1. BLOQUE III. MICROORGANISMOS PROCARIOTICOS
III.C. GENÉTICA BACTERIANA
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.
Variaciones Bacterianas. Mutaciones.
Tema 15. Recombinación.
Tema 16. Transferencia de material genético en bacterias:
Transformación. Conjugación. Transducción.
Tema 17. Ingeniería genética. Técnicas y Aplicaciones.
2. Tema 16. Conjugación.
1. CONCEPTO Y APROXIMACION HISTORICA
-Experiencia de Lederberg y Tatum
-Experiencia de Davis
-Experiencia de Lederberg y Hayes
2. DESCRIPCION DEL PLASMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICAS
Estructura física
Organización genética y funcional
Procesos de integración y escisión del plásmido F
3. FASES DE LA CONJUGACIÓN
-Contactos entre las células
-Transferencia del DNA
F+ x F- ----- F+, Hfr
Hfr x F- ----- F-
F' x F- ----- F', Hfr
-Estado del DNA donador en la célula receptora
4. APLICACIÓN DE LA CONJUGACIÓN EN EL LABORATORIO
3. 1. CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA
Conjugación: Transferencia de material genético
entre dos bacterias vivas, donadora y aceptora,
a través de un contacto físico
Transferencia de ADN plasmídico
Donador
Transferencia de ADN cromosómico
Receptor
4. 1.Experimento de Lederberg Mutantes auxotrofos
y Tatum (1946) A B
- Escherichia coli K12
•Aparición de
colonias con
frecuencia muy
superior a la de
doble reversión Prototrofos
RECOMBINACIÓN
Medios mínimos sin metionina,
biotina, treonina, leucina
5. 2. Experimento de Davis
E. coli K12
A A B B
Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-
4h
No crecimiento
6. 2. Experimento de Davis
E. coli K12
A A B B
Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-
Las células necesitan contactar físicamente
4h
Bio+ met+ thr+ leu+
Sin filtro Prototrofas
7. 3. Experimento de Lederberg y Hages
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Célula donadora Célula receptora
fértil F+ no fértil F-
Factor sexual F+ Receptores pili
Plásmido F OmpA
(genes para los pili)
8. 3. Experimento de Lederberg y Hages
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Célula donadora Célula receptora
fértil F+ no fértil F-
Factor sexual F+
OmpA
Receptores pili
9. 3. Experimento de Lederberg y Hages
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Célula donadora Célula receptora
fértil F+ no fértil F-
Factor sexual F+
F+ F- F+ F+
F+ ~ (100%)
Frecuencia recombinación (10-5)
(la auxotrofía desaparecía rara vez)
10. Estructura física, organización genética y funcional
del plásmido F
25 genes
(33Kb)
Región tra
-biosíntesisPlásmido F
y ensamblaje de pelos sexuales
-estabilización de los agregados de conjugación
100 Kb
-regulación genética de la transferencia
-proteínas que tapan las porinas ompA
(fenómeno de exclusión de superficie)
11. Estructura física, organización genética y funcional
del plásmido F
Región tra
Plásmido F
100 Kb
Región de replicación:
ori V y ori T
12. Organización genética y funcional del plásmido F
Región tra
Región de integración del plásmido en
el cromosoma y de su escisión.
Región de replicación:
ori V y ori T
13. Integración del plásmido F en el cromosoma
F+ Hfr
autónomo F+ Hfr
integrado
Recombinación homóloga
(RecA)
15. Escisión del Plásmido F
Hfr F’
Separación del
plásmido F llevándose
parte del cromosoma
bacteriano
Gen cromosómico
Plásmido F
16. Posibles situaciones del plásmido F
F’
F+ Hfr
autónomo integrado
Autónomo
(con un fragmento
cromosoma)
17. 3. Fases de la conjugación
1. Contactos entre células fértiles y células infértiles
Célula F+
Célula F-
1-10 pelos sexuales
F+ OmpA
Hfr
F’
18. 1. Contactos entre células fértiles y células infértiles
Cromosoma
bacteriano Plásmido F
Pili
OmpA
Célula F+ El pelo se despolimeriza
Célula F-
El pili se retrae
oriT
Genes tra
Puente conjugativo
19. 2.Transferencia y procesamiento del DNA conjugativo
a) Transferencia entre células F+ y F-
Genes tra
oriT
Endonucleasa Inicio síntesis de la
helicasa cadena complementaria
en célula receptora
Final transferencia DNA
Separación células
TODA LA POBLACIÓN F+
20. a) Transferencia entre células F+ y F-
F+ F- F+ F+
oriT
TODA LA POBLACIÓN F+
b) Transferencia entre células Hfr y F-
Hfr F- Hfr F-
Ori T
tiene un fragmento del DNA plasmídico y cromosómico
con el cual puede recombinar o degradar
22. Cruces posibles
•F+ X F-→ F+
•Hfr X F-→ Hfr + F-
•F’ X F- → F’
Cruces no viables (exclusión superficial)
F+ X F+ F+ X Hfr F+ X F’
F’ X F’ F’ X Hfr
Hfr X Hfr
23. FASES DE LA CONJUGACIÓN
1.- Contactos entre las células
2.- Transferencia del DNA
24. 4. Aplicación de la conjugación en el laboratorio
Construcción de mapas cromosómicos
(actualmente por secuenciación)
Ingeniería genética
25.
26. Tema 16. Transducción.
1. Concepto y aproximación histórica
2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
3. Tipos de transducción
Transducción generalizada
-características
-mecanismo
Transducción especializada
-características
-mecanismo
4. La transducción en la naturaleza y en el laboratorio
27. 1. Concepto y aproximación histórica
Transducción: Transferencia de material genético
en la que el DNA exogenote es vehiculizado desde
la célula donadora a la aceptora a través de un
bacteriófago
28. Norton Zinder y Joshua Lederberg
Salmonella typhimurium
Células A ++ -- x Células B -- ++
Células A ++ -- x Filtrado del cultivo de las células B -- ++
Células A ++ -- separadas por filtro Células B -- ++
Medio de cultivo deficiente en
bio, met, tre, leu, etc.
+ DNAsas
Prototrofos
En todos los casos hubo crecimiento de colonias recombinantes
29. Proceso de transferencia genética
Transducción mediada por un virus
1. No se requiere contacto célula-célula
2. No se afecta por la DNAasa
3. Agente de transferencia atraviesa el
material poroso (bacteriófago)
4. La recombinación solo ocurre con
células receptoras que tengan sitios
receptores para el virus
Medio de cultivo deficiente en
bio, met, tre, leu, etc.
+ DNAsas Prototrofos
30. 2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
31. 2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
Fagos virulentos Fagos atemperados o moderados
Ciclo lítico Ciclo lisogénico
Adsorción
Penetración
inducción
Lisis
Ensamblaje Síntesis de ácidos
nucleicos y proteínas
34. La transducción no siempre va seguida de
recombinación del DNA exogenote en la
célula receptora
Recombinación DNA no se recombina
homóloga o
generalizada Supervivencia
a)Transducción abortiva
DNA se recombina DNA donador
Degradación
Transferencia
génica estable
b)DNA transductante muy diferente
(sistemas modificación-restricción)
35. 2.Transducción especializada
Recombinación específica de sitio
Ciclo lisogénico
Adsorción
Penetración
Lisis Integración del DNA fago
Ensamblaje Síntesis de o
Fagos atemperados ácidos Profago Bacteria lisogénica
nucleicos y proteínas
moderados
36. 2.Transducción especializada Fago lambda
Recombinación específica de sitio
- Entre secuencias idénticas
(sitios de fijación “att”)
- No interviene RecA
Escherichia coli
Integrasa
(int)
Fagos atemperados o
moderados
37. Recombinación específica de sitio
ATAT
λ A TAT
TATA
TAT A
integrasa
ATAT A TAT
E.coli
TATA TAT A
ATAT ATAT
TATA TATA
40. Escisión defectuosa
a) Entrecruzamiento para integrar
genes bacterianos
Cromosoma bacteriano que contiene DNA del dador
gal+
Fagos defectivos
b) Integración como profago
Cromosoma bacteriano que contiene DNA viral y del
dador
Bacteriofago + gal+
Infección célula
receptora No dan ciclos líticos
41. TIPOS DE TRANSDUCCIÓN
1. TRANSDUCCIÓN 2. TRANSDUCCIÓN
GENERALIZADA ESPECIALIZADA
a) Fagos con ciclo lítico a) Fagos con ciclo lisogénico
(virulentos) (atemperados)
b) Se transfiere con igual b) Se transfieren zonas concretas
probabilidad cualquier del cromosoma
región del cromosoma
c) Se produce por escisión del
c) La eficiencia de la profago y consiguiente entrada a
transducción para cualquier fase lítica
marcador cromosómico es
muy baja d) El DNA genómico de la bacteria
va unido al DNA del fago
d) El DNA transferido puede
sufrir recombinación
generalizada
42. Transducción en la naturaleza y en el laboratorio
En la Naturaleza: tiene importancia como
mecanismo de intercambio genético
En el Laboratorio: clonaje de genes,
construcción de mapas genéticos y librerías
genómicas
