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EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS:
     EL PASADO Y EL PRESENTE
   CURSO: BIOQUÍMICA II
   DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica.
   INTEGRANTES:
             Apaza Gonzales, Pamela
             Fernández Lugo, Ana Cecilia
             Huamán Benites, angie
             Miguel Buendía, Rosaura
             Pozo Cuya, Mireya
             Uribe Pinta, Elizabeth
             Vargas Inga, Damel
INTRODUCCIÓN


La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental
utilizado en la biología molecular.


Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos
vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.


En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo,
mano de obra y su rendimiento es limitado.


Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser
utilizados para extraer biomoléculas puras.

Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la
velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce la
contaminación cruzada.
ÁCIDOS NUCLEICOS



 Los ácidos nucleicos almacenan la
información         genética        de
los organismos vivos y son los
responsables de la transmisión
hereditaria.
Gran parte del desarrollo físico de
un organismo a lo largo de su vida
esta programado en estas moléculas.
Las proteínas que elaboraran sus
células y las funciones que realizaran
están todas registradas en esta cinta
molecular.
 Existen dos tipos: el ADN y
el ARN.
EL ADN


Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada
por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por
una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo
fosfato.



                                        Hay        2    cadenas
                                       helicoidales            de
                                       polinucleótidos enrolladas
                                       a lo largo de un eje
                                       común.

                                        Estas            cadenas
                                       permanecen unidas por
                                       puentes de hidrogeno
                                       entre los pares de bases.
Extraccion de adn arn y proteinas
EL ARN




El ARN tiene una sola hebra.
La pentosa de los nucleótidos
constituyentes es ribosa.
Sus cuatro bases son: A, G, C, U.
Es la molécula que dirige las etapas
intermedias de la síntesis proteica.
TIPOS DE ARN
ARNm: Actúa como molde y transporta la
información para la síntesis proteína.



           ARNt: transporta los aminoácidos hacia los
           ribosomas para la síntesis proteica.


                             ARNr: Recibe la información genética. Traduce
                             las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela
                             donde se sintetiza las proteínas.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

HISTORIA

           • Dr Friedrich Miescher realizó la primera
             extracción de ADN.
           • Esperaba solucionar los principios
             fundamentales de la vida, para determinar
             la composición química de las células.
1869       • Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus
             recogidos en vendajes quirúrgicos y
             obtuvo mediante sus pruebas precipitado
             crudo de ADN.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

                       MÉTODOS              EXTRACCIÓN EN
                    CONVENCIONALES           FASE SÓLIDA


                        Tiocianato de
                         guanidinio-          Matrices de
                            fenol-              Sílica
                         cloroformo


                         Extracción           Partículas de
                          alcalina               vidrio


                        Método de              Tierra de
                        Extracción
                         CTAB                  Diatomeas

                       Centrifugación en
                          gradiente de          Perlas
                       bromuro de etidio-
                        cloruro de cesio.
                                               Magnéticas

                        Purificación de
                       ARN Poli (A) por        Material de
                       cromatografía de       intercambio
                       celulosa de oligo
                             (dT).              aniónico
PROTEÍNAS




Las proteínas desempeñan
un papel fundamental para la
vida            y          son
las biomoléculas más versátiles
y más diversas.
 Son imprescindibles para el
crecimiento del organismo.
Realizan       una    enorme
cantidad      de     funciones
diferentes.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
HISTORIA

              • Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las
                sustancias Albuminoides.
Siglo XVIII


              • El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera
                descripción de PROTEÍNA.
              • Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El
  1893          azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales.


              • Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la
                Segunda Guerra Mundial.
              • Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método
                para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está
  1940          fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del
                ataque a Pearl Harbor.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS




                              Cromatografía de
                             intercambio iónico.
                             Cromatografía de
                             filtración en gel.
                             Cromatografía de
                                afinidad.

                            Electroforesis en gel.
                               Southwestern
                                Blotting o
                              immunoblotting.
OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN




 EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS
         ALL IN ONE




    SISTEMA DE EXTRACCIÓN
        AUTOMATIZADO
TERMINOLOGÍA


                         • Es un proceso por el cual átomos, iones o
     ADSORCIÓN:            moléculas son atrapadas o retenidas en la
                           superficie de un material.


                   • Es una sustancia que desorganiza la
                     estructura tridimensional en
AGENTE CAOTRÓPICO:   macromoléculas tales que proteínas,
                     ADN o ARN y las desnaturaliza.


CTAB (BROMURO DE • Es una sal de amonio cuaternario
HEXADECILTRIMETIL
AMONIO):


    LISIS CELULAR:       • Es la rotura de la membrana celular.
TERMINOLOGÍA


                           • Para homogeneizar células y tejidos en una
  MICROPISTILOS EPPI         escala de medición Eppendorf® para tubos de
PARA TUBOS DE ENSAYO:        ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta).


                           • Es una denominación utilizada para referirse a
    PELLET O PELET           pequeñas porciones de material aglomerado o
                             comprimido.

       SDS O NADS
(DODECILSULFATO SÓDICO • Es un compuesto tensoactivo iónico
O LAURILSULFATO SÓDICO)

                           • Es un tubo de microcentrífuga de forma
                             de un pequeño contenedor cilíndrico de
   TUBOS EPENDORF            plástico, con un fondo cónico y una tapa
                             unida al cuerpo del tubo para evitar su
                             desprendimiento.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 POR MÉTODOS CONVENCIONALES
LOS PASOS GENERALES PARA LA
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN

   • EXTRACCIÓN:
        – Lisis de las células que contienen a los AN
        – Inactivación de nucleasas
        –Clarificación: separación de los AN de los restos
         celulares


   • PURIFICACIÓN:
      – De otros AN no deseados
      – De Lípidos, carbohidratos
      – De sales y otros compuestos orgánicos
LISIS CELULAR

El procedimiento ideal de
lisis celular debe tener la
fuerza necesaria para romper
el material de inicio (células o
tejido)    y    la    delicadez
requerida para preservar las
moléculas de interés (ADN o
ARN).
MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA
                EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS




     MÉTODOS MECÁNICOS                     MÉTODOS NO MECÁNICOS




                                  - AGENTES QUÍMICOS
- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO      Detergentes: CTAB , SDS    ENZIMÁTICOS
- CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN                                - Proteasas:
- ULTRASONIDO                                                lisozima
                                                            Gluconasas
                                                             peptidasas
                                                            - ARNasa
CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN
                   LA EXTRACCIÓN DE ADN
MÉTODOS
CONVENCIONALES
1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE
    GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO
         (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):


Fundamento del método:
Extracción de ácidos nucleicos utilizando una
solución del agente caotrópico de Tiocianato de
Guanidino que genera lisis celular y degradación
de proteínas con la liberación de los ácidos
nucleicos.
Posteriormente el uso de solventes orgánicos
fenol- cloroformo que permiten su separación de
restos de proteínas, lípidos y la posterior
precipitación de los ácidos nucléicos usando
etanol o isopropanol.
EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE
           CHONCZYNSKI
        Muestra
        vegetal                                                - LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR
                      PULVERIZAR EN                            - DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E
                       EL MORTERO                                INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS.


                       SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
                        GUANIDINO A pH BÁSICO < 11




          CENTRIFUGA




                                                     FENOL
                                                  CLOROFORMO               ADN
    FASE ACUOSA                                                        SUSPENSIÓN
ADN , RESTOS DE
PROTEÍNAS Y LIPIDOS                                                     PROTEÍNAS
                                                  CENTRIFUGA             Y LÍPIDOS
                                                                        DISUELTOS
    FASE SÓLIDA
RESTOS DE ALTO PESO
MOLECULAR
                                                                                               ALCOHOL
                                                                                             ETÍLICO PURO



                                                                  CENTRIFUGA
                                                                                         ADN EN FORMA
                                                                                         DE FILAMENTOS
                                      PELLET DE ADN
EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE
          CHONCZYNSKI

            Homogenizado de
             muestra vegetal
         pulveriza previamente y
              conservada en
           nitrógeno líquido a
                  -196°C             SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
                                     GUANIDINO A pH REDUCIDO -
                                     ACETATO DE SODIO – FENOL -
                                            CLOROFORMO




             CENTRIFUGACIÓN A
                    4°C

                                                   ALCOHOL
                                                 ISOPROPÍLICO



       FASE ACUOSA

       ARN TOTAL
                                   FASE ACUOSA                    PELLET DE ARN
                                                                      TOTAL
      FASE ORGÁNICA                ARN TOTAL

      ADN, PROTEÍNAS Y
      LIPIDOS DISUELTOS
2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
        POR LISIS ALCALINA

                                   Fundamento del método:
                                    Se basa en las diferencias
                                    en la desnaturalización y
                                    renaturalización del ADN
                                    plasmídico y el ADN
                                    cromosómico al aplicar
                                    NaOH en presencia de un
                                    detergente      fuertemente
                                    aniónico       como      el
                                    Dodesilsulfato de Sodio
                                    (SDS) y Acetato de
                                    potasio.


    Se usa principalmente para
    extracción de ADN plasmídico
    de E. coli.
EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS
              ALCALINA
                                                       -Lisis celular
    Crecimiento de
   Cultivo bacteriano                                  -Desnaturaliza
        de E. coli                                       Proteínas
                                                         ADN cromosómico
                                   Detergente SDS
                                     + NaOH             ADN plasmídico
           Cosecha de cultivo
              bacteriano
                                 pH FUERTEMENTE
                                   ALCALINO DEL
                                      MEDIO
                                                                         Acetato
                                                         pH NEUTRO DEL
                                                                           de
                                                             MEDIO       potasio



                                           -ADN plasmídico    -Precipitación:
                                           se mantiene en      ADN cromosómico.
                           CENTRIFUGAMOS
                                           solución            proteínas .
3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB

                                 Fundamento del método:
  - Elaborado por Murray y       Las     células    vegetales
  Thompson en 1980.              pueden lisarse con el
                                 detergente iónico bromuro
  - Adecuado para extraer y      de cetiltrimetil amonio
  purificar ADN de vegetales y   (CTAB), que forma un
  especialmente indicado para    complejo insoluble con los
  eliminar los polisacáridos y   ácidos nucleicos en medio
  los compuestos polifenólicos   hiposalino. De ese modo,
  que dañarían al ADN.           los    polisacáridos,    los
                                 compuestos fenólicos y los
                                 demás         contaminantes
                                 permanecen        en      el
                                 sobrenadante y pueden
                                 eliminarse por lavado.
PASOS:

                                2.- Suspender la
    1.- Se debe moler la        muestra         en
    muestra después de          solución tampón      3.-Centrifugo, elimino
    congelación     con         de extracción, que   el sobrenadante y lavo.
    Nitrógeno líquido           contiene EDTA,
                                Tris-HCl y CTAB.




      ADN                  5.-Añado etanol           4.- Incrementando la
      puro                 y ARNasa                  concentración salina
EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR
                           Y NUCLEAR
EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO
      INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
4.- CENTRIFUGACIÓN EN
  GRADIENTE DE BrEt - CsCl
- Técnica usada para la Mini
  preparación de ADN plasmídico .

- Requiere de cultivo bacterial a gran
 escala.

- Separa      ADN         plasmídico
  superenrrollado     del      ADN
  plasmídico circular que está en
  estado relajado, concentrándolos
  por centrifugación en una
  gradiente de Bromuro de Etidio –       Superenrrolado:   DNA circular.
  Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.)        Covalentemente    DNA que no se ha
                                         cerrado y muy     empacado.
                                         empacado.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
               BrEt - CsCl



• Fundamento del método:
  El BrEt ingresa y se intercala en
  la     cadena      de      ADN
  disminuyendo su densidad, pero
  lo hace en mayor cantidad en el
  ADN plasmídico en estado
  relajado que en el ADN
  plasmídico superenrrollado.
  pudiéndose      separar       por
  centrifugación en el gradiente
  de densidad de CsCl.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
            BrEt - CsCl




                                 EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA
GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO   CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA
     + BROMURO DE ETIDIO         CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE
                                 CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
             BrEt - CsCl




GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt   GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl
4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR
      CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)



En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en
que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de
200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli
A+.

Cromatografía de afinidad

Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros
ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en
la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre
sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T
que contiene la resina cromatográfica.
Mediante purificación de
poli(A)-ARN: hay ARNm
con una cola de
poliadeninas, mas de 100,
llamada poli(A), estos ARN
se pueden aislar por
cromatografía en columna
de celulosa de oligo dT
celulosa. La cola poli(A)
hibridará con la cadena
oligo dT, fijándose en la
columna. Después de lavar
los ARN no fijados el
ARNpoli(A) se eluye y se
precipita con alcohol etílico
frío.
Existen 2 métodos utilizados para la
            purificación de ARN poli(A)




      Cromatografía en                     Cromatografía de
      columnas de oligo
           (dT)                                 lote




La cromatografía en columnas         es    trabaja      con  ARN
usada      normalmente     para       la   mamífero      en pocas
purificación de grandes cantidades   de    cantidades de muestras
ARN Poli (A) no radiactivo aislado   de    que       pueden   ser
células mamíferas.                         radiactivos o no
EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE
                    SÓLIDA

  Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los
  métodos convencionales.

  Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos
  en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido
  de sales del buffer.

                           La interacción de los puentes de hidrógeno con una
                           matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas

   El proceso de
                           Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por
   absorción está
                           medio de un intercambio aniónico
    basado en los
siguientes principios
                           y mecanismos     de exclusión por afinidad y
                           tamaño.
La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el
uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas.

                      Partículas de vidrio

                      Tierra de diatomeas
    TIPOS                                          soporte sólido (fase estacionaria).
                      Matrices de sílica

                      Transportadores de
                      intercambio aniónico

                       PASOS DE FASE SÓLIDA

      lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y elución.




       Tiras de 8 columnas                      Placa de 96 columnas
Puede ser hecho utilizando un buffer a un
• Acondicionar la
                          pH particular para convertir la superficie o
  columna para la
                          grupos funcionales sobre el sólido dentro
  adsorción de la muestra
                          de una forma química particular

• Luego la muestra la cual ha sido degradada por
  el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la
  columna

• El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con
  la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la
  solución enlazante
PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE
SÓLIDA
  1. se acondiciona la columna para la
  absorción de la muestra. Esto puede ser        5. Luego los ácidos nucleicos se
  hecho usando un tampón a un pH                 eluyen con un tampón de máxima
  definido                                       salinidad

  2. Luego, convierte la superficie o
  grupos funcionales en el solido es decir
  en una forma particular de química             6. se precipita con isopropanol
                                                 para lavar y eliminar todos los
  3. El ácido nucleico deseado se absorberá a    restos de impurezas
  la columna con la ayuda de un alto pH y
  concentración de sal de la solución
  enlazadora.
                                                 7. finalmente, se reconstituye el
  4. La muestra que fue degradada mediante el    ADN de elevada pureza en un
  uso de solución amortiguadora se aplica a la   tampón de baja salinidad para su
  columna                                        posterior      utilización     o
                                                 almacenamiento
PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA


La matriz de silica hidratada la cual fue   El principio de está basada en
preparada por reflujo de óxido de           la elevada afinidad de las
silicio en hidróxido de sodio o             cadenas de ADN cargadas
hidróxido    de    potasio     en    una    negativamente con respecto a
proporción molar de aproximadamente         las partículas de sílica cargadas
2: 1 respectivamente a 10: 1 por al         positivamente.
menos cerca de 48 horas habían sido
introducidas en la purificación del
ADN. El ADN se enlaza a la matriz
inorgánica y es liberada en agua
caliente.
PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA

 El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que
 atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las
 cadenas de ácidos nucleicos.



                            DNA eluye de
                              la sílica en
                                 agua




                           DNA se une
                             a la sílica
                               en NaI
Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas
facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.

La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre
debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de
cromatografía de adsorción.

Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice
y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido
nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones
de sales caotrópicas.
TIERRA DE DIATOMEAS
                (DIATOMITA)

Es una roca sedimentaria silícea formada
por micro-fósiles de diatomeas, algas
marinas unicelulares que secretan un
esqueleto silíceo llamado frústula.
PROPIEDADES
  • Baja densidad.
  • Alta porosidad.
  • Dureza .
  • Capacidad abrasiva suave.
  • Conductividad térmica
    muy baja.
  • Alta resistencia a la
    temperatura.
  • Capacidad muy alta para
    absorber líquidos.
Filtro-ayuda




PRINCIPALES   Porosidad y Poder
   USOS          Absorbente




              Purificación de
                    ADN
DIATOMITA


La diatomita puede ser utilizado
para la retirada del DNA en
presencia del agente
caotrópico altamente concentrado
tal como el ioduro de sodio,
guanidinium hydrochloride y
guanidinium thiocyanate.
DIATOMITA                          La diatomita tiene
                                    contenido de sílice
                                   hasta en un 94%. Ha
                                     sido usado para
                                      filtración y en
Quitan el DNA trenzada doble         cromatografías.
pero no el ARN o las proteínas.


 La diatomita resultante enlazada con el ADN es
 luego lavado con un tampón que contiene alcohol.



   Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un
   tampón bajo en sal o en agua destilada.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDO
         NUCLEICO BASADO EN
        PARTÍCULAS MAGNÉTICAS



La separación magnética es una
manera simple y eficiente el cual
es utilizado actualmente en la
purificación de ácido nucleicos.
Se utilizan           Preparados    A partir de
transportadores                       biopolímeros.
  magnéticos.



                   Materiales con      Polímeros
                   una gran área        sintético
                  superficial , son    Vidrio poroso
                  preferidos para      Basado en
                  ser usados en la      materiales
                   adherencia de        magnéticos
                       ácidos           inorgánicos
                     nucleicos.
ÓXIDO DE HIERRO



Óxido de hierro (II, III) u
 óxido ferroso férrico
        (Fe3O4).
                                              Los momentos
                                            magnéticos de los
                                           distintos cationes de
                                           hierro del sistema se
        Magnetita                        encuentran fuertemente
                                                 acoplados.




       Esta moléculas van
        actuar como un
             imán.
Purificación de ácido nucleico basado en
            partículas magnéticas

                                 Purificación de
                                ácidos nucleicos
  Uso de perlas magnéticas          en base
implica cuya superficie tiene    a:microesferas
   una carga que se puede
cambiar basándose en el pH
                                  magnéticas .
o tampón. A pH bajo, están
  cargados positivamente,
atrayendo a las moléculas de      El ácido nucleico
 ADN con carga negativa y         es luego eluído de
     permitiendo que las
                                     las partículas
       proteínas y los
    contaminantes que se         magnéticas con un
  elimina mediante lavado.       tampón de elución.
MATERIAL DE INTERCAMBIO
        ANIONÍCO

El ejemplo mas popular que se utiliza en el
principio del intercambio iónico es « Resina
de intercambio iónico».

                   Se basa



 En la interacción entre grupos cargados
 positivamente de la celulosa de
 dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y
 fosfatos cargados negativamente del ADN .
Una resina de intercambio iónico puede
considerarse como una estructura de
cadenas hidrocarbonadas.




Estas cadenas se encuentran unidas
transversalmente formando una matriz
tridimensional que proporciona rigidez a la
resina y entrecruzamiento que determina la
estructura porosa interna de la misma.
Extraccion de adn arn y proteinas
Cromatografía de
                 intercambio iónico




                    TIPOS DE          Cromatografía
Electroforesis    EXTRACCION          de filtración en
    en gel             DE                    gel
                   PROTEINAS




                  Cromatografía
                   de afinidad
Proteínas
                                        Seroalbúmina
                   extracelulares
1) Solubilizar a
 la proteína y
   separarla                           Liberarse de la
                      Proteínas
                   citoplasmáticas   célula.(lisis celular)
Lisis celular
   Técnica                Principio               Ejemplos

   Digestión enzimática   Daños en paredes        Lisozimas/ bacterias
                          celulares


   Método químico         Detergentes o agentes   SDS, CTAB, tiocianato
                          caotrópicos             de guanidina


   Método físico          Choque osmótico         solución tampón
Comparación de las envolturas celulares
bacterianas. Arriba: Bacteria Gram-
positiva. 1-membrana citoplasmática, 2-
peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas,
5-ácido liproteico.
Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-
membrana citoplasmática (membrana
interna), 2-espacio periplasmático, 3-
membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-
peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas,
8-lipopolisacáridos, 9-porinas
Extraccion de adn arn y proteinas
2 ) Eliminar
restos celulares

     Mediante
   centrifugación
CROMATOGRAFIA




                  2 fases




    Móvil                   Estacionaria
(Liquido o gas)             (Papel o gel
Aspectos históricos de la cromatografía
      La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge,
       que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se
       podían separar por migración cuando se colocaba una solución que
       los contenía sobre un material poroso, como papel.
      En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna
       para separar extractos vegetales coloreados.
      Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.
      En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo
      Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía
       en el campo de la química orgánica e inorgánica.
      Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939
       respectivamente.
Aspectos históricos de la cromatografía
      A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión
       mundial.
      En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
       cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y
       desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus
       trabajos en 1948.
      Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el
       campo de la bioquímica.
      Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados
Cromatografía de
                               Filtración en Gel


                 Fase fija                            Fase móvil



         Formada por polímeros
          biológicos o sintéticos                  Tampón en el cual,
                                                     la mezcla de
                                                      proteínas se
                                                   encuentra disuelta
   Polímeros  forma de pequeñas bolitas.
            Diámetro  10-250 µm.
Estos se hinchan con una disolución de tampón            Agarosa
    acuosa y se introducen en una columna                Dextrano
                                                       poliacrilamida
Cromatografía de Filtración en Gel o
Cromatografía de exclusión
Extraccion de adn arn y proteinas
Cromatografía de intercambio iónico

                     •   Sustancias ionizables:
                     •   DEAE =DIETILAMINOETIL
          fase       •   CM = CARBOXIMETIL
      estacionaria   •   Tienen carga (+)




                     • Proteínas con carga (-) se unen al
                       CM y quedan retenidas.
                     • Las proteínas neutras y las que
       Fase móvil      tienen carga (+) eluyen
                       libremente.
                     • Usar tampón con elevada
                       concentración de NaCl
Cromatografía de intercambio
          iónico
Las proteínas cargadas negativamente se
                               unen a la fase estacionaria




Las proteínas cargadas positivamente                      Fase estacionaria
                eluyen




    FASE ESTACIONARIA
Ofrece la mayor especificidad y selectividad
   para el aislamiento y purificación de
                biomoléculas


         En esta técnica la molécula que se une
         específicamente a la proteína se conoce con el
         nombre de ligando mientras que otras pasan
         por la columna
Las proteínas         La unión entre el
                                            Después de
deseada se eluye      ligando y
                                            eliminar los
de la columna         moléculas diana de
                                            contaminantes, el
mediante una          las proteínas debe
                                            ligando acoplado
solución que          ser reversible para
                                            debe conservar su
contiene una alta     permitir que las
                                            afinidad de unión
concentración de la   proteínas deban
                                            específica para las
forma soluble del     eliminarse en una
                                            proteínas diana
Ligando.              forma activa
Extraccion de adn arn y proteinas
TIPOS DE        MOLÉCULAS DIANA
LIGANDO
Enzima         Análogo de sustrato, inhibidor, cofactor

Anticuerpo     Antígeno, virus

Lectina        Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célula


ácido nucleico Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de
               ácido, la proteína de unión de ácido nucleico

hormonas y     Receptor, proteína portadora
vitamina
El glutatión   Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST

Los iones      Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína y
metálicos      residuos / triptófano en sus superficies
Extraccion de adn arn y proteinas
Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del
equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las
cuales se va a llevar a cabo la separación:

         Electroforesis       Electroforesis en gel
                                                         Isoelectroenfoque
            capilar           de poliacrilamida

        Electroforesis        Electroforesis en gel        Electroforesis
        en papel.             de agarosa.                  bidimensional



        Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los
        geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis)
        debido a su buena resolución y gran versatilidad.
Es uno de los métodos más utilizados para
la purificación, análisis y caracterización de
proteínas según su relación tamaño a carga
eléctrica en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada.

usándose como base una matriz gelatinosa,
ya sea de agarosa o poliacrilamida
Extraccion de adn arn y proteinas
COMO OBTENGO LA                   POLIACRILAMIDA
  POLIACRILAMIDA


 se mezcla acrilamida en    Es químicamente inerte, de
  diferentes proporciones     propiedades uniformes, capaz
  , con el agente             de ser preparado de forma
  entrecruzante N,N’          rápida .
  metilen bis acrilamida     Es un gel transparentes con
                              estabilidad , insolubles en
 Además tiene la ventaja     agua, y que permiten buena
  de que variando la          visualización de las bandas
  concentración de            durante tiempo prolongado
  polímeros, se puede
  modificar de manera        Tiene un amplio rango de
  controlada el tamaño        pHs, temperatura y fuerza
  del poro                    iónica.
Extraccion de adn arn y proteinas
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a
cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).

Las diferencias entre uno y otro son :



                                         SDS-PAGE cuando las proteínas se
   ND-PAGE las proteínas                 solubilizan en presencia del
   mantienen su estructura               detergente aniónico SDS , éste se
   tridimensional y las                  une a las proteínas, rompiendo
   diferentes cadenas                    interacciones hidrofóbicas y
   polipeptídicas pueden                 desnaturalizándolas. Las proteínas
   permanecer unidas,                    desnaturalizadas de la muestra
   separándose no sólo en                adoptarán una estructura en forma
   función de su carga                   de bastoncillo con una serie de
   eléctrica, sino también               moléculas de SDS cargadas
   según su tamaño y                     negativamente a lo largo de la
   forma                                 cadena polipeptídica.
                                         Las proteinas se separan en base a
                                         su masa molecular
Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es
sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través
del gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar
moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o
aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico
muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta
cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.
Marcadores de peso
molecular:

Mezcla de diferentes
proteínas preteñidas
de las que conocemos el
peso molecular.

Por comparación podemos
averiguar el PM aparente
de nuestra proteína
SOUTHWESTERN BLOT O
           IMMUNOBLOTTING


Es un método utilizado en
BIOLOGÍA MOLECULAR;            Muchas de las proteínas
                               enlazadas por ADN en
El método lleva el nombre      la célula deben ser
de su inventor, el británico   Aisladas
biólogo Edward Southern .
                                individualmente     y
Fue descrito por primera vez   caracterizadas    para
en 1981.                       definir la función del
                               gen.
método que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar
     proteínas de unión a ADN




Es una técnica de detección
                                                Es un proceso que se utiliza
de   moléculas      de     ácido
                                                para el análisis del ADN.
ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de
una mezcla compleja.
SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING

1. Se separan las proteinas                2. Las proteinas separadas son
   mediante electroforesisen               transferidas en un filtro de
   gel de poliacrilamida sodio             membrana de nitrocelulosa
   dodecilsulfato                          difluoruro de polivinilideno




                                  3. Las proteinas unidas a la menbrana
                                  se incuban luego con sondas de
                                  oligonucleotidos de secuencia
                                  especifica de ADN para las proteínas
                                  absorbidas y analizarlas
ELECTROFORESIS
Se separan las proteínas o los ácidos
nucleicos en un gel de electroforesis


TRANSFERENCIA (BLOTTING)
Se transfieren las bandas de proteínas o de
ácidos nucleicos desde el gel hacia una
membrana de nitrocelulosa (flechas azules)
para que puedan reaccionar con la sonda
radioactiva.

Se añaden Anticuerpos radiactivos contra
una proteína o sondas radioactivas de
ácidos nucleicos (con secuencia conocida).
Se espera a que reaccionen (A). Se coloca
la membrana de nitrocelulosa sobre una
placa fotográfica y se revela (B).
Extracción de biomoleculas
        All-In-One

       Para la extraccion de acidos nucleicos se siguieron
       los pasos de Chomczynski y Sacchi (1987).
       Este método involucra la lisis celular con
       isotiocianato de guanidinio y fenol en una solución
       de una fase.
El homogeneización de la muestra:
Permite   la   disgregación   de   la
estructura celular para facilitar la
salida de los ácidos nucleicos. Esto
con la utilización de SDS.




                                        Este método implica la lisis de la
                                        célula   en   presencia   de   agentes
                                        desnaturantes fuertes de proteínas
                                        (isotiocianato de guanidinio y fenol)
                                        en una solución monofásica.
Extracción Fenol-Cloroformo: ADN
            y/o ARN
  MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1)             PH: reducido
  desproteiniza e inhibe nucleasas



      FASE ACUOSA: ARN



    FASE ORGANICA: ADN Y
         PROTEINAS



El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica por
precipitación con etanol o isopropanol .
ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.
Sistema de extracción
                       automatica
Es un Sistema de instrumentación muy grande, complejo y
costoso, diseñado para un alto volumen de procesamiento de   MagNA Pure LC 2.0

muestras.
El hecho de automatizar el proceso de extracción de ácidos
nucleicos es beneficioso para una serie de razones:


Reduce el tiempo de trabajo.
Disminuye los costos laborales.
Aumenta la seguridad de los trabajadores
Aumenta la reproducibilidad calidad de los resultados.
Sobre todo minimiza el riesgo de contaminación cruzada.
Oprimir el botón de
sistema de manipulación de partícula                Inicio. El ADN es eluído
paramagnética para procesar la muestra y      3     en un tampón de elución
proporcionar un rendimiento constante y             al final del proceso
pureza ya que no hay detectable
contaminación cruzada , entre las
muestras
                                                     Colocar el cartucho del
                                              2      reactivo dentro de la
  El proceso de extracción completo                  máquina.
  dura unos 20 minutos desde el
  comienzo hasta el final

                                                    Añadir la muestra
                                              1     líquida al cartucho del
                                                    reactivo.




                        SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS
Magna pure
                          Pequeño tamaño basado en el uso de
                          partículas magnéticas.
                          El ácido nucleico obtenido es altamente puro
                          Ausencia de contaminación cruzada mediante
                          filtros Hepa.
                          Descontaminación por rayos uv
                           Demora Máximo de 30 minutos
                          Es posible trabajar con un amplio rango de
                          muestras (sangre total, suero, plasma,
                          tejidos, células en cultivo, etc.),




Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de
alta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica
Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicos
MagNA Pure LC 2.0   (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales)
                    Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas
                    mononucleadas, células blancas, tejidos vegetales
                    Realiza labores de pre-pcr en distintos formatos




                    1                                      2


                                                        Unidad
                     Unidad inicio                      procesamiento



                                  3

                                      Unidad de elución
                                       y post-elución
La automatización ha
ayudado en el aumento         Por lo tanto las estaciones de
   del rendimiento y        trabajo robótico para extracción
mejora la fiabilidad del   de ácidos nucleicos deben cumplir
        proceso            con una verdadera ¨Walk-away¨ ,
                            automatización, lo que significa
                                 un proceso totalmente
                                      automatizado




                                   un sistema portátil de
                                 extracción , ofrece varias
                                  ventajas , tales como la
                                  mano de obra reducida,
                                reducción de los residuos y
                                 aumento de la velocidad
conclusiones
• Las técnicas generales de purificación y extracción de ácidos nucleicos; tanto
  los métodos convencionales como los métodos modernizados gracias al
  desarrollo de la tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a los
  investigadores y científicos a adquirir mejores resultados y es esencial en una
  gran cantidad de aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de parentesco,
  para detectar enfermedades hereditarias, para conocer los genes de una
  persona, clonación, etc.

                             Automatización de ácido nucleico , este proceso de
                             extracción es potencialmente beneficioso para un
                             número de razones entre ellas , para reducir el tiempo
                             detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento
                             de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo
                             proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la
                             calidad de aumentar los resultados
Extraccion de adn arn y proteinas

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Extraccion de adn arn y proteinas

  • 1. EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS: EL PASADO Y EL PRESENTE  CURSO: BIOQUÍMICA II  DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica.  INTEGRANTES:  Apaza Gonzales, Pamela  Fernández Lugo, Ana Cecilia  Huamán Benites, angie  Miguel Buendía, Rosaura  Pozo Cuya, Mireya  Uribe Pinta, Elizabeth  Vargas Inga, Damel
  • 2. INTRODUCCIÓN La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental utilizado en la biología molecular. Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras. En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo, mano de obra y su rendimiento es limitado. Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser utilizados para extraer biomoléculas puras. Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce la contaminación cruzada.
  • 3. ÁCIDOS NUCLEICOS  Los ácidos nucleicos almacenan la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la transmisión hereditaria. Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida esta programado en estas moléculas. Las proteínas que elaboraran sus células y las funciones que realizaran están todas registradas en esta cinta molecular.  Existen dos tipos: el ADN y el ARN.
  • 4. EL ADN Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato.  Hay 2 cadenas helicoidales de polinucleótidos enrolladas a lo largo de un eje común.  Estas cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de bases.
  • 6. EL ARN El ARN tiene una sola hebra. La pentosa de los nucleótidos constituyentes es ribosa. Sus cuatro bases son: A, G, C, U. Es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica.
  • 7. TIPOS DE ARN ARNm: Actúa como molde y transporta la información para la síntesis proteína. ARNt: transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis proteica. ARNr: Recibe la información genética. Traduce las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela donde se sintetiza las proteínas.
  • 8. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS HISTORIA • Dr Friedrich Miescher realizó la primera extracción de ADN. • Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química de las células. 1869 • Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirúrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.
  • 9. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MÉTODOS EXTRACCIÓN EN CONVENCIONALES FASE SÓLIDA Tiocianato de guanidinio- Matrices de fenol- Sílica cloroformo Extracción Partículas de alcalina vidrio Método de Tierra de Extracción CTAB Diatomeas Centrifugación en gradiente de Perlas bromuro de etidio- cloruro de cesio. Magnéticas Purificación de ARN Poli (A) por Material de cromatografía de intercambio celulosa de oligo (dT). aniónico
  • 10. PROTEÍNAS Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas.  Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes.
  • 11. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS HISTORIA • Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las sustancias Albuminoides. Siglo XVIII • El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera descripción de PROTEÍNA. • Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El 1893 azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales. • Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la Segunda Guerra Mundial. • Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está 1940 fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del ataque a Pearl Harbor.
  • 12. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de filtración en gel. Cromatografía de afinidad. Electroforesis en gel. Southwestern Blotting o immunoblotting.
  • 13. OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS ALL IN ONE SISTEMA DE EXTRACCIÓN AUTOMATIZADO
  • 14. TERMINOLOGÍA • Es un proceso por el cual átomos, iones o ADSORCIÓN: moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material. • Es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en AGENTE CAOTRÓPICO: macromoléculas tales que proteínas, ADN o ARN y las desnaturaliza. CTAB (BROMURO DE • Es una sal de amonio cuaternario HEXADECILTRIMETIL AMONIO): LISIS CELULAR: • Es la rotura de la membrana celular.
  • 15. TERMINOLOGÍA • Para homogeneizar células y tejidos en una MICROPISTILOS EPPI escala de medición Eppendorf® para tubos de PARA TUBOS DE ENSAYO: ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta). • Es una denominación utilizada para referirse a PELLET O PELET pequeñas porciones de material aglomerado o comprimido. SDS O NADS (DODECILSULFATO SÓDICO • Es un compuesto tensoactivo iónico O LAURILSULFATO SÓDICO) • Es un tubo de microcentrífuga de forma de un pequeño contenedor cilíndrico de TUBOS EPENDORF plástico, con un fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento.
  • 16. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR MÉTODOS CONVENCIONALES
  • 17. LOS PASOS GENERALES PARA LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN • EXTRACCIÓN: – Lisis de las células que contienen a los AN – Inactivación de nucleasas –Clarificación: separación de los AN de los restos celulares • PURIFICACIÓN: – De otros AN no deseados – De Lípidos, carbohidratos – De sales y otros compuestos orgánicos
  • 18. LISIS CELULAR El procedimiento ideal de lisis celular debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadez requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).
  • 19. MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS MÉTODOS MECÁNICOS MÉTODOS NO MECÁNICOS - AGENTES QUÍMICOS - MOLIENDA MANUAL EN MORTERO Detergentes: CTAB , SDS ENZIMÁTICOS - CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN - Proteasas: - ULTRASONIDO lisozima Gluconasas peptidasas - ARNasa
  • 20. CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DE ADN
  • 22. 1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI): Fundamento del método: Extracción de ácidos nucleicos utilizando una solución del agente caotrópico de Tiocianato de Guanidino que genera lisis celular y degradación de proteínas con la liberación de los ácidos nucleicos. Posteriormente el uso de solventes orgánicos fenol- cloroformo que permiten su separación de restos de proteínas, lípidos y la posterior precipitación de los ácidos nucléicos usando etanol o isopropanol.
  • 23. EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI Muestra vegetal - LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR PULVERIZAR EN - DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E EL MORTERO INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS. SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH BÁSICO < 11 CENTRIFUGA FENOL CLOROFORMO ADN FASE ACUOSA SUSPENSIÓN ADN , RESTOS DE PROTEÍNAS Y LIPIDOS PROTEÍNAS CENTRIFUGA Y LÍPIDOS DISUELTOS FASE SÓLIDA RESTOS DE ALTO PESO MOLECULAR ALCOHOL ETÍLICO PURO CENTRIFUGA ADN EN FORMA DE FILAMENTOS PELLET DE ADN
  • 24. EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI Homogenizado de muestra vegetal pulveriza previamente y conservada en nitrógeno líquido a -196°C SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH REDUCIDO - ACETATO DE SODIO – FENOL - CLOROFORMO CENTRIFUGACIÓN A 4°C ALCOHOL ISOPROPÍLICO FASE ACUOSA ARN TOTAL FASE ACUOSA PELLET DE ARN TOTAL FASE ORGÁNICA ARN TOTAL ADN, PROTEÍNAS Y LIPIDOS DISUELTOS
  • 25. 2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA Fundamento del método: Se basa en las diferencias en la desnaturalización y renaturalización del ADN plasmídico y el ADN cromosómico al aplicar NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico como el Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y Acetato de potasio. Se usa principalmente para extracción de ADN plasmídico de E. coli.
  • 26. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA -Lisis celular Crecimiento de Cultivo bacteriano -Desnaturaliza de E. coli  Proteínas  ADN cromosómico Detergente SDS + NaOH ADN plasmídico Cosecha de cultivo bacteriano pH FUERTEMENTE ALCALINO DEL MEDIO Acetato pH NEUTRO DEL de MEDIO potasio -ADN plasmídico -Precipitación: se mantiene en  ADN cromosómico. CENTRIFUGAMOS solución  proteínas .
  • 27. 3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB Fundamento del método: - Elaborado por Murray y Las células vegetales Thompson en 1980. pueden lisarse con el detergente iónico bromuro - Adecuado para extraer y de cetiltrimetil amonio purificar ADN de vegetales y (CTAB), que forma un especialmente indicado para complejo insoluble con los eliminar los polisacáridos y ácidos nucleicos en medio los compuestos polifenólicos hiposalino. De ese modo, que dañarían al ADN. los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.
  • 28. PASOS: 2.- Suspender la 1.- Se debe moler la muestra en muestra después de solución tampón 3.-Centrifugo, elimino congelación con de extracción, que el sobrenadante y lavo. Nitrógeno líquido contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. ADN 5.-Añado etanol 4.- Incrementando la puro y ARNasa concentración salina
  • 29. EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR Y NUCLEAR
  • 30. EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
  • 31. DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
  • 32. 4.- CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl - Técnica usada para la Mini preparación de ADN plasmídico . - Requiere de cultivo bacterial a gran escala. - Separa ADN plasmídico superenrrollado del ADN plasmídico circular que está en estado relajado, concentrándolos por centrifugación en una gradiente de Bromuro de Etidio – Superenrrolado: DNA circular. Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.) Covalentemente DNA que no se ha cerrado y muy empacado. empacado.
  • 33. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl • Fundamento del método: El BrEt ingresa y se intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmídico en estado relajado que en el ADN plasmídico superenrrollado. pudiéndose separar por centrifugación en el gradiente de densidad de CsCl.
  • 34. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA + BROMURO DE ETIDIO CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
  • 35. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
  • 36. GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl
  • 37. 4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT) En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de 200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli A+. Cromatografía de afinidad Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T que contiene la resina cromatográfica.
  • 38. Mediante purificación de poli(A)-ARN: hay ARNm con una cola de poliadeninas, mas de 100, llamada poli(A), estos ARN se pueden aislar por cromatografía en columna de celulosa de oligo dT celulosa. La cola poli(A) hibridará con la cadena oligo dT, fijándose en la columna. Después de lavar los ARN no fijados el ARNpoli(A) se eluye y se precipita con alcohol etílico frío.
  • 39. Existen 2 métodos utilizados para la purificación de ARN poli(A) Cromatografía en Cromatografía de columnas de oligo (dT) lote La cromatografía en columnas es trabaja con ARN usada normalmente para la mamífero en pocas purificación de grandes cantidades de cantidades de muestras ARN Poli (A) no radiactivo aislado de que pueden ser células mamíferas. radiactivos o no
  • 40. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE SÓLIDA Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los métodos convencionales. Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido de sales del buffer. La interacción de los puentes de hidrógeno con una matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas El proceso de Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por absorción está medio de un intercambio aniónico basado en los siguientes principios y mecanismos de exclusión por afinidad y tamaño.
  • 41. La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas. Partículas de vidrio Tierra de diatomeas TIPOS soporte sólido (fase estacionaria). Matrices de sílica Transportadores de intercambio aniónico PASOS DE FASE SÓLIDA lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y elución. Tiras de 8 columnas Placa de 96 columnas
  • 42. Puede ser hecho utilizando un buffer a un • Acondicionar la pH particular para convertir la superficie o columna para la grupos funcionales sobre el sólido dentro adsorción de la muestra de una forma química particular • Luego la muestra la cual ha sido degradada por el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la columna • El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la solución enlazante
  • 43. PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 1. se acondiciona la columna para la absorción de la muestra. Esto puede ser 5. Luego los ácidos nucleicos se hecho usando un tampón a un pH eluyen con un tampón de máxima definido salinidad 2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el solido es decir en una forma particular de química 6. se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los 3. El ácido nucleico deseado se absorberá a restos de impurezas la columna con la ayuda de un alto pH y concentración de sal de la solución enlazadora. 7. finalmente, se reconstituye el 4. La muestra que fue degradada mediante el ADN de elevada pureza en un uso de solución amortiguadora se aplica a la tampón de baja salinidad para su columna posterior utilización o almacenamiento
  • 44. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA La matriz de silica hidratada la cual fue El principio de está basada en preparada por reflujo de óxido de la elevada afinidad de las silicio en hidróxido de sodio o cadenas de ADN cargadas hidróxido de potasio en una negativamente con respecto a proporción molar de aproximadamente las partículas de sílica cargadas 2: 1 respectivamente a 10: 1 por al positivamente. menos cerca de 48 horas habían sido introducidas en la purificación del ADN. El ADN se enlaza a la matriz inorgánica y es liberada en agua caliente.
  • 45. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las cadenas de ácidos nucleicos. DNA eluye de la sílica en agua DNA se une a la sílica en NaI
  • 46. Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice. La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de cromatografía de adsorción. Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones de sales caotrópicas.
  • 47. TIERRA DE DIATOMEAS (DIATOMITA) Es una roca sedimentaria silícea formada por micro-fósiles de diatomeas, algas marinas unicelulares que secretan un esqueleto silíceo llamado frústula.
  • 48. PROPIEDADES • Baja densidad. • Alta porosidad. • Dureza . • Capacidad abrasiva suave. • Conductividad térmica muy baja. • Alta resistencia a la temperatura. • Capacidad muy alta para absorber líquidos.
  • 49. Filtro-ayuda PRINCIPALES Porosidad y Poder USOS Absorbente Purificación de ADN
  • 50. DIATOMITA La diatomita puede ser utilizado para la retirada del DNA en presencia del agente caotrópico altamente concentrado tal como el ioduro de sodio, guanidinium hydrochloride y guanidinium thiocyanate.
  • 51. DIATOMITA La diatomita tiene contenido de sílice hasta en un 94%. Ha sido usado para filtración y en Quitan el DNA trenzada doble cromatografías. pero no el ARN o las proteínas. La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampón que contiene alcohol. Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un tampón bajo en sal o en agua destilada.
  • 52. PURIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO BASADO EN PARTÍCULAS MAGNÉTICAS La separación magnética es una manera simple y eficiente el cual es utilizado actualmente en la purificación de ácido nucleicos.
  • 53. Se utilizan Preparados A partir de transportadores biopolímeros. magnéticos. Materiales con  Polímeros una gran área sintético superficial , son  Vidrio poroso preferidos para  Basado en ser usados en la materiales adherencia de magnéticos ácidos inorgánicos nucleicos.
  • 54. ÓXIDO DE HIERRO Óxido de hierro (II, III) u óxido ferroso férrico (Fe3O4). Los momentos magnéticos de los distintos cationes de hierro del sistema se Magnetita encuentran fuertemente acoplados. Esta moléculas van actuar como un imán.
  • 55. Purificación de ácido nucleico basado en partículas magnéticas Purificación de ácidos nucleicos Uso de perlas magnéticas en base implica cuya superficie tiene a:microesferas una carga que se puede cambiar basándose en el pH magnéticas . o tampón. A pH bajo, están cargados positivamente, atrayendo a las moléculas de El ácido nucleico ADN con carga negativa y es luego eluído de permitiendo que las las partículas proteínas y los contaminantes que se magnéticas con un elimina mediante lavado. tampón de elución.
  • 56. MATERIAL DE INTERCAMBIO ANIONÍCO El ejemplo mas popular que se utiliza en el principio del intercambio iónico es « Resina de intercambio iónico». Se basa En la interacción entre grupos cargados positivamente de la celulosa de dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y fosfatos cargados negativamente del ADN .
  • 57. Una resina de intercambio iónico puede considerarse como una estructura de cadenas hidrocarbonadas. Estas cadenas se encuentran unidas transversalmente formando una matriz tridimensional que proporciona rigidez a la resina y entrecruzamiento que determina la estructura porosa interna de la misma.
  • 59. Cromatografía de intercambio iónico TIPOS DE Cromatografía Electroforesis EXTRACCION de filtración en en gel DE gel PROTEINAS Cromatografía de afinidad
  • 60. Proteínas Seroalbúmina extracelulares 1) Solubilizar a la proteína y separarla Liberarse de la Proteínas citoplasmáticas célula.(lisis celular)
  • 61. Lisis celular Técnica Principio Ejemplos Digestión enzimática Daños en paredes Lisozimas/ bacterias celulares Método químico Detergentes o agentes SDS, CTAB, tiocianato caotrópicos de guanidina Método físico Choque osmótico solución tampón
  • 62. Comparación de las envolturas celulares bacterianas. Arriba: Bacteria Gram- positiva. 1-membrana citoplasmática, 2- peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas, 5-ácido liproteico. Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1- membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3- membrana externa, 4-fosfolípidos, 5- peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-porinas
  • 64. 2 ) Eliminar restos celulares Mediante centrifugación
  • 65. CROMATOGRAFIA 2 fases Móvil Estacionaria (Liquido o gas) (Papel o gel
  • 66. Aspectos históricos de la cromatografía  La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.  En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados. Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.  En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo  Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica. Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.
  • 67. Aspectos históricos de la cromatografía  A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial. En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948.  Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica. Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados
  • 68. Cromatografía de Filtración en Gel Fase fija Fase móvil Formada por polímeros biológicos o sintéticos Tampón en el cual, la mezcla de proteínas se encuentra disuelta Polímeros  forma de pequeñas bolitas. Diámetro  10-250 µm. Estos se hinchan con una disolución de tampón Agarosa acuosa y se introducen en una columna Dextrano poliacrilamida
  • 69. Cromatografía de Filtración en Gel o Cromatografía de exclusión
  • 71. Cromatografía de intercambio iónico • Sustancias ionizables: • DEAE =DIETILAMINOETIL fase • CM = CARBOXIMETIL estacionaria • Tienen carga (+) • Proteínas con carga (-) se unen al CM y quedan retenidas. • Las proteínas neutras y las que Fase móvil tienen carga (+) eluyen libremente. • Usar tampón con elevada concentración de NaCl
  • 73. Las proteínas cargadas negativamente se unen a la fase estacionaria Las proteínas cargadas positivamente Fase estacionaria eluyen FASE ESTACIONARIA
  • 74. Ofrece la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y purificación de biomoléculas En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando mientras que otras pasan por la columna
  • 75. Las proteínas La unión entre el Después de deseada se eluye ligando y eliminar los de la columna moléculas diana de contaminantes, el mediante una las proteínas debe ligando acoplado solución que ser reversible para debe conservar su contiene una alta permitir que las afinidad de unión concentración de la proteínas deban específica para las forma soluble del eliminarse en una proteínas diana Ligando. forma activa
  • 77. TIPOS DE MOLÉCULAS DIANA LIGANDO Enzima Análogo de sustrato, inhibidor, cofactor Anticuerpo Antígeno, virus Lectina Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célula ácido nucleico Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de ácido, la proteína de unión de ácido nucleico hormonas y Receptor, proteína portadora vitamina El glutatión Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST Los iones Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína y metálicos residuos / triptófano en sus superficies
  • 79. Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las cuales se va a llevar a cabo la separación: Electroforesis Electroforesis en gel Isoelectroenfoque capilar de poliacrilamida Electroforesis Electroforesis en gel Electroforesis en papel. de agarosa. bidimensional Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad.
  • 80. Es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas según su relación tamaño a carga eléctrica en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada. usándose como base una matriz gelatinosa, ya sea de agarosa o poliacrilamida
  • 82. COMO OBTENGO LA POLIACRILAMIDA POLIACRILAMIDA  se mezcla acrilamida en  Es químicamente inerte, de diferentes proporciones propiedades uniformes, capaz , con el agente de ser preparado de forma entrecruzante N,N’ rápida . metilen bis acrilamida  Es un gel transparentes con estabilidad , insolubles en  Además tiene la ventaja agua, y que permiten buena de que variando la visualización de las bandas concentración de durante tiempo prolongado polímeros, se puede modificar de manera  Tiene un amplio rango de controlada el tamaño pHs, temperatura y fuerza del poro iónica.
  • 84. La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). Las diferencias entre uno y otro son : SDS-PAGE cuando las proteínas se ND-PAGE las proteínas solubilizan en presencia del mantienen su estructura detergente aniónico SDS , éste se tridimensional y las une a las proteínas, rompiendo diferentes cadenas interacciones hidrofóbicas y polipeptídicas pueden desnaturalizándolas. Las proteínas permanecer unidas, desnaturalizadas de la muestra separándose no sólo en adoptarán una estructura en forma función de su carga de bastoncillo con una serie de eléctrica, sino también moléculas de SDS cargadas según su tamaño y negativamente a lo largo de la forma cadena polipeptídica. Las proteinas se separan en base a su masa molecular
  • 85. Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través del gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.
  • 86. Marcadores de peso molecular: Mezcla de diferentes proteínas preteñidas de las que conocemos el peso molecular. Por comparación podemos averiguar el PM aparente de nuestra proteína
  • 87. SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTTING Es un método utilizado en BIOLOGÍA MOLECULAR; Muchas de las proteínas enlazadas por ADN en El método lleva el nombre la célula deben ser de su inventor, el británico Aisladas biólogo Edward Southern . individualmente y Fue descrito por primera vez caracterizadas para en 1981. definir la función del gen.
  • 88. método que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar proteínas de unión a ADN Es una técnica de detección Es un proceso que se utiliza de moléculas de ácido para el análisis del ADN. ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja.
  • 89. SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING 1. Se separan las proteinas 2. Las proteinas separadas son mediante electroforesisen transferidas en un filtro de gel de poliacrilamida sodio membrana de nitrocelulosa dodecilsulfato difluoruro de polivinilideno 3. Las proteinas unidas a la menbrana se incuban luego con sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica de ADN para las proteínas absorbidas y analizarlas
  • 90. ELECTROFORESIS Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis TRANSFERENCIA (BLOTTING) Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva. Se añaden Anticuerpos radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B).
  • 91. Extracción de biomoleculas All-In-One Para la extraccion de acidos nucleicos se siguieron los pasos de Chomczynski y Sacchi (1987). Este método involucra la lisis celular con isotiocianato de guanidinio y fenol en una solución de una fase.
  • 92. El homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura celular para facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Esto con la utilización de SDS. Este método implica la lisis de la célula en presencia de agentes desnaturantes fuertes de proteínas (isotiocianato de guanidinio y fenol) en una solución monofásica.
  • 93. Extracción Fenol-Cloroformo: ADN y/o ARN MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1) PH: reducido desproteiniza e inhibe nucleasas FASE ACUOSA: ARN FASE ORGANICA: ADN Y PROTEINAS El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica por precipitación con etanol o isopropanol . ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.
  • 94. Sistema de extracción automatica Es un Sistema de instrumentación muy grande, complejo y costoso, diseñado para un alto volumen de procesamiento de MagNA Pure LC 2.0 muestras. El hecho de automatizar el proceso de extracción de ácidos nucleicos es beneficioso para una serie de razones: Reduce el tiempo de trabajo. Disminuye los costos laborales. Aumenta la seguridad de los trabajadores Aumenta la reproducibilidad calidad de los resultados. Sobre todo minimiza el riesgo de contaminación cruzada.
  • 95. Oprimir el botón de sistema de manipulación de partícula Inicio. El ADN es eluído paramagnética para procesar la muestra y 3 en un tampón de elución proporcionar un rendimiento constante y al final del proceso pureza ya que no hay detectable contaminación cruzada , entre las muestras Colocar el cartucho del 2 reactivo dentro de la El proceso de extracción completo máquina. dura unos 20 minutos desde el comienzo hasta el final Añadir la muestra 1 líquida al cartucho del reactivo. SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS
  • 96. Magna pure Pequeño tamaño basado en el uso de partículas magnéticas. El ácido nucleico obtenido es altamente puro Ausencia de contaminación cruzada mediante filtros Hepa. Descontaminación por rayos uv  Demora Máximo de 30 minutos Es posible trabajar con un amplio rango de muestras (sangre total, suero, plasma, tejidos, células en cultivo, etc.), Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de alta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica
  • 97. Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicos MagNA Pure LC 2.0 (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales) Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas mononucleadas, células blancas, tejidos vegetales Realiza labores de pre-pcr en distintos formatos 1 2 Unidad Unidad inicio procesamiento 3 Unidad de elución y post-elución
  • 98. La automatización ha ayudado en el aumento Por lo tanto las estaciones de del rendimiento y trabajo robótico para extracción mejora la fiabilidad del de ácidos nucleicos deben cumplir proceso con una verdadera ¨Walk-away¨ , automatización, lo que significa un proceso totalmente automatizado un sistema portátil de extracción , ofrece varias ventajas , tales como la mano de obra reducida, reducción de los residuos y aumento de la velocidad
  • 99. conclusiones • Las técnicas generales de purificación y extracción de ácidos nucleicos; tanto los métodos convencionales como los métodos modernizados gracias al desarrollo de la tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a los investigadores y científicos a adquirir mejores resultados y es esencial en una gran cantidad de aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de parentesco, para detectar enfermedades hereditarias, para conocer los genes de una persona, clonación, etc. Automatización de ácido nucleico , este proceso de extracción es potencialmente beneficioso para un número de razones entre ellas , para reducir el tiempo detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la calidad de aumentar los resultados