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Purificación de proteínas
PurificaciónProceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o mol...
Condiciones generales a evaluar• Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a misobjetivos)        secuenciación, crista...
Pasos a seguir en una purificación1. Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad   biológica) (e...
1 Actividad BiológicaCantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.Este cambio puede se...
De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como :Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de...
2 Elección de la FuenteMatriz donde se encuentra la proteína de interés• Concentración• Accesibilidad• Costo• Facilidad de...
3 Extracción de la proteína de la fuenteLisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzasmecánicas. Para ...
4 EstabilizaciónFactores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento1 PH2 Grado de oxidación (-SH)3 Presencia de M...
5 Aislamiento y concentración              Fraccionamiento del extracto crudo• Implica una serie de pasos en los cuales se...
Solubilidad diferencial             Cromatografía de intercambio iónico                 Cromatografía de absorción        ...
Monitoreo del proceso de fraccionado• Actividad Específica    AE = Unidades totales en la fracción i                      ...
Actividad vs Actividad específica
1800                                        110                                         AE                    1600        ...
2600                                                 100                                     Actividad total              ...
Fraccionamiento por desnaturalización                (precipitación diferencial)• Temperatura
• PH: PI                    Salting-in• Fuerza iónica( I = 0.5Σ miZi2)
Salting-out: Sultafo de amonio            Fosfato de potasioFormas de obtener la precipitación- en forma de producto seco-...
• Uso de solventes orgánicos: modifican D (constante dieléctrica) ehidratación         Etanol         Acetona         buta...
Fraccionamiento por campo eléctrico                          (electroforésis)Movilidad electroforética =    f = coeficient...
Electroforesis en papel
Electroforesis en gel de poliacrilamida                (PAGE)                                    A PH = 8 - 9
1              2             3         4q/m     =      q/m       =   q/m   =   q/m      Efecto “colador”
PAGE SDS                    SDSMovilidad = 1/ PM
Tipos de Electroforesis• PAGE Nativa• PAGE SDS• PAGE + condiciones reductoras• Isoelectroenfoque• Bidimensional
Determinación de PM
Isoelectroenfoque
Bidimensional
T15 purificacion
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T15 purificacion

  1. 1. Purificación de proteínas
  2. 2. PurificaciónProceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o molécula de interés
  3. 3. Condiciones generales a evaluar• Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a misobjetivos) secuenciación, cristalización ensayo de actividad, productos alimenticios médicos• Cantidad técnicas de alta capacidad y de baja capacidad preparativas analíticas• Costos
  4. 4. Pasos a seguir en una purificación1. Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad biológica) (específico, sensible, rápido y barato)2. Elegir la fuente (matriz biológica)3. Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o extracelulares)4. Estabilización de la molécula5. Aislamiento y concentración (fraccionamiento)6. Determinar la pureza y calidad del producto final
  5. 5. 1 Actividad BiológicaCantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.Este cambio puede ser:• Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)• Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una reacción)
  6. 6. De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como :Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de proteína que produce una determinada cantidad de “efecto”1. Toxina Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones…)2. Enzima Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98 moles de producto en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)
  7. 7. 2 Elección de la FuenteMatriz donde se encuentra la proteína de interés• Concentración• Accesibilidad• Costo• Facilidad de la extracción
  8. 8. 3 Extracción de la proteína de la fuenteLisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzasmecánicas. Para bacterias y células vegetales: lisozimas u otras enzimasMolienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivasUltrasonido: sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra
  9. 9. 4 EstabilizaciónFactores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento1 PH2 Grado de oxidación (-SH)3 Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes4 Polaridad y fuerza iónica de la solución5 Presencia de proteasas6 Temperatura5 Actividad de la molécula
  10. 10. 5 Aislamiento y concentración Fraccionamiento del extracto crudo• Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechanpropiedades fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interéspara separarla del resto de las moléculas• Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar elrendimiento en la purificación, pureza y actividad específica de cadafracción obtenida.• Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en generalse recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir conlas de baja capacidad.• En general se desea obtener una gran pureza (según losobjetivos) acompañada de un gran rendimiento.
  11. 11. Solubilidad diferencial Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de absorción Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de afinidad Electroforesis IsoelectroenfoqueResolución Capacidad
  12. 12. Monitoreo del proceso de fraccionado• Actividad Específica AE = Unidades totales en la fracción i Total de proteínas en la fracción i• Rendimiento R = Unidades totales en la fracción i Unidades totales en la fracción original• Porcentaje de purificación P = AE en la fracción i AE en la fracción original
  13. 13. Actividad vs Actividad específica
  14. 14. 1800 110 AE 1600 Purificación 100 1400 Rendimiento 90 1200AE y Purificacion 1000 80 Rendimiento 50 70 40 60 30 50 20 40 10 0 30 1 2 3 4 5 6 pasos
  15. 15. 2600 100 Actividad total 2400 Actividad por mililitro 2200 80 2000 Actividad por mililitroActividad Total 1800 60 1600 1400 40 1200 1000 20 800 600 0 0 1 2 3 4 5 6 X Data Pasos
  16. 16. Fraccionamiento por desnaturalización (precipitación diferencial)• Temperatura
  17. 17. • PH: PI Salting-in• Fuerza iónica( I = 0.5Σ miZi2)
  18. 18. Salting-out: Sultafo de amonio Fosfato de potasioFormas de obtener la precipitación- en forma de producto seco-en forma de sn saturada de la salTanto si se trabaja con el precipitado o con el sobrenadante esta técnica engeneral va seguida de una técnica de “de-salado”
  19. 19. • Uso de solventes orgánicos: modifican D (constante dieléctrica) ehidratación Etanol Acetona butanolProducen algo de desnaturalización. Requieren de bajas temperaturas
  20. 20. Fraccionamiento por campo eléctrico (electroforésis)Movilidad electroforética = f = coeficiente de fricción = A η Para una esfera A = 6 π r V=4/3 Π r3 Vesp = V/PM
  21. 21. Electroforesis en papel
  22. 22. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) A PH = 8 - 9
  23. 23. 1 2 3 4q/m = q/m = q/m = q/m Efecto “colador”
  24. 24. PAGE SDS SDSMovilidad = 1/ PM
  25. 25. Tipos de Electroforesis• PAGE Nativa• PAGE SDS• PAGE + condiciones reductoras• Isoelectroenfoque• Bidimensional
  26. 26. Determinación de PM
  27. 27. Isoelectroenfoque
  28. 28. Bidimensional

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