Este documento describe los protocolos utilizados para extraer ADN y ARN de cepas de Trichoderma spp. mediante electroforesis. Se extrajo ADN de cuatro cepas de hongos utilizando un protocolo modificado, y ARN de una cepa de Trichoderma harzianum usando un protocolo para fresas. La calidad de las muestras de ácidos nucleicos se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, observándose bandas difusas debido a fallas en el proceso.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA
VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL
Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B
EXTRACCIÓN POR ELECTROFORESIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
ADN Y ARN DE CEPAS DE Trichoderma sp.
Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Investigaciones Genéticas. UNET.
RESUMEN
El diagnóstico molecular está basado en el análisis de los ácidos nucleicos ADN y ARN. El
análisis de ADN permite obtener información de la estructura de un gen, mientras que el
análisis del ARN aporta la información funcional sobre la expresión de una proteína. En la
presente actividad de laboratorio se realizó la extracción de ADN de cepas de Trichoderma
longibrachiarum (LIG052), Trichoderma atroviride (LIG042), Botrytis sp. (LIG035) y
Stromatinia cepivorum (LIG020), y para ARN se empleó una cepa de Trichoderma
harzianum (LIG064). La extracción de ADN se practicó utilizando el protocolo modificado
para extracción de ADN de Crinipellis, y para ARN el protocolo de extracción de ARN de
fruto de fresa, ambos propuestos por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas UNET. Se
verifico la calidad de las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa 1%,
observándose un recorrido difuso de las bandas electroforéticas debido a fallas reveladas
durante el proceso.
Palabras clave: ADN, ARN, electroforesis, Trichoderma spp., peso molecular.
INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos constituyen
compuestos nitrogenados de elevado peso
molecular que se pueden encontrar en las
células asociados a proteínas formando
complejos llamados núcleo-proteínas. Se
conocen dos grupos de ácidos nucleicos,
ARN (ácido ribonucleico) y el ADN
(ácido desoxirribonucleico). La función
biológica de los ácidos nucleicos es
fundamental, el ADN está asociado con el
material genético de las células, pudiendo
encontrarse como una sola cadena en
algunos microorganismos o formando
parte de núcleo-proteínas de los
cromosomas en organismos superiores,
almacenando información genética y
como molde para la síntesis de proteínas,
se localiza principalmente en el núcleo y
en muy poca cantidad en mitocondria y

2. cloroplastos. El ARN participa en la
síntesis de proteínas y se distribuye en toda
la célula, mayormente en citoplasma en
forma soluble o formando parte de los
ribosomas (Voet & Voet, 2006).
Los últimos avances en filogenia,
clasificación e identificación de hongos,
así como las técnicas de detección y
cuantificación de hongos (antagonistas y
fitopatógenos) están basadas en técnicas
que incluyen la extracción de ácidos
nucleicos (ADN y ARN) y el uso de la
electroforesis en gel de agarosa. Estos
métodos de extracción se basan en la
homogenización de la muestra, y rotura de
las parees celulares del hongo mediante
agentes químicos como enzimas o
detergentes, y mecánicos, como perlas de
vidrio y agitación; una vez rotas las celulas
y liberados los ácidos nucleicos, se
purifican con productos químicos como el
fenol y el cloroformo, y se precipitan con
alcoholes como el isopropanol (López,
2011). La electroforesis en gel de agarosa
es una técnica que se emplea para separar
macromoléculas en función del tamaño, la
carga eléctrica y otras propiedades físicas,
constituye un método normalizado que se
utiliza para separar, identificar y purificar
fragmentos de ADN y ARN (Somma &
Querci, 2007).
Microorganismos antagonistas, como el
Trichoderma spp., también denominados
agentes de control biológico (ACBs),
suelen encontrarse de forma natural en el
suelo, y conllevan efectos beneficiosos
para los cultivos (Suarez-Estrella et al.,
2007). Los aislados de Trichoderma se
encuentran entre los agentes de control
biológico más utilizados en agricultura, ya
que actúan eficazmente contra numerosos
hongos fitopatógenos presentes en el suelo
(Chet, 1987). Se caracteriza por presentar
rápido crecimiento, posee una gran
capacidad de esporulación y de adaptación
a un amplio rango de suelos agrícolas, sin
embargo, a pesar de su sensibilidad a
diferentes condiciones abióticas
medioambientales como temperatura,
humedad y nutrientes, su gran
adaptabilidad les permite sobrevivir en
gran número de hábitats (Hjeljord &
Tronsmo, 1998).
Estos microrganismos interaccionan con
los patógenos de plantas compitiendo por
los nutrientes, generando metabolitos
secundarios con efecto antibiótico o
parasitando directamente a los organismos
fitopatógenos. Además, mejoran el
crecimiento de las plantas y generan
resistencia inducida en frecuentes
situaciones de estrés (Alabouvette et al.,
2006).
El seguimiento y monitorización de los
ACBs aplicados en agricultura, incluido el
Trichoderma spp., requiere de
herramientas que nos permita conocer,
detectar y cuantificar la calidad de un
determinado microorganismo presentes en
una muestra (López, 2011). Al respecto, el
objetivo de la presente actividad de
laboratorio consistió en la extracción de
ADN y ARN de aislado de cepa de
Trichoderma spp. perteneciente al cepario
del Laboratorio de Investigaciones
Genéticas de la UNET.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de ADN
Se siguió el protocolo modificado para la
extracción de ADN de Crinepellia,
sugerido por el Laboratorio de
Investigaciones Genéticas de la UNET. Se
tomó una porción de micelio del hongo y
se maceró con 800 µl de buffer de
extracción (lisis celular) (0,4 M NaCl, 25
mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH
8,0) (Fig. Nº 1). Una vez macerada la
muestra, se coloca en un tubo eppendorf,
agitando con vórtez por 10-15 s. Se
agregan 40 µl de SDS 20% (sulfato
dodecil de sodio), para cambiar la
permeabilidad de las membranas y
romperlas, y 8 µl de Proteinasa K 20
mg/ml, para facilitar la desnaturalización
de las proteínas. Se procede a incubar las
muestras de 55-65 ºC por una hora, y se
deja enfriar antes de centrifugar durante 10
min a 9000 rpm, procediendo a transferir
el sobrenadante (750 µl) a un nuevo tubo
eppendorf. La extracción se realizó
mediante la adición de 500 µl fenol
cloroformo isoamilalcohol (25:24:1),
eliminando desechos de las proteínas. Se
procede a incubar durante 30 min a 4 ºC,
centrifugando posteriormente a 10000 rpm
por 5-10 min. Se recuperó el sobrenadante
en un nuevo tubo eppendorf, descantando
el cloroformo isoamilalcohol remanente.
La precipitación del ADN consistió en
agregar 0,1 vol de acetato de socio 3 M
(pH 7) y 0,94 vol de isopropanol frio,
agitando varias veces los tubos, incubando
bajo refrigeración toda la noche.
Posteriormente, las muestras son
centrifugadas por 10 min a 9000 rpm,
procediendo a eliminar el sobrenadante,
lavar con 100 µl de etanol (80%) frio y
centrifugar de nuevo. El precipitado se
resuspendió en 50 µl de Buffer Tris-EDTA
(TE: Tris HCl 20 mM, pH 8, EDTA 1 mM,
pH 8). La calidad y cantidad se determinó
por comparaciones con concentraciones
conocidas por electroforesis en geles de
agarosa al 1% con bromuro de etidio,
usando 2 µl de marcador PST-L.
Fig. Nº 1. Maceración del micelio de
Trichoderma spp. con buffer de extracción.
Extracción de ARN
Para la extracción de ARN, se aplicó el
protocolo modificado de fresas planteado
en el Laboratorio de Investigaciones
Genéticas de la UNET. La
homogenización de la muestra de
Trichoderma sp., consistió en mezclar 2 g
de la muestra con N2 líquido, pasar la
muestra a 10 ml de buffer de extracción (7
ml H2O DEPC, 1 ml Tris ClH 1M pH 7,4,

4. 1 ml EDTA 0,5M pH 8, 1 ml NaCl 5M),
mantenido sobre hielo hasta su completa
descongelación. Se le añadió 140 µL de β-
mercaptoetanol, se aplicó vortex, se añadió
1 ml SDS 20% y se agitó de nuevo en
vortex. La eliminación de proteínas de la
muestra consistió en incubar por 15 min a
65 ºC, añadiendo posteriormente 3,3 ml
AcK 5M, se agitó en vortex, enfriado
continuo a -20 ºC por 10 min y se
centrifugó a 15.000 rpm por 30 min a 4 ºC,
procediendo a recuperar el sobrenadante.
Para la recuperación de carbohidratos y
ácidos nucleicos, se añadieron al
sobrenadante recuperado 7 ml de
isopropanol y se agitó en vortex,
procediendo e enfriar la muestra a -20 ºC
por una hora, se procedió a centrifugar por
30 min a 15.000 repm y 4 ºC, descartando
el sobrenadante y dejando secar el pellet
por 10 min invirtiendo el tubo. Se le
adicionó 700 µL de buffer TE (Tris-
EDTA) para resuspender el pellet,
manteniendo sobre cama de hielo por 3-5
min. Se efectuó centrifugación por 2 min
con el objeto de recuperar el sobrenadante,
añadiendo 75 µL de AcNa 3M, pH 5,2 y
500 µl isopropanol, incubando a -20 ºC. A
la postre, se procedió a centrifugar por 15
min (rt), descartando el sobrenadante. Se
lavó el pellet dos veces con EtOH 70%,
secando los pellets a 37 ºC,
resuspendiendo en 2 ml de H2O utilizando
una aguja, procediendo a cargar en gel 10
µl. Para precipitar los carbohidratos, se le
añadió a 2 ml de la muestra, 11,8 ml de
H2O DEPC, 1,2 ml AcNa pH 4,5 y 6 ml 2-
BE, se procedió a incubar la muestra a 4 ºC
durante 30 min, y se centrifugó a 16000
rpm durante 20 min a 4 ºC, finalmente se
recuperó el sobrenadante. Para la
precipitación de ácidos nucleicos, se le
añadió a la muestra 9 ml 2-BE, se procedió
a incubar a 4 ºC por 30 min, se centrifugó
por 16000 rpm durante 20 min a 4 ºC,
descartando el sobrenadante. El pellet se
lavó con EtOH 70% y EtOH 100%, se secó
en estufa a 37 ºC y finalmente se procedió
a resuspender en 1 ml de H2O DEPC. Para
precipitar el ARN, se procedió a añadir
340 µL ClLi 12 M y se incubó a 4 ºC toda
la noche. Posteriormente, se centrifugó a
15000 rpm durante 45 min a 4 ºC y se lavó
el pellet con EtOH 70% y 100%, luego se
dejó secar a 37 ºC, procediendo a
resuspender el pellet seco en 50 µl de H2O
DEPC. Se cuantificó incluyendo la
relación de carbohidratos y proteínas.
Preparación del Gel de Agarosa 1%
La electroforesis de ácidos nucleicos en
gel de agarosa constituye una herramienta
imprescindible de la biología molecular
para caracterizar, identificar y aislar ADN
y ARN. La electroforesis en gel de agarosa
es empleada para visualizar la integridad
de ADN genómico y para evaluar la
presencia e integridad de las diferentes
especies de ARN. Debido a que el gel de
agarosa no es desnaturalizante los
fragmentos de menor tamaño se mueven
con mayor facilidad a través de los poros
de la matriz de agarosa mientras que los
fragmentos grandes se enfrentan a mayor
resistencia y por ende migran lentamente.
Los geles de agarosa concentrados (1-3%)

5. oponen mayor resistencia al tránsito de los
ácidos nucleicos y por ende permiten
lograr mayor resolución. La resolución y
velocidad de separación de fragmentos de
ADN o ARN por electroforesis son
reguladas a través de la concentración de
agarosa en el gel y el voltaje aplicado
durante la electroforesis (Posso &
Ghneim, 2008).
El procedimiento para preparar el gel de
agarosa 1% (p
/v) en TBE 1 x estéril,
consistió en sellar los bordes de un molde
de plástico limpio y seco con cinta
adhesiva (tirro). Se procedió a colocar el
peine adecuado de modo que se formen
pocillos completos al añadir la solución de
agarosa. Se preparó y diluyó la cantidad
adecuada de la solución buffer TBE 1 x
estéril para llenar la cubeta de
electroforesis y preparar el gel. Se
procedió a pesar la agarosa en polvo según
los cálculos para el 1% y se añadió en un
matraz de Erlenmeyer (normalmente 150
ml de solución de gel para un molde de 15
x 15 cm y 100 ml de gel para un molde de
15 x 10 cm), sobre el tampón TBE 1x. Se
procedió a calentar hasta disolver
completamente la agarosa. Se dejó enfriar
la mezcla a 50-60 ºC, y se le añadió el
bromuro de etidio hasta lograr una
concentración final de 0,2 µg/ml. La
solución se vació en el molde y se dejó
formar el gel. Una vez formado el gel, se
retiró cuidadosamente el peine y el tirro
para colocar el gel en la cubeta de
electroforesis. Se añadió el buffer TBE 1x
a la unidad de electroforesis de modo que
el gel quede cubierto por una capa de
aproximadamente 2-5 mm (Somma &
Querci, 2007).
Proceso de Electroforesis
Para la verificación de la calidad y pureza
de las extracciones de ADN y ARN, se
colocaron 2,5 µl de ADN / ARN, 3 µl
buffer de carga, 4,5 µl H2O, en cada pozo
de carga, siguiendo la secuencia, para
ARN (1), (2), (3) y (4) Trichoderma
harzianum LIG064, (5) Master 
DNA/Hind III, y para ADN (6)
Trichoderma longibrachiarum (LIG052),
(7) Trichoderma atroviride (LIG042), (8)
Botrytis sp. (LIG035) y (9) Stromatinia
cepivorum (LIG020). Se procedió a
colocar el soporte del gel en la cubeta de
electroforesis, añadiendo el buffer de
electroforesis TBE 1x, de forma que cubra
bien el gel de agarosa, tapando la cubeta de
electroforesis y conectando los electrodos
a la fuente de alimentación. Se programó
la fuente a unos 80 – 100 voltios y se inició
la electroforesis por aproximadamente 45
– 60 min. Una vez acabado el proceso de
electroforesis, se visualizaron los
fragmentos de AND y ARN mediante luz
UV y se realizó una fotografía de la
imagen.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
El proceso de electroforesis a través de
geles de agarosa permite separar las
moléculas de ADN y ARN de acuerdo a su
peso molecular. Los resultados expuestos
en el presente informe corresponden al

6. pool de muestras evaluadas por los grupos
Nº 1 (02/01/2016) y Nº 2 (27/02/2016), de
la asignatura Técnicas Avanzadas de
Laboratorio, correspondiente a la Maestría
en Agronomía UNET. Los resultados en
ambos grupos corresponden a la secuencia
(1), (2), (3) y (4) Trichoderma harzianum
LIG064 para ARN, (5) Master 
DNA/Hind III, y (6) Trichoderma
longibrachiarum (LIG052), (7)
Trichoderma atroviride (LIG042), (8)
Botrytis sp. (LIG035), (9) Stromatinia
cepivorum (LIG020), para ADN.
Diversos factores tienen una marcada
influencia sobre la distribución y
migración del ADN o ARN a través del gel
de agarosa, como el tamaño del ADN (a
mayor tamaño de la molécula
generalmente migra más lentamente), la
concentración de la agarosa, conformación
del ADN, voltaje aplicado, dirección del
campo eléctrico, composición de las bases
y temperatura, presencia de agentes
intercalantes y composición del buffer de
electroforesis (Yábar, 2003). Estos
factores suelen confundir los resultados
finales, por lo que se recomienda al
investigador estandarizar algunos
parámetros importantes que en la práctica
suelen pasar desapercibidos.
Durante el desarrollo de la actividad
práctica (Grupo Nº 1), fue continua la falla
a nivel eléctrico, presentándose
variaciones de voltaje con la fuente de
poder, se presume que, a problemas
externos del suplidor de energía eléctrica,
a problemas internos del equipo, como
sulfatación de las conexiones, o a calidad
de la concentración de la solución buffer
usada en el proceso, por lo que se observa
una imagen difusa en la placa de
electroforesis (Fig. Nº 2).
Fig. Nº 2. Placa de Electroforesis en Gel de
Agarosa correspondiente al Grupo Nº 1.
En la placa de electroforesis del Grupo Nº
1, se presenta un escaso desplazamiento de
las bandas. La zona correspondiente a las
muestras de ADN es completamente
difusa, seguido del marker Lambda, y se
visualiza la banda correspondiente a la
muestra de ADN genómico (8) Botrytis sp.
(LIG035). Al respecto, la continuidad y
variación del voltaje aplicado permite la
movilización de las moléculas de ADN de
un polo a otro, a medida que aumenta la
fuerza del campo eléctrico (aumento del
voltaje), se incrementa la movilidad de las
moléculas de ADN de alto peso molecular,
pero de manera indistinta, generando que
las moléculas no se separen
ARN (1) ARN (2) ARN (3) ARN (4) Lambda ADN (6) ADN (7) ADN (8) ADN (9)

7. completamente unas de otras a pesar de
aumentar la velocidad de electroforesis
(Yábar, 2003). Posiblemente esta es una de
las causas de la baja calidad de la placa
electroforética obtenida por el Grupo Nº 1.
La calidad del buffer de electroforesis
puede ser otra de las causas de la baja
calidad de la placa, la migración del ADN
es afectada por la composición y la fuerza
iónica del buffer de electroforesis. En el
caso de usar un buffer de baja
concentración, la conductividad eléctrica
disminuiría drásticamente por la falta de
iones y, en consecuencia, la migración del
ADN sería casi nula. Si la concentración
de iones fuera excesivamente alta, la
conductividad eléctrica sería muy eficiente
y se generaría un sobrecalentamiento del
buffer. El calor excesivo podría causar la
licuación de la agarosa o la denaturación
del ADN (Yábar, 2003). Sin embargo, ya
que se observa desplazamiento de la
muestra de ADN (8) Botrytis sp.
(LIG035), se deduce que la falla de la
actividad práctica esta direccionada al
problema eléctrico.
En la placa electroforética del Grupo Nº 2
(Fig. Nº 3), para ARN se observan
claramente las subunidades
correspondientes al Trichoderma
harzianum LIG064 (1), (3) y (4), y en
menor cantidad la banda (2). El marker 
(5) se visualiza de forma íntegra. En el
caso del ADN las subunidades
correspondientes a Trichoderma
longibrachiarum (LIG052) (6), Botrytis
sp. (LIG035) (8) y Stromatinia cepivorum
(LIG020) (9) se aprecian sutilmente, a
excepción de la Trichoderma atroviride
(LIG042) (7), que evidencia signos de
degradación de la muestra.
Fig. Nº 3. Placa de Electroforesis en Gel de
Agarosa correspondiente al Grupo Nº 2.
En el caso haber logrado un efectivo
proceso de electroforesis, la imagen
obtenida del gel mediante la visualización
de luz UV debe aportar la información
correspondiente a los pesos moleculares de
ADN o ARN extraídos a las muestras. El
uso de patrones de peso molecular (PM) se
usa comúnmente, el marker Lambda
DNA/Hind III constituye una referencia
útil para calcular los pesos moleculares de
fragmentos de ADN, después de la
separación electroforética; el Lambda
DNA/Hind III Marker (Fig. Nº 4) se
obtiene a partir de ADN del fago λ
digerido con Hind III hasta generar bandas
entre 0,125 kb y 23 kb, aptas para ser
utilizadas como marcadores de peso
ARN (1) ARN (2) ARN (3) ARN (4) Lambda ADN (6) ADN (7) ADN (8) ADN (9)

8. molecular en geles de agarosa. Los
patrones internos de PM proporcionan un
instrumento para normalizar las distancias
de migración de los fragmentos dentro de
cada carril con el fin de facilitar las
comparaciones entre carriles de las
distintas luminografías (Hoisington et al.,
1994).
Fig. Nº 4. Marker Lambda DNA Hind III
A los efectos didácticos de la actividad, el
fragmento correspondiente a ADN (9),
permite visualizar desde el inicio del gel,
tres carriles bien demarcados en cada
banda. Comparando con la banda del
marker Lambda, las subunidades
presentan PM que oscilan entre 2,03 kb
(2027 bp) y 9,4 kb (9416 bp).
CONCLUSIONES
La información generada en el estudio
permitió identificar las etapas claves para
la extracción de ADN y ARN por
electroforesis en gel de agarosa.
El control del voltaje es fundamental para
el desarrollo de las bandas en el gel de
agarosa y la posterior visualización de los
fragmentos de ADN o ARN en las
luminografías.
Las bandas electroforéticas de ARN de la
cepa de Trichoderma harzianum
(LIG064) presenta tres fragmentos
definidos.
La comparación de las intensidades de las
bandas electroforéticas de ADN con el
master Lambda, permite definir
subunidades con PM entre 2,03 kb y 9,4
kb.
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