Insuficiencia Cardíaca - 2021 AL 2024 MEDICINA ESPECIALIZADA
Extraccion de adn arn y proteinas
1. EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS:
EL PASADO Y EL PRESENTE
CURSO: BIOQUÍMICA II
DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica.
INTEGRANTES:
Apaza Gonzales, Pamela
Fernández Lugo, Ana Cecilia
Huamán Benites, angie
Miguel Buendía, Rosaura
Pozo Cuya, Mireya
Uribe Pinta, Elizabeth
Vargas Inga, Damel
2. INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental
utilizado en la biología molecular.
Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos
vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.
En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo,
mano de obra y su rendimiento es limitado.
Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser
utilizados para extraer biomoléculas puras.
Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la
velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce la
contaminación cruzada.
3. ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos almacenan la
información genética de
los organismos vivos y son los
responsables de la transmisión
hereditaria.
Gran parte del desarrollo físico de
un organismo a lo largo de su vida
esta programado en estas moléculas.
Las proteínas que elaboraran sus
células y las funciones que realizaran
están todas registradas en esta cinta
molecular.
Existen dos tipos: el ADN y
el ARN.
4. EL ADN
Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada
por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por
una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo
fosfato.
Hay 2 cadenas
helicoidales de
polinucleótidos enrolladas
a lo largo de un eje
común.
Estas cadenas
permanecen unidas por
puentes de hidrogeno
entre los pares de bases.
6. EL ARN
El ARN tiene una sola hebra.
La pentosa de los nucleótidos
constituyentes es ribosa.
Sus cuatro bases son: A, G, C, U.
Es la molécula que dirige las etapas
intermedias de la síntesis proteica.
7. TIPOS DE ARN
ARNm: Actúa como molde y transporta la
información para la síntesis proteína.
ARNt: transporta los aminoácidos hacia los
ribosomas para la síntesis proteica.
ARNr: Recibe la información genética. Traduce
las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela
donde se sintetiza las proteínas.
8. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
HISTORIA
• Dr Friedrich Miescher realizó la primera
extracción de ADN.
• Esperaba solucionar los principios
fundamentales de la vida, para determinar
la composición química de las células.
1869 • Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus
recogidos en vendajes quirúrgicos y
obtuvo mediante sus pruebas precipitado
crudo de ADN.
9. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
MÉTODOS EXTRACCIÓN EN
CONVENCIONALES FASE SÓLIDA
Tiocianato de
guanidinio- Matrices de
fenol- Sílica
cloroformo
Extracción Partículas de
alcalina vidrio
Método de Tierra de
Extracción
CTAB Diatomeas
Centrifugación en
gradiente de Perlas
bromuro de etidio-
cloruro de cesio.
Magnéticas
Purificación de
ARN Poli (A) por Material de
cromatografía de intercambio
celulosa de oligo
(dT). aniónico
10. PROTEÍNAS
Las proteínas desempeñan
un papel fundamental para la
vida y son
las biomoléculas más versátiles
y más diversas.
Son imprescindibles para el
crecimiento del organismo.
Realizan una enorme
cantidad de funciones
diferentes.
11. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
HISTORIA
• Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las
sustancias Albuminoides.
Siglo XVIII
• El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera
descripción de PROTEÍNA.
• Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El
1893 azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales.
• Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la
Segunda Guerra Mundial.
• Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método
para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está
1940 fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del
ataque a Pearl Harbor.
12. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
Cromatografía de
intercambio iónico.
Cromatografía de
filtración en gel.
Cromatografía de
afinidad.
Electroforesis en gel.
Southwestern
Blotting o
immunoblotting.
13. OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS
ALL IN ONE
SISTEMA DE EXTRACCIÓN
AUTOMATIZADO
14. TERMINOLOGÍA
• Es un proceso por el cual átomos, iones o
ADSORCIÓN: moléculas son atrapadas o retenidas en la
superficie de un material.
• Es una sustancia que desorganiza la
estructura tridimensional en
AGENTE CAOTRÓPICO: macromoléculas tales que proteínas,
ADN o ARN y las desnaturaliza.
CTAB (BROMURO DE • Es una sal de amonio cuaternario
HEXADECILTRIMETIL
AMONIO):
LISIS CELULAR: • Es la rotura de la membrana celular.
15. TERMINOLOGÍA
• Para homogeneizar células y tejidos en una
MICROPISTILOS EPPI escala de medición Eppendorf® para tubos de
PARA TUBOS DE ENSAYO: ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta).
• Es una denominación utilizada para referirse a
PELLET O PELET pequeñas porciones de material aglomerado o
comprimido.
SDS O NADS
(DODECILSULFATO SÓDICO • Es un compuesto tensoactivo iónico
O LAURILSULFATO SÓDICO)
• Es un tubo de microcentrífuga de forma
de un pequeño contenedor cilíndrico de
TUBOS EPENDORF plástico, con un fondo cónico y una tapa
unida al cuerpo del tubo para evitar su
desprendimiento.
17. LOS PASOS GENERALES PARA LA
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN
• EXTRACCIÓN:
– Lisis de las células que contienen a los AN
– Inactivación de nucleasas
–Clarificación: separación de los AN de los restos
celulares
• PURIFICACIÓN:
– De otros AN no deseados
– De Lípidos, carbohidratos
– De sales y otros compuestos orgánicos
18. LISIS CELULAR
El procedimiento ideal de
lisis celular debe tener la
fuerza necesaria para romper
el material de inicio (células o
tejido) y la delicadez
requerida para preservar las
moléculas de interés (ADN o
ARN).
19. MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA
EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS
MÉTODOS MECÁNICOS MÉTODOS NO MECÁNICOS
- AGENTES QUÍMICOS
- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO Detergentes: CTAB , SDS ENZIMÁTICOS
- CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN - Proteasas:
- ULTRASONIDO lisozima
Gluconasas
peptidasas
- ARNasa
22. 1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE
GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO
(MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):
Fundamento del método:
Extracción de ácidos nucleicos utilizando una
solución del agente caotrópico de Tiocianato de
Guanidino que genera lisis celular y degradación
de proteínas con la liberación de los ácidos
nucleicos.
Posteriormente el uso de solventes orgánicos
fenol- cloroformo que permiten su separación de
restos de proteínas, lípidos y la posterior
precipitación de los ácidos nucléicos usando
etanol o isopropanol.
23. EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE
CHONCZYNSKI
Muestra
vegetal - LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR
PULVERIZAR EN - DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E
EL MORTERO INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS.
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO A pH BÁSICO < 11
CENTRIFUGA
FENOL
CLOROFORMO ADN
FASE ACUOSA SUSPENSIÓN
ADN , RESTOS DE
PROTEÍNAS Y LIPIDOS PROTEÍNAS
CENTRIFUGA Y LÍPIDOS
DISUELTOS
FASE SÓLIDA
RESTOS DE ALTO PESO
MOLECULAR
ALCOHOL
ETÍLICO PURO
CENTRIFUGA
ADN EN FORMA
DE FILAMENTOS
PELLET DE ADN
24. EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE
CHONCZYNSKI
Homogenizado de
muestra vegetal
pulveriza previamente y
conservada en
nitrógeno líquido a
-196°C SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO A pH REDUCIDO -
ACETATO DE SODIO – FENOL -
CLOROFORMO
CENTRIFUGACIÓN A
4°C
ALCOHOL
ISOPROPÍLICO
FASE ACUOSA
ARN TOTAL
FASE ACUOSA PELLET DE ARN
TOTAL
FASE ORGÁNICA ARN TOTAL
ADN, PROTEÍNAS Y
LIPIDOS DISUELTOS
25. 2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
POR LISIS ALCALINA
Fundamento del método:
Se basa en las diferencias
en la desnaturalización y
renaturalización del ADN
plasmídico y el ADN
cromosómico al aplicar
NaOH en presencia de un
detergente fuertemente
aniónico como el
Dodesilsulfato de Sodio
(SDS) y Acetato de
potasio.
Se usa principalmente para
extracción de ADN plasmídico
de E. coli.
26. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS
ALCALINA
-Lisis celular
Crecimiento de
Cultivo bacteriano -Desnaturaliza
de E. coli Proteínas
ADN cromosómico
Detergente SDS
+ NaOH ADN plasmídico
Cosecha de cultivo
bacteriano
pH FUERTEMENTE
ALCALINO DEL
MEDIO
Acetato
pH NEUTRO DEL
de
MEDIO potasio
-ADN plasmídico -Precipitación:
se mantiene en ADN cromosómico.
CENTRIFUGAMOS
solución proteínas .
27. 3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
Fundamento del método:
- Elaborado por Murray y Las células vegetales
Thompson en 1980. pueden lisarse con el
detergente iónico bromuro
- Adecuado para extraer y de cetiltrimetil amonio
purificar ADN de vegetales y (CTAB), que forma un
especialmente indicado para complejo insoluble con los
eliminar los polisacáridos y ácidos nucleicos en medio
los compuestos polifenólicos hiposalino. De ese modo,
que dañarían al ADN. los polisacáridos, los
compuestos fenólicos y los
demás contaminantes
permanecen en el
sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado.
28. PASOS:
2.- Suspender la
1.- Se debe moler la muestra en
muestra después de solución tampón 3.-Centrifugo, elimino
congelación con de extracción, que el sobrenadante y lavo.
Nitrógeno líquido contiene EDTA,
Tris-HCl y CTAB.
ADN 5.-Añado etanol 4.- Incrementando la
puro y ARNasa concentración salina
29. EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR
Y NUCLEAR
30. EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO
INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
32. 4.- CENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE DE BrEt - CsCl
- Técnica usada para la Mini
preparación de ADN plasmídico .
- Requiere de cultivo bacterial a gran
escala.
- Separa ADN plasmídico
superenrrollado del ADN
plasmídico circular que está en
estado relajado, concentrándolos
por centrifugación en una
gradiente de Bromuro de Etidio – Superenrrolado: DNA circular.
Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.) Covalentemente DNA que no se ha
cerrado y muy empacado.
empacado.
33. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
• Fundamento del método:
El BrEt ingresa y se intercala en
la cadena de ADN
disminuyendo su densidad, pero
lo hace en mayor cantidad en el
ADN plasmídico en estado
relajado que en el ADN
plasmídico superenrrollado.
pudiéndose separar por
centrifugación en el gradiente
de densidad de CsCl.
34. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA
GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA
+ BROMURO DE ETIDIO CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE
CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
35. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE
BrEt - CsCl
GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
37. 4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR
CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)
En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en
que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de
200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli
A+.
Cromatografía de afinidad
Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros
ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en
la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre
sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T
que contiene la resina cromatográfica.
38. Mediante purificación de
poli(A)-ARN: hay ARNm
con una cola de
poliadeninas, mas de 100,
llamada poli(A), estos ARN
se pueden aislar por
cromatografía en columna
de celulosa de oligo dT
celulosa. La cola poli(A)
hibridará con la cadena
oligo dT, fijándose en la
columna. Después de lavar
los ARN no fijados el
ARNpoli(A) se eluye y se
precipita con alcohol etílico
frío.
39. Existen 2 métodos utilizados para la
purificación de ARN poli(A)
Cromatografía en Cromatografía de
columnas de oligo
(dT) lote
La cromatografía en columnas es trabaja con ARN
usada normalmente para la mamífero en pocas
purificación de grandes cantidades de cantidades de muestras
ARN Poli (A) no radiactivo aislado de que pueden ser
células mamíferas. radiactivos o no
40. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE
SÓLIDA
Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los
métodos convencionales.
Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos
en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido
de sales del buffer.
La interacción de los puentes de hidrógeno con una
matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas
El proceso de
Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por
absorción está
medio de un intercambio aniónico
basado en los
siguientes principios
y mecanismos de exclusión por afinidad y
tamaño.
41. La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el
uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas.
Partículas de vidrio
Tierra de diatomeas
TIPOS soporte sólido (fase estacionaria).
Matrices de sílica
Transportadores de
intercambio aniónico
PASOS DE FASE SÓLIDA
lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y elución.
Tiras de 8 columnas Placa de 96 columnas
42. Puede ser hecho utilizando un buffer a un
• Acondicionar la
pH particular para convertir la superficie o
columna para la
grupos funcionales sobre el sólido dentro
adsorción de la muestra
de una forma química particular
• Luego la muestra la cual ha sido degradada por
el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la
columna
• El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con
la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la
solución enlazante
43. PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE
SÓLIDA
1. se acondiciona la columna para la
absorción de la muestra. Esto puede ser 5. Luego los ácidos nucleicos se
hecho usando un tampón a un pH eluyen con un tampón de máxima
definido salinidad
2. Luego, convierte la superficie o
grupos funcionales en el solido es decir
en una forma particular de química 6. se precipita con isopropanol
para lavar y eliminar todos los
3. El ácido nucleico deseado se absorberá a restos de impurezas
la columna con la ayuda de un alto pH y
concentración de sal de la solución
enlazadora.
7. finalmente, se reconstituye el
4. La muestra que fue degradada mediante el ADN de elevada pureza en un
uso de solución amortiguadora se aplica a la tampón de baja salinidad para su
columna posterior utilización o
almacenamiento
44. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA
La matriz de silica hidratada la cual fue El principio de está basada en
preparada por reflujo de óxido de la elevada afinidad de las
silicio en hidróxido de sodio o cadenas de ADN cargadas
hidróxido de potasio en una negativamente con respecto a
proporción molar de aproximadamente las partículas de sílica cargadas
2: 1 respectivamente a 10: 1 por al positivamente.
menos cerca de 48 horas habían sido
introducidas en la purificación del
ADN. El ADN se enlaza a la matriz
inorgánica y es liberada en agua
caliente.
45. PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA
El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que
atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las
cadenas de ácidos nucleicos.
DNA eluye de
la sílica en
agua
DNA se une
a la sílica
en NaI
46. Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas
facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.
La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre
debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de
cromatografía de adsorción.
Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice
y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido
nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones
de sales caotrópicas.
47. TIERRA DE DIATOMEAS
(DIATOMITA)
Es una roca sedimentaria silícea formada
por micro-fósiles de diatomeas, algas
marinas unicelulares que secretan un
esqueleto silíceo llamado frústula.
48. PROPIEDADES
• Baja densidad.
• Alta porosidad.
• Dureza .
• Capacidad abrasiva suave.
• Conductividad térmica
muy baja.
• Alta resistencia a la
temperatura.
• Capacidad muy alta para
absorber líquidos.
50. DIATOMITA
La diatomita puede ser utilizado
para la retirada del DNA en
presencia del agente
caotrópico altamente concentrado
tal como el ioduro de sodio,
guanidinium hydrochloride y
guanidinium thiocyanate.
51. DIATOMITA La diatomita tiene
contenido de sílice
hasta en un 94%. Ha
sido usado para
filtración y en
Quitan el DNA trenzada doble cromatografías.
pero no el ARN o las proteínas.
La diatomita resultante enlazada con el ADN es
luego lavado con un tampón que contiene alcohol.
Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un
tampón bajo en sal o en agua destilada.
52. PURIFICACIÓN DE ÁCIDO
NUCLEICO BASADO EN
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS
La separación magnética es una
manera simple y eficiente el cual
es utilizado actualmente en la
purificación de ácido nucleicos.
53. Se utilizan Preparados A partir de
transportadores biopolímeros.
magnéticos.
Materiales con Polímeros
una gran área sintético
superficial , son Vidrio poroso
preferidos para Basado en
ser usados en la materiales
adherencia de magnéticos
ácidos inorgánicos
nucleicos.
54. ÓXIDO DE HIERRO
Óxido de hierro (II, III) u
óxido ferroso férrico
(Fe3O4).
Los momentos
magnéticos de los
distintos cationes de
hierro del sistema se
Magnetita encuentran fuertemente
acoplados.
Esta moléculas van
actuar como un
imán.
55. Purificación de ácido nucleico basado en
partículas magnéticas
Purificación de
ácidos nucleicos
Uso de perlas magnéticas en base
implica cuya superficie tiene a:microesferas
una carga que se puede
cambiar basándose en el pH
magnéticas .
o tampón. A pH bajo, están
cargados positivamente,
atrayendo a las moléculas de El ácido nucleico
ADN con carga negativa y es luego eluído de
permitiendo que las
las partículas
proteínas y los
contaminantes que se magnéticas con un
elimina mediante lavado. tampón de elución.
56. MATERIAL DE INTERCAMBIO
ANIONÍCO
El ejemplo mas popular que se utiliza en el
principio del intercambio iónico es « Resina
de intercambio iónico».
Se basa
En la interacción entre grupos cargados
positivamente de la celulosa de
dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y
fosfatos cargados negativamente del ADN .
57. Una resina de intercambio iónico puede
considerarse como una estructura de
cadenas hidrocarbonadas.
Estas cadenas se encuentran unidas
transversalmente formando una matriz
tridimensional que proporciona rigidez a la
resina y entrecruzamiento que determina la
estructura porosa interna de la misma.
59. Cromatografía de
intercambio iónico
TIPOS DE Cromatografía
Electroforesis EXTRACCION de filtración en
en gel DE gel
PROTEINAS
Cromatografía
de afinidad
60. Proteínas
Seroalbúmina
extracelulares
1) Solubilizar a
la proteína y
separarla Liberarse de la
Proteínas
citoplasmáticas célula.(lisis celular)
65. CROMATOGRAFIA
2 fases
Móvil Estacionaria
(Liquido o gas) (Papel o gel
66. Aspectos históricos de la cromatografía
La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge,
que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se
podían separar por migración cuando se colocaba una solución que
los contenía sobre un material poroso, como papel.
En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna
para separar extractos vegetales coloreados.
Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.
En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo
Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía
en el campo de la química orgánica e inorgánica.
Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939
respectivamente.
67. Aspectos históricos de la cromatografía
A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión
mundial.
En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y
desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus
trabajos en 1948.
Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el
campo de la bioquímica.
Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados
68. Cromatografía de
Filtración en Gel
Fase fija Fase móvil
Formada por polímeros
biológicos o sintéticos Tampón en el cual,
la mezcla de
proteínas se
encuentra disuelta
Polímeros forma de pequeñas bolitas.
Diámetro 10-250 µm.
Estos se hinchan con una disolución de tampón Agarosa
acuosa y se introducen en una columna Dextrano
poliacrilamida
71. Cromatografía de intercambio iónico
• Sustancias ionizables:
• DEAE =DIETILAMINOETIL
fase • CM = CARBOXIMETIL
estacionaria • Tienen carga (+)
• Proteínas con carga (-) se unen al
CM y quedan retenidas.
• Las proteínas neutras y las que
Fase móvil tienen carga (+) eluyen
libremente.
• Usar tampón con elevada
concentración de NaCl
73. Las proteínas cargadas negativamente se
unen a la fase estacionaria
Las proteínas cargadas positivamente Fase estacionaria
eluyen
FASE ESTACIONARIA
74. Ofrece la mayor especificidad y selectividad
para el aislamiento y purificación de
biomoléculas
En esta técnica la molécula que se une
específicamente a la proteína se conoce con el
nombre de ligando mientras que otras pasan
por la columna
75. Las proteínas La unión entre el
Después de
deseada se eluye ligando y
eliminar los
de la columna moléculas diana de
contaminantes, el
mediante una las proteínas debe
ligando acoplado
solución que ser reversible para
debe conservar su
contiene una alta permitir que las
afinidad de unión
concentración de la proteínas deban
específica para las
forma soluble del eliminarse en una
proteínas diana
Ligando. forma activa
77. TIPOS DE MOLÉCULAS DIANA
LIGANDO
Enzima Análogo de sustrato, inhibidor, cofactor
Anticuerpo Antígeno, virus
Lectina Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célula
ácido nucleico Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de
ácido, la proteína de unión de ácido nucleico
hormonas y Receptor, proteína portadora
vitamina
El glutatión Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST
Los iones Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína y
metálicos residuos / triptófano en sus superficies
79. Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del
equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las
cuales se va a llevar a cabo la separación:
Electroforesis Electroforesis en gel
Isoelectroenfoque
capilar de poliacrilamida
Electroforesis Electroforesis en gel Electroforesis
en papel. de agarosa. bidimensional
Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los
geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis)
debido a su buena resolución y gran versatilidad.
80. Es uno de los métodos más utilizados para
la purificación, análisis y caracterización de
proteínas según su relación tamaño a carga
eléctrica en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada.
usándose como base una matriz gelatinosa,
ya sea de agarosa o poliacrilamida
82. COMO OBTENGO LA POLIACRILAMIDA
POLIACRILAMIDA
se mezcla acrilamida en Es químicamente inerte, de
diferentes proporciones propiedades uniformes, capaz
, con el agente de ser preparado de forma
entrecruzante N,N’ rápida .
metilen bis acrilamida Es un gel transparentes con
estabilidad , insolubles en
Además tiene la ventaja agua, y que permiten buena
de que variando la visualización de las bandas
concentración de durante tiempo prolongado
polímeros, se puede
modificar de manera Tiene un amplio rango de
controlada el tamaño pHs, temperatura y fuerza
del poro iónica.
84. La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a
cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).
Las diferencias entre uno y otro son :
SDS-PAGE cuando las proteínas se
ND-PAGE las proteínas solubilizan en presencia del
mantienen su estructura detergente aniónico SDS , éste se
tridimensional y las une a las proteínas, rompiendo
diferentes cadenas interacciones hidrofóbicas y
polipeptídicas pueden desnaturalizándolas. Las proteínas
permanecer unidas, desnaturalizadas de la muestra
separándose no sólo en adoptarán una estructura en forma
función de su carga de bastoncillo con una serie de
eléctrica, sino también moléculas de SDS cargadas
según su tamaño y negativamente a lo largo de la
forma cadena polipeptídica.
Las proteinas se separan en base a
su masa molecular
85. Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es
sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través
del gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar
moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o
aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico
muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta
cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.
86. Marcadores de peso
molecular:
Mezcla de diferentes
proteínas preteñidas
de las que conocemos el
peso molecular.
Por comparación podemos
averiguar el PM aparente
de nuestra proteína
87. SOUTHWESTERN BLOT O
IMMUNOBLOTTING
Es un método utilizado en
BIOLOGÍA MOLECULAR; Muchas de las proteínas
enlazadas por ADN en
El método lleva el nombre la célula deben ser
de su inventor, el británico Aisladas
biólogo Edward Southern .
individualmente y
Fue descrito por primera vez caracterizadas para
en 1981. definir la función del
gen.
88. método que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar
proteínas de unión a ADN
Es una técnica de detección
Es un proceso que se utiliza
de moléculas de ácido
para el análisis del ADN.
ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de
una mezcla compleja.
89. SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING
1. Se separan las proteinas 2. Las proteinas separadas son
mediante electroforesisen transferidas en un filtro de
gel de poliacrilamida sodio membrana de nitrocelulosa
dodecilsulfato difluoruro de polivinilideno
3. Las proteinas unidas a la menbrana
se incuban luego con sondas de
oligonucleotidos de secuencia
especifica de ADN para las proteínas
absorbidas y analizarlas
90. ELECTROFORESIS
Se separan las proteínas o los ácidos
nucleicos en un gel de electroforesis
TRANSFERENCIA (BLOTTING)
Se transfieren las bandas de proteínas o de
ácidos nucleicos desde el gel hacia una
membrana de nitrocelulosa (flechas azules)
para que puedan reaccionar con la sonda
radioactiva.
Se añaden Anticuerpos radiactivos contra
una proteína o sondas radioactivas de
ácidos nucleicos (con secuencia conocida).
Se espera a que reaccionen (A). Se coloca
la membrana de nitrocelulosa sobre una
placa fotográfica y se revela (B).
91. Extracción de biomoleculas
All-In-One
Para la extraccion de acidos nucleicos se siguieron
los pasos de Chomczynski y Sacchi (1987).
Este método involucra la lisis celular con
isotiocianato de guanidinio y fenol en una solución
de una fase.
92. El homogeneización de la muestra:
Permite la disgregación de la
estructura celular para facilitar la
salida de los ácidos nucleicos. Esto
con la utilización de SDS.
Este método implica la lisis de la
célula en presencia de agentes
desnaturantes fuertes de proteínas
(isotiocianato de guanidinio y fenol)
en una solución monofásica.
93. Extracción Fenol-Cloroformo: ADN
y/o ARN
MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1) PH: reducido
desproteiniza e inhibe nucleasas
FASE ACUOSA: ARN
FASE ORGANICA: ADN Y
PROTEINAS
El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica por
precipitación con etanol o isopropanol .
ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.
94. Sistema de extracción
automatica
Es un Sistema de instrumentación muy grande, complejo y
costoso, diseñado para un alto volumen de procesamiento de MagNA Pure LC 2.0
muestras.
El hecho de automatizar el proceso de extracción de ácidos
nucleicos es beneficioso para una serie de razones:
Reduce el tiempo de trabajo.
Disminuye los costos laborales.
Aumenta la seguridad de los trabajadores
Aumenta la reproducibilidad calidad de los resultados.
Sobre todo minimiza el riesgo de contaminación cruzada.
95. Oprimir el botón de
sistema de manipulación de partícula Inicio. El ADN es eluído
paramagnética para procesar la muestra y 3 en un tampón de elución
proporcionar un rendimiento constante y al final del proceso
pureza ya que no hay detectable
contaminación cruzada , entre las
muestras
Colocar el cartucho del
2 reactivo dentro de la
El proceso de extracción completo máquina.
dura unos 20 minutos desde el
comienzo hasta el final
Añadir la muestra
1 líquida al cartucho del
reactivo.
SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS
96. Magna pure
Pequeño tamaño basado en el uso de
partículas magnéticas.
El ácido nucleico obtenido es altamente puro
Ausencia de contaminación cruzada mediante
filtros Hepa.
Descontaminación por rayos uv
Demora Máximo de 30 minutos
Es posible trabajar con un amplio rango de
muestras (sangre total, suero, plasma,
tejidos, células en cultivo, etc.),
Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de
alta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica
97. Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicos
MagNA Pure LC 2.0 (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales)
Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas
mononucleadas, células blancas, tejidos vegetales
Realiza labores de pre-pcr en distintos formatos
1 2
Unidad
Unidad inicio procesamiento
3
Unidad de elución
y post-elución
98. La automatización ha
ayudado en el aumento Por lo tanto las estaciones de
del rendimiento y trabajo robótico para extracción
mejora la fiabilidad del de ácidos nucleicos deben cumplir
proceso con una verdadera ¨Walk-away¨ ,
automatización, lo que significa
un proceso totalmente
automatizado
un sistema portátil de
extracción , ofrece varias
ventajas , tales como la
mano de obra reducida,
reducción de los residuos y
aumento de la velocidad
99. conclusiones
• Las técnicas generales de purificación y extracción de ácidos nucleicos; tanto
los métodos convencionales como los métodos modernizados gracias al
desarrollo de la tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a los
investigadores y científicos a adquirir mejores resultados y es esencial en una
gran cantidad de aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de parentesco,
para detectar enfermedades hereditarias, para conocer los genes de una
persona, clonación, etc.
Automatización de ácido nucleico , este proceso de
extracción es potencialmente beneficioso para un
número de razones entre ellas , para reducir el tiempo
detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento
de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo
proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la
calidad de aumentar los resultados