Vo und vom âVerteilungskoĂ«ffiziĂ«ntenâ Kd, der den
Bruchteil des Vi angibt, der fĂŒr die Substanz zugĂ€nglich ist.
Ve = V0 + K d âVi
Gleichung 18 : AbhÀngigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz
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23. Bioanalytik
FĂŒr groĂe MolekĂŒle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. FĂŒr kleine MolekĂŒle, die
vollstĂ€ndig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo+Vi. FĂŒr MolekĂŒle mit einem Kd zwischen 0 und 1 gilt:
V0 < Ve < (V0 + Vi )
Je nach der GröĂe der MolekĂŒle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadex
verwendet. Die gebrÀuchlichsten Typen sind:
Ausschluss-
Sephadex
Molekularmasse
G- 25 > 5.000
G- 50 > 25.000
G- 75 > 50.000
G-200 >200.000
Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele
Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von MakromolekĂŒlen. Sephadex G-50, G-75 und
G-200 werden zur Trennung verschieden groĂer ProteĂŻne verwendet. Sie dienen auch zur SchĂ€tzung der molekularen
GröĂe und damit der MolekĂŒlmasse eines ProteĂŻns. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von ProteĂŻnen mit
bekannter Molekularmasse. FĂŒr globulĂ€re ProteĂŻne ist das VerhĂ€ltnis Ve/Vo ĂŒber einen weiten Bereich umgekehrt
proportional zum Logarithmus der Molekularmasse.
Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen
Die Abb. 12 zeigt solche Kurven fĂŒr Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte MolekĂŒlmasse eines ProteĂŻns erhĂ€lt
man anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen.
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24. Bioanalytik
Photometrie
Gesetz von Lambert-Beer
Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die IntensitÀt des austretenden Lichts ( I)
kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I0). Der Quotient I/I0 wird als DurchlÀssigkeit D oder Transmission T
bezeichnet und ist abhÀngig von der Konzentration c des Farbstoffs und der Schichtdicke d: D = I/I0 = l0-k@c@d. D wird oft
in % angegeben. %D = 100*I/I0.
Ein fĂŒr photometrische Messungen gebrĂ€uchlicheres MaĂ ist die Extinktion E oder optische Dichte OD. Sie ist direkt
proportional zu c und d:
ïŁ« I ïŁ¶
E = â logïŁŹ
ïŁŹI
ïŁ· = â log D = k â c â d
ïŁ·
ïŁ 0 ïŁž
Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD)
Der ExtinktionskoĂ«ffiziĂ«nt k ist charakteristisch fĂŒr die absorbierende Substanz und ist abhĂ€ngig von der WellenlĂ€nge.
Der numerische Wert von k ist ferner abhÀngig von den Einheiten von c und d. Wird der molare Extinktionskoëffiziënt Δ
verwendet, wird d in cm und c in mol/Liter (M) angegeben. Die Dimension ist dann M-1*cm -1. Der molare
Extinktionskoëffiziënt entspricht also der Extinktion einer 1 M Lösung der betreffenden Substanz bei einer Schichtdicke
von 1 cm. Bei stark absorbierenden Substanzen ist der millimolare Extinktionskoëffiziënt gebrÀuchlicher ( ΔmM = Δ/1000).
FĂŒr Tryptophan betrĂ€gt ΔmM = 6 [mM-1*cm-1] bei 280 nm, fĂŒr ATP 15 mM-1*cm-1 bei 260 nm.
Zwischen % DurchlÀssigkeit und Extinktion besteht die Beziehung:
ïŁ« I ïŁ¶
log %D = log 100 + logïŁŹ
ïŁŹI
ïŁ· =2âE
ïŁ·
ïŁ 0 ïŁž
Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E
DurchlÀssigkeiten von 100 %, 10 %, 1 % entsprechen die Extinktionen 0, 1,0 und 2,0. Die meisten Photometer sind
mit einer %D-Skala (linear) und einer E-Skala (logarithmisch) ausgerĂŒstet.
Konzentrationsbestimmung durch Photometrie
Nach dem Gesetz von Lambert-Beer kann eine unbekannte Konzentration graphisch bestimmt werden. Zuerst werden
die Extinktionen (E1, E2, E3, E4) von Standardlösungen bekannter Konzentrationen (c1, c2, c3, c4) als Kalibrierkurve
aufgezeichnet. Die Werte sollen auf einer Geraden liegen, die durch den Nullpunkt geht. Abweichungen von der
LinearitÀt können bei höheren Konzentrationen auftreten. Die unbekannte Konzentration cx kann aus der gemessenen
Extinktion Ex auf der Kalibriergeraden abgelesen werden.
Bereich, in dem das Lambert-Beer
Gesetz nicht mehr erfĂŒllt ist
Abbildung 13 : GĂŒltigkeitsbereich des Lambert-Beer Gesetzes
Photometer und Spektralphotometer
Das Lambert-Beer Gesetz gilt nur fĂŒr monochromatisches Licht. Um eine möglichst groĂe Extinktion zu erhalten,
wird monochromatisches Licht gewÀhlt, das zur Farbe der absorbierenden Substanz komplementÀr ist.
Monochromatisches Licht wird beim Photometer durch die Verwendung eines Filters erzeugt, beim Spektralphotometer
durch ein Prisma oder ein Diffraktionsgitter.
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25. Bioanalytik
Schematische Darstellung eines Spektralphotometers
Lichtquelle Monochromator Probenraum Photoelektrischer EmpfÀnger
mit AnzeigegerÀt
Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers
1 Lichtquelle 2 Eintrittsspalt 3 Prisma oder Diffraktionsgitter 4 Drehmechanismus fĂŒr Prisma
5 Skala mit Angabe der WellenlĂ€nge 6 Austrittsspalt 7 KĂŒvette mit Lösung 8 Photozelle, wandelt Lichtimpulse in Strom um
9 Elektronischer VerstÀrker 10 Regulier-Potentiometer 11 AmpÚremeter mit %D- und E-Skala
Praktisches Vorgehen bei der Photometrie
Extinktionswerte sind keine absoluten GröĂen, sondern Relativwerte bezogen auf eine Blindprobe. Als Blindwert dient
gewöhnlich der verwendete Puffer. Vor der Messung der Extinktion E muss das Photometer mit dem Blindwert wie folgt
kalibriert werden:
1. Lichtweg schlieĂen, Photometeranzeige auf %D = 0 einstellen durch Kompensation des sogenannten
Dunkelstroms (geschieht bei neueren GerÀten automatisch).
2. Lichtweg öffnen, Blindprobe in den Lichtweg bringen, auf Photometeranzeige E = 0 einstellen durch
VerÀnderung der VerstÀrkung des Photostroms (Nullpunkt-Abgleichung, "zero adjustment").
3. Probe in den Lichtweg bringen und E ablesen.
Wird die WellenlÀnge verÀndert, so muss das Photometer wieder neu kalibriert werden, weil sich die IntensitÀt der
Lichtquelle und die Empfindlichkeit der Photozelle mit der WellenlÀnge Àndert.
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26. Bioanalytik
Enzymreaktionen
An fast allen chemischen Umsetzungen im Organismus sind Enzyme beteiligt. Enzyme sind Katalysatoren, welche die
Stoffwechselprozesse unter den milden Bedingungen in der Zelle (niedrige Metabolitkonzentrationen, niedrige
Temperatur, neutraler pH-Wert) ermöglichen.
Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms ist sein Vermögen, eine spezifische Reaktion ganz enorm zu beschleunigen
(= katalysieren). Dabei werden die Geschwindigkeiten der VorwĂ€rts- und der RĂŒckwĂ€rts-Reaktion proportional erhöht,
d.h. das chemische Gleichgewicht der Reaktion wird nicht verÀndert. Die im Reaktionsablauf verbrauchte
Verbindung bezeichnet man als Substrat, die neugebildete als Produkt. Bei der RĂŒckwĂ€rtsreaktion sind die Begriffe
vertauscht (z.B. Acetaldehyd und Ethylalkohol sind je nach Reaktionsablauf entweder Substrat oder Produkt der Alkohol-
Dehydrogenase). Enzymreaktionen lassen sich durch Bestimmung der Menge des in der Zeiteinheit gebildeten Produkts
oder des verbrauchten Substrats messen. Die reaktionsbeschleunigende Wirkung von Enzymen wird als EnzymaktivitÀt
bezeichnet.
Enzyme sind ProteĂŻne und als solche empfindlich gegen denaturierende EinflĂŒsse (WĂ€rme, SĂ€uren, Basen etc.). Die
AminosÀurensequenz und die rÀumliche Struktur verschiedener Enzyme sind heute bekannt. Die Molekularmassen Mr
liegen zwischen 104 und 106 (Beispiele: Lysozym 14.400, Phosphorylase a 390.000). Viele, aber nicht alle Enzyme
bestehen aus mehreren Peptidketten (QuartĂ€rstruktur). Denjenigen Teil eines EnzymmolekĂŒls, an den das Substrat (bzw.
Produkt) bindet und wo die katalytische Umsetzung stattfindet, bezeichnet man als aktive Stelle. Sie umfasst u.a. die an
diesen Prozessen direkt beteiligten AminosÀurereste. Bei gewissen Enzymen enthÀlt die aktive Stelle auch nicht-
proteĂŻnartige Bestandteile (prosthetische Gruppen).
Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hÀngt von folgenden Reaktionsbedingungen ab.
1. Substratkonzentration
2. Enzymkonzentration und EnzymaktivitÀt
3. pH-Wert
4. Temperatur
5. Konzentration von Inhibitoren und Aktivatoren
Die Untersuchung der AbhÀngigkeit der EnzymaktivitÀt von diesen Faktoren ist das Gebiet der Enzymkinetik.
AbhÀngigkeit der EnzymaktivitÀt von der Substratkonzentration
Im Laufe einer durch ein Enzym E katalysierten Umwandlung von Substrat S in Produkt P entstehen ein Enzym-
Substrat-Komplex ES und ein Enzym-Produkt-Komplex EP als Zwischenformen. Die Reaktionssequenz ist entsprechend:
E + S â ES â EP â E + P
Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion
Es ist schwierig, aus diesem allgemein gĂŒltigen Schema (6 Teilreaktionen) eine experimentell leicht nachprĂŒfbare
Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration abzuleiten. Zur Vereinfachung
beschrÀnkt man sich deshalb auf Bedingungen, unter denen die Reaktion nur in einer Richtung ablÀuft, d.h. die
RĂŒckwĂ€rts-Reaktion P â S vernachlĂ€ssigt werden kann. Dies ist der Fall am Anfang der Reaktion, solange die
Konzentration von P verschwindend klein ist im Vergleich zur Konzentration von S, oder unter Bedingungen, unter
denen das Produkt laufend abgefangen wird. Das Reaktionsschema ist dann:
E + S â ES â EP â E + P
Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion
Wenn man weiter darauf verzichtet, den ES- und EP-Komplex gesondert zu betrachten (nur die Geschwindigkeit der
ersten Teilreaktion, der Bildung des ES-Komplexes, ist abhÀngig von der Substratkonzentration), ergibt sich als
einfachste Formulierung:
E + S k11 â ES â E + P
kâ
Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion
wobei k1, k-1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen sind. Aus diesem Schema lÀsst sich eine
quantitative Beziehung zwischen der Anfangsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion und der
Substratkonzentration ableiten (Henry, 1903; Michaelis und Menten, 1913; Briggs und Haldane, 1925).
Die Herleitung ist wie folgt: Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration des Produkts P zunimmt, ist
d [ P]
v= = k 2 [ ES ]
dt
Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung
Da v am Anfang der Reaktion, (d.h. solange die Substratkonzentration sich nicht merkbar verÀndert hat) konstant
bleibt, folgt aus Gl. 21, dass ES ebenfalls konstant ist. Dies bedeutet, dass die Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeiten
von ES gleich groĂ sind (= Fliessgleichgewichtszustand). Daraus folgt:
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27. Bioanalytik
k1 [ E ][ S ] = ( k â1 + k 2 )[ ES ]
Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion
Wir setzen fĂŒr [E] = [Et]-[ES] ein, wobei [Et] die messbare Gesamtkonzentration des Enzyms darstellt. Eingesetzt in
Gl. 22 erhalten wir fĂŒr [ES]
k1 [ Et ][ S ]
[ ES ] =
k â1 + k 2 + k1 [ S ]
Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22
Gl. 23 können wir jetzt in Gl. 21 einsetzen, d.h. wir drĂŒcken die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion als
Funktion der gesamten Enzymkonzentration und der Konzentration des freien Substrats aus:
k 2 k1 [ E t ][ S ]
v = k 2 [ ES ] =
k â1 + k 2 + k1 [ S ]
Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion
Gl. 24 ist bereits die gesuchte Geschwindigkeitsgleichung fĂŒr unsere Enzymreaktion, wenn auch noch nicht in der
ĂŒblichen Form. Diese erhalten wir, indem wir ZĂ€hler und Nenner durch k 1 teilen:
k 2 [ Et ][ S ] V [S]
v= = max
k â1 + k 2 Km + [S]
+ [S]
k1
Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung
Dieses ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion unter
der Annahme des Fliessgleichgewichts. Die Konstanten Km und Vmax sind definiert als
k â1 + k 2
Km =
k1
Vmax = k 2 [ Et ]
Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung
Km wird Michaeliskonstante genannt. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, die bei der Konzentration [Et] erreicht
werden kann. Sie entspricht dem Zustand, wo alle EnzymmolekĂŒle als ES vorliegen, also [ES] = [Et]. Weil bei
Enzymreaktionen [Et] << [St], kann man in Gl. 25 fĂŒr [S] die Gesamtkonzentration des Substrats einsetzen.
Nach Gl. 25 ist v eine hyperbolische Funktion von [S].
Abbildung 15 : AbhÀngigkeit der AktivitÀt von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung)
Bedeutung von Km und Vmax
Die Michaelis-Menten-Gleichung liefert eine Arbeitsdefinition von Km. Km hat die Dimension einer Konzentration und
entspricht numerisch derjenigen Substratkonzentration, bei welcher bei gegebener Enzymkonzentration die halbmaximale
Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird (Substitution von v = Vmax/2 in Gl. 25 ergibt Km = [S]). Km kann als reziprokes
MaĂ der âAffinitĂ€t" von S zu E aufgefasst werden. Je gröĂer die AffinitĂ€t eines Substrats zum Enzym ist, desto kleiner ist
die zum Erreichen der halbmaximalen Umsatzgeschwindigkeit benötigte Substratkonzentration, d.h. ein kleines Km
entspricht einer groĂen âAffinitĂ€t" und umgekehrt. Es muss allerdings betont werden, dass Km nicht die
Dissoziationskonstante Kd = k-1/k1 des Enzym-Substrat-Komplexes darstellt. Wie der obere Teil der Gl. 26 zeigt, ist Km
durch drei Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Lediglich im Spezialfall k2 << k-1 wird der numerische Wert von Km
etwa gleich demjenigen von Kd der Reaktion E + S â ES. In allen andern FĂ€llen ist Km > Kd.
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