El Western blot es una técnica analítica que permite detectar proteínas específicas en una muestra. Involucra la separación de proteínas mediante electroforesis en gel, su transferencia a una membrana, y la detección de la proteína de interés usando anticuerpos específicos. Es una técnica fundamental en biología molecular, bioquímica e inmunología para estudiar la presencia y cantidad de proteínas.

1. Western blot
El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo
al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una
membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la
proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.[1] [2] Finalmente, se detecta la
unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia... De esta forma se
puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a otras proteínas.
Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la
biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una
industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra
decenas de miles de proteínas diferentes.[3] [4]
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de
Stanford.[2] El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal
Burnette,[5] y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa
DNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor,
Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el
Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern
blot.
Antecedentes
Antes de la aparición del Western blot, ya existían diversas técnicas capaces de detectar
un antígeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, la
inmunodifusión doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitación...
La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975,
Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos
separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permitía el análisis de una
mezcla compleja de moléculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de
restricción.[6] Se desarrolló así el Southern blot, usando el nombre del descubridor como
epónimo; es por ello que tanto esta técnica como sus derivadas (Western blot, Northern
blot...) se escriben con mayúscula.
Más tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz de
unirse a proteínas. Ya en 1986, Millipore desarrolló la primera membrana de PVDF
diseñada para la transferencia de proteínas, la membrana de transferencia ImmobilonTM
PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia Immobilon-PTM para
diferenciarse de otras membranas.

2. Pasos del Western blot
Preparación de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción.
Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para
grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras
pequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las
proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.[7]
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También
pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y
solubilicen las proteínas. A veces se añaden inhibidores de proteasas y
fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las
proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.[8]
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización
proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso
combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.
Electroforesis en gel
Artículo principal: Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en
función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto
isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende
del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas
sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras
secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol
(SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo,
la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden
separarse únicamente en función del tamaño.

3. [editar] Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere
desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta
transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de
unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con
idéntica afinidad):
las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza
de las interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se
trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófóba.
en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y
de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser
humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos,
debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también
más frágiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas
a varias pruebas consecutivas.[9]
También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusión simple
En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel
electroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro.
Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el
papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán
retenidas en ella.
Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteína
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.

4. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificación que permite obtener
múltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias
pruebas sobre geles virtualmente idénticos. Esta modificación es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de proteína.[10] [11]
Transferencia al vacío
En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de
secado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de
la membrana de nitrocelulosa.[12] Este método es válido tanto para proteínas de alto
como de bajo peso molecular.[11]
Electrotransferencia
Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar
las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los
siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, varios
papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más papeles de
filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se
dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud
acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se
desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.[1]
Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue
(un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del
material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la
velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere
(especialmente en comparación con las otras técnicas).
Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica,
es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En
caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede

5. unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno que se forma
con la proteína que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de
albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche en
polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón X-
100. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la
membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el
anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y
los falsos positivos.
Detección
En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína.
Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en
presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta
forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la
detección en un único paso, lo cual es útil en ciertos campos.
Método en dos pasos
Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo
primario y la del anticuerpo secundario.
¡ Anticuerpo primario
El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína
buscada. Éste se consigue inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regiones
capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una
cabra) o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante la
electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca específicamente la proteína
desnaturalizada. La presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuesta
inmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en este caso, ya
que reconoce la proteína.

6. Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con una
disolución de anticuerpo primario (0,5 - 5 μg/ml). La disolución consiste en un tampón
salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una
pequeña fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o leche
en polvo. La membrana junto con la disolución pueden ser introducidas en una pequeña
bolsa de plástico. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La
temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas
temperaturas favorecen las uniones más específicas.
¡ Anticuerpo secundario
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se
expone al anticuerpo secundario. Éste reconoce de forma específica una región concreta
del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unión a biotina, a
una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP), etc.).
Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de
origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratón" es aquel capaz de
reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas,
por permitir a un laboratorio compartir una única fuente de anticuerpos secundarios; y
dan resultados mucho más consistentes.
También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.
Radiactividad
Unión del anticuerpo primario a la proteína de interés. A este se une la proteína A o la
proteína G para ser detectada.
Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en proteínas de unión
a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta proteína puede ser, por ejemplo, la
proteína A de Staphylococcus aureus[13] o la proteína G[14] marcadas con 125I (un isótopo
radiactivo de yodo). Las proteínas mencionadas tienen la capacidad de unirse a
anticuerpos de forma inespecífica, por lo que se unirán al primario.

7. Este método apenas se usa actualmente, por ser significativamente más caro, peligroso y
lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que
permiten una precisa cuantificación; y la imagen autoradiográfica puede ser reproducida
fácilmente y con gran precisión para su publicación.[11]
Anticuerpo unido a una enzima
Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rábano, de modo que puede catalizar la
reacción quimioluminiscente.
Un mecanismo de detección simple y rápido consiste en unir al anticuerpo secundario
enzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble.
De esta forma, en el posterior análisis quedará una mancha allí donde esté la proteína de
interés. Enzimas como la peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina son
válidas para este mecanismo.[11] Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidación
del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de peróxido de hidrógeno. El resultado es que
el primero forma una mancha de precipitado oscura.[15] Otras técnicas, como ELISA o
ELISPOT, también emplean este método de detección.
Otro método más sofisticado consiste en la unión de una enzima que catalice una
reacción quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas también son válidas en
este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la
peroxidasa, cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. La
fosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del adamantil-1-2-dioxetano fosfato,
reacción que genera luz. Si se coloca una película fotográfica sobre la membrana, la
exposición a la luz que se desprende en la reacción permite detectar la actividad
enzimática.
Marcaje fluorescente
Otro método basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos
del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o
el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado estático)
cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detección muy precisa y una
cuantificación del antígeno más exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza
durante un estado dinámico.

8. El rojo Nilo no es puede usarse para teñir bandas en membranas de PVDF; sin embargo
es posible realizar la tinción en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana
de PVDF. Esto último presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tinción
del gel para comprobar la transferencia proteica.[16]
Sistema avidina/estreptavidina
Otra opción es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a moléculas de
biotina. Después la detección se llevará a cabo con una proteína de unión a la misma,
como la estreptavidina o la avidina.
Detección con oro
Otra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerpos
primarios con proteína A unida a partículas de oro. El resultado es una membrana con
manchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la proteína.[17] La sensibilidad del
método puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata: el oro cataliza la
reducción de los iones plata a plata metálica en presencia de otro agente reductor, como
la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio
óptico. Se consigue así una sensibilidad comparable a la de las técnicas radiactivas.[11]
[18]
Método en un paso
Históricamente la detección se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que
supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece
a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y añade
un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los análisis de
proteínas de alto rendimiento y los menores límites de detección ha crecido el interés
por desarrollar sistemas de detección en un solo paso que aumentarían la rapidez del
proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que
reconozca al mismo tiempo la proteína de interés y una "etiqueta" detectable. Se incuba
de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de
lavados, ya se puede detectar directamente.
Análisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas
que sí se han unido a la proteína de interés.
Detección colorimétrica
La detección colorimétrica depende de la incubación del Western blot con un sustrato
que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al
anticuerpo secundario. Pasa así de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de
otro color que precipita cerca de la enzima tiñendo así la membrana. Se procede después
a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificación proteica se evalúa por
densitometría (cuan intensa es la mancha) o por espectrometría.

9. Detección quimioluminiscente
La detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con un
sustrato, que emitirá luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el
anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una película fotográfica o, más
recientemente, por cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se
analiza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en términos de densidad óptica. Actualmente hay programas que
permiten realizar análisis más profundos si se aplican ciertos estándares, como la
obtención del peso molecular.
] Detección radiactiva
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos; en su lugar se coloca
una película fotográfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador
provoca la aparición en ella de regiones oscuras. Éstas se corresponderán con las bandas
de las proteínas de interés. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han
provocado su desuso en los últimos tiempos.
Detección fluorescente
En la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica de
éstos que les provoca una excitación. Ésta es detectable por un fotosensor, como una
cámara CCD equipado con los filtros de emisión apropiados. Se consigue así una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular
o la cuantificación proteica. La fluorescencia es considerada uno de los métodos de
análisis más sensibles.
Exploraciones secundarias
Una característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es
su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros
anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de
nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminación de los anticuerpos,
permitiendo más reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide
continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,
el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser
usado. Además, las membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a
los daños durante su uso.

10. [Aplicaciones
Investigación
Actualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la
biología molecular.[19]
Diagnóstico
Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un
resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la
prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los
anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una
membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH.
Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso
es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos
anti-VIH en el suero, serán estos los que realizen el papel de anticuerpo
primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se
vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-
señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el
suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la
presencia del FIV en gatos.
[
Enlaces externos
Métodos de transferencia de proteínas a filtros - Universidad de Barcelona
Referencias
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