Ingeniería de Proteínas, diferentes acercamientos para el desarrollo de proyectos en Biotecnología Avanzada.

1. Ingeniería de
proteínas
L.B.G. José Eduardo Almeyda Carbajal
Asesor en el desarrollo de nuevos productos. CEMEX-México
17 de mayo de 2014

2. Índice
Diseño Racional Diseño No Racional
Diseño guiado por datos o
información

3. $50 por contar todos los puntos rojos

4. ¿De qué estamos hablando?
Producto Producción Anual
(Tons)
Producto Producción Anual
(Tons)
Bioetanol 26,000,00 L-Hydroxifenilalanina 10,000
Ácido L-Glutámico 1,000,000 Ácido 6-
aminofocelanico
7000
Ácido cítrico 1,000,000 Nicotinamida 3000
L-Lisina 350,000 D-p-hidroxifenilglicina 3000
Ácido láctico 250,000 Ácido 7-
aminocefalosporinico
1000
Enzimas de
procesamiento de
alimentos
100,000 Aspartame 600
Ácido glucónico 50,000 L-metioninca 200
Antibióticos 35,000 Dextran 200
Enzimas para
alimentación animal
20,000 Vitamina B12 12
L-Treonina 10,000 Provitaina D2 5
Producto Mercado
(Millones US$)
Eritropoyetina 6803
Insulina 4017
Factores de coagulación sanguínea 2585
Factor estimulador de colonias 2181
Interferon b 2087
Interferon a 1832
Anticuerpos monoclonales (Cáncer) 1751
Hormona de crecimiento 1706
Antircuerpo monoclonal 1152
Activador de plasminógeno 642
Interleucina 184
Factor de crecimiento 115
Vacunas 50
Otros 2006

5. Necesaria y divertida introducción
Catálisis Reguladoras Estructural
Defensa Transporte Receptoras

6. Necesaria y divertida introducción

7. Necesaria y divertida introducción

8. ¿Y la introducción era para?

9. Ingeniería de proteínas
La ingeniería de proteínas, como un sub-disciplina de la
ingeniería genética, consiste en el diseño de nuevas
proteínas o en la generación de proteínas con funciones
nuevas o deseadas.
Solvente Proteína
mágica
Mezcla
mágica
Exceso de
proteína
mágica

10. Lindo, muy lindo ¿Cómo se hace?
Diseño racional
Diseño No Racional
(Evolución Molecular Dirigida)
Diseño de proteínas dirigido por datos o
información

11. Diseño racional
Resonancia Magnética Nuclear Difracción de rayos X
La visualización de determinados dominios o estructuras en las proteínas nos permite
determinar cuales podrían convertirse en sustituciones candidatas a ser realizadas en la
misma, además del posible efecto sobre la característica a modificar en nuestra proteína.
Microscopía electrónica

12. Circulo de la racionalidad

13. Pero ¿Cómo le hacemos para racionalizar?

14. Variante: Proteína de novo
Algunas estructuras de uso
común en esta estrategia
incluyen el uso de los motivos
como “Ramillete de cuatro
hélices a” (Generación de
canales de protones), “Hélice-
bucle-hélice” (reducción de
tamaño del dominio de unión
de inmunoglobulina G) y dedo
de zinc.

15. Método racional: Casos de la vida real
Proteína nativa Modificación Motivo
Isomerasa de triosafosfato Mutación puntual de ácido
glutámico a glutamina
Termoestabilidad de 37oC a
26oC
Fitasa con estructura de
hélice de Bacillus sp. MD2
Mutaciones punctuales
E229V y S283R)
Incremento de actividad
específica
Proteína de unión a
ribosoma
Rediseño completo Cambio de actividad
(Isomerasa de triosafosfato)
- Usos de péptidos
helicoidales
Proteínas diiron
El problema con el diseño racional es su dificultad de
aplicación si se carece de la estructura tridimensional de
la proteína.

16. Diseño NO racional
Simula el proceso Darwiniano de
evolución, mediante la
combinación de mutagénesis al
azar y/o técnicas de
recombinación de DNA con
técnicas de screening o selección
de variantes de proteínas que
hayan incorporado las
propiedades deseadas

17. Pasos no racionales
1
„ Introducción de mutaciones en la
secuencia
2
„ Screening y selección de variantes
identificadas con el fenotipo necesario.
3
„ Recombinación entre variantes
seleccionadas para producir nuevas
combinaciones

18. Recomendaciones del tío Darwin
Función físicamente posible
La función debe ser biológica o evolutivamente factible.
Debe ser posible construir librerías de mutantes lo
suficientemente complejas
Método rápido para el screening o selección de las
proteínas

19. Darwin’s ways
Método Descripción
Mutagénesis por
saturación
Un aminoácido en determinada posición de una proteína es
cambiado por cada uno de los aminoácidos naturales a fin de
encontrar cual de ellos otorga propiedades de interés a la proteína
analizada.
Mutagénesis aleatoria
localizada o de región
específica”
Representaría una combinación entre las estrategias Racional y no
Racional, en el que los cambios aleatorios se realizan en regiones
específicas de una proteína.
DNA shuffling Un grupo de genes con un DNA de doble cadena o secuencias
similares son obtenidos por varios organismos o producidos por la
técnica de PCR propenso a error
Duplicación de genes Se vale de los mecanismos de divergencia naturales que se ejercen
sobre aquellos duplicados bajo una presión selectiva más laxa

20. Aplicaciones (Si, otra tabla)
Objetivo Enzima Resultado Método Referencia
Enantioselectividad Epóxido
hidrolasa
Incrementada 13
veces
epPCR; DNA
shuffling
van Loo et al.
(2004)
Incremento en la
promiscuidad de la
actividad
Anhidrasa
carbónica
Incrementada 4
veces con 2-naftil
acetato
Mutagénesis-
Recombinación
Gloud & Tawfik
(2005)
Eficiencia catalítica N-
acetiltransferasa
de glifosato
Incrementada
10,000 veces
11 rondas de DNA
shuffling
Castle et al. (2004)
Termoestabilidad Xilanasa Tm incrementada
35oC
Mutación por
saturación de sitio
Palackal et al.
(2004)
Estabilidad en
solventes orgánicos
Subtilisina E Incrementada 170
veces en 60% de
dimetilformamida
Error-prone
PCR+Screening
Chen & Arnold
(1993)
Resistencia contra
cetotaxima
b-lactamasa Incrementada
32,000 veces
DNA shuffling Stemmer (1994)

22. Diseño guiado por datos o información
Utiliza secuencias aminoacídicas de las bases de datos y
busca coincidencias entre las proteínas de una misma
familia u homólogas, donde, se afirma que el aminoácido
en la secuencia original debe ser mutado al aminoácido
compartido por la mayoría de las secuencias homólogas

23. Vamos a mezclar a ver que sale
Concepto consenso
guiado por
estructura
Diseño
Racional
Diseño de proteínas
dirigido por datos o
información

24. Formula mágica
Determinación
de
aminoácidos
del sitio de
interés a
modificar
Búsqueda de
secuencias
de proteínas
con el
dominio de
interés en
bases de
datos
Construcción
de matrices
de
frecuencias
de los
aminoácido
s del sitio de
interés
Introducción
de las
modificaciones
mediante el
uso de las
técnicas del
Diseño
Racional

25. No más “tablas”
„ Glucosa deshidrogenasa
„ Fitasas procedentes del género
Aspergillus y Bacillus
Termoestabilidad
„ Fitasas del tipo ácidas de histidina
de hongos o de fitasas con
estructura de hélice de bacterias
Actividad de
enzima
„ Cambio en la dependencia de NAD
a NADP de lactato deshidrogenasa
Cambio de
cofactor

26. Momento de entrar a
internet procurando no
caer en Facebook

27. Base de Datos de Proteínas o PDB
Depósito de información de la estructura tridimensional
de macromoléculas biológicas obtenida de manera
experimental (Resonancia Magnética Nuclear,
Microscopio electrónico y Rayos X).
Archivo
PDB
RCSB-
PDB
MSD-EBI PDBj BMRB

28. Adivinen qué… UNA TABLA
Método
experimental
Proteínas Ácidos
nucléicos
Complejos
ácidos
nucléicos
proteínas
Otros Total
Difracción de
rayos X
82537 1517 4296 4 88354
NMR 9139 1078 206 7 10430
Microscopía
electrónica
523 52 173 0 748
Híbrido 59 3 2 1 65
Otro 155 4 6 13 178
Total 92413 2654 4683 25 99775

29. Sandra digo, BRENDA
BRaunschweig ENzyme DAtabase” o BRENDA consiste en
una base de datos se ofrece una visión representativa de las
características y variabilidad de cada enzima, a partir de la
cual el usuario puede referirse a la literatura original para un
estudio más detallado

30. Pfam: Su familia
Amplia colección de
familias de proteínas
(14831 familias de
proteínas hasta marzo del
2013).
Componentes
Pfam A
Pfam B

31. BioEdit
Consiste en una herramienta para el análisis,
alineamiento, edición y manipulación de secuencias
de aminoácidos y nucleótidos
Visualización de
códigos de colores
Generación e
impresión de
cromatogramas
Generación de
dibujos de
plásmidos
Agrupación de
secuencias
Vsualización
rudimentaria de
arboles
filogenéticos
Construcción de
secuencias
consenso
integradas

32. Como en show de cocina

33. Swiss-PDB-Viewer
Herramienta de visualización y análisis de la
estructura de proteínas y ácidos nucléicos.

34. HotSpot Wizard

35. ¿Cómo ocurre magia?

36. Aún no es todo automático
Asignación de los residuos
catalíticos.
Interacción de subunidade
Datos insufientes

37. Se puso caprichoso el Java

38. Muchas gracias por su
atención
Presentación con certificación de: