Este documento presenta los resultados de un laboratorio sobre espectrofotometría realizado por estudiantes de la Universidad de Antioquia. Los estudiantes determinaron la longitud de onda óptima para tres soluciones de color mediante espectros de absorción y evaluaron la precisión y exactitud del espectrofotómetro. Concluyeron que el instrumento cumple con los estándares de calidad requeridos y que la espectrofotometría es una herramienta útil en el campo de la microbiología.

1. LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA
Juan David Grisales Cardona
Juan David Jaramillo Orozco
Darío Ricardo Ortega Jaramillo
María Camila Zuleta Gonzales
John Querubín Franco Aguirre
INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA I
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA
MEDELLÍN
2013

2. OBJETIVOS
1. Reconocer el adecuado funcionamiento del espectrofotómetro.
2. Determinar experimentalmente la longitud de onda óptima de tres
soluciones coloreadas por medio de la realización de una curva espectral.
3. Analizar los datos obtenidos en las pruebas de precisión y exactitud.
4. Comprender el funcionamiento del espectrofotómetro en calidad del tiempo.
5. Relacionar el uso de la espectrofotometría con el campo de estudio de la
microbiología.
1- MARCO REFERENCIAL
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida dependen de forma lineal de la concentración. Además es usada para
identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de
un material o sustancia, esto último permite, seguir el curso de reacciones
químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos
nucleicos. [1]
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, como ya
sabemos es un equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por
medio de una longitud de onda especifica. La cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la concentración del soluto presente, es entonces así que
la concentración de un soluto colorido en solución puede ser determinada en el
laboratorio mediante la medición de su absorción de luz a una longitud de onda
específica.
Las muestras en estos equipos se utilizan en estado líquido y se colocan en el
compartimiento de las muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y
materiales.

3. En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación
electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es
una región de energía muy alta.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que
corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud
de onda en la que absorbe luz la solución coloreada.
La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
La transmitancia(T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad
de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y l a
absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos
indica la cantidad de luz absorbida por la misma,
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –
a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará-
; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo

4. 2- ESPECIFICACIONES TÉCNICAS DEL EQUIPO:
Interfaz estándar de interfaz serial: RS-232-C
Rango de medición: 0 a 2500 A
Exactitud fotométrica: < ± 0.005 A 0 a 0.500 A
< ±1 % 0.501 a 2500 A
Precisión fotométrica < ± 0.003 A 0 a 0.600 A
< ±0.5 % 0.601 a 2500 A
Deriva: 0.003 A en 30 en 30 min
Rango de longitud de onda: precisión alta en los 7 filtros 340, 405, 500, 5046,
578,620, 670 nm
Paso de banda: Rango UV (340 nm) = 10 nm
Rango visible (405-670 nm) < 6 nm
Compartimiento de cubeta: para la celda de flujo y cubetas desechables,
temperatura controlada.
Control de temperatura: usa regulador de temperatura 25 °C 30°C o 37 °C ;
estabilidad < ± 0.1 °C hasta 20 °C.
Temperatura ambiente, estabilidad < ± 0.2 °C hasta 15 °C – 32 °C

5. Cubetas: utilice solamente,
AMES Semi –microcuvettes 500 a 2100 microlitros
AMES microcuvettes
Aspirasiónprogrammable de volume(500 a 6000 microlitros)
3- TABLAS Y GRAFICOS
1. LECTURA ESPECTRO DE ABSORCION PARA SOLUCIONES
COLOREADAS:
LONGITUD DE
ONDA
SOLUCION
AMARILLO-
VERDE
SOLUCION
ROJA
SOLUCION
AZUL
340 0.296 0.254 0.114
405 1.426 0.138 0.194
500 0.072 0.518 0.232
546 -0.005 0.410 0.615
578 -0.001 0.188 0.838
620 0.001 0.006 0.265
670 -0.003 0.001 -0.002
Tabla 1

6. Gráfico 1
Gráfico 2
Grafico 3
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
340 405 500 546 578 620 670
Absorbancia
Longitud de onda
Espectro de la solución amarillo-verde
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
340 405 500 546 578 620 670
Absorbancia
Longitud de onda
Espectro de la solución azul
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
340 405 500 546 578 620 670
Absorbancia
Longitud de onda
Espectro de la solución roja

7. 2. CONTROL DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA
LONGITUD DE
ONDA
ABSORBANCIA
DS 6.99 x10-4
500nm
0.403
0.404
0.404
0.405
0.405
X: 0.404
0.405
0.405
0.404
0.404
0.405
Tabla 2
3. CONTROL DE ESTABILIDAD FOTOMETRICA
Tabla3
Gráfico 4
0.4024
0.4026
0.4028
0.403
0.4032
0.4034
0.4036
0.4038
0.404
0.4042
0 30 60 90 120150180210240270300330360390420450480510540570600
Absorbanciaenlongituddeonda
de500nm
tiempo en segundos
Estabilidad fotométrica
ABSORBANCIAS EN 500 nm
0,404 0,404 0,404
0,404 0,404 0,404
0,404 0,404 0,403
0,404 0,404 0,403
0,404 0,404 0,403
0,404 0,404 0,403
0,404 0,403 0,403
X 0.4037 DS 4.63 x10 -4

8. 4- CALCULOS:
A. EXACTITUD Y PRECISION
%Inexactitud = (Absorbancia hallada-Absorbancia Esperada) * 100
Absorbancia Esperada
= 0.404 – 0.408 * 100
0.408
= -0.98 %
Imprecisión CV = DS * 100
X
CV = 6.99 x10-4
*100 = 0.17 %
0.404
B. ESTABILIDAD
Deriva = (Absorbancia final- Absorbancia inicial) *100
Absorbancia inicial
= 0.403 -0.404 *100 = - 0.2 %
0.404
Ruido CV = DS * 100
X
CV = 4.63 x10-4
*100 = 0.115 %
0.4037

9. 5- METODOS
METODO PARA MYB
Bilirrubina: método colorimétrico para la determinación de bilirrubina directa y total
en suero y otros líquidos biológicos. [2]
La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfaníli-codiazotado
produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azo-bilirrubina) que se mide
fotocolorimétricamente a una longitud de onda de 530 nm.Si bien la bilirrubina
conjugada (directa) reacciona directamen-te con el diazorreactivo, la bilirrubina no
conjugada (indirecta)requiere la presencia de un desarrollador acuoso que
posibilitesu reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubinatotal
(conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debeagregarse benzoato de
cafeína al medio de reacción.
La bilirrubina es un producto de desecho derivado del grupo hemo de la
hemoglobina de los eritrocitos dañados osenescentes, que son destruidos en las
células retículoendoteliales. Una vez producida, la bilirrubina se transporta
alhígado en asociación con la albúmina. La bilirrubina en el hepatocito se conjuga
con el ácido glucorónico y se excretaen la bilis. Existen una serie de
enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a la producción,
captación,metabolismo y excreción de bilirrubina, resultando en una
hiperbilirrubinemia. [3]
METODO PARA MIA
Determinación de fosfatos en aguas por espectrofotometría:
Para la determinación del contenido de fosfatos solubles enuna muestra de agua
mediante espectrofotometría ultravioleta-visible. Se aplica el método de adición
estándar para eliminar interferencias con otros compuestos.
El método propuesto para determinar fosfatos se basa en la formación de
unheteropoliácido con el reactivo vanado-molíbdico (de color amarillo y soluble

10. en agua) cuyaabsorción de luz se mide a 420 nm. Para el ortofosfato, la
formación de este complejo tienelugar según la reacción:
(PO4)3− + (VO3)− + 11(MoO4)2− + 22 H+ ↔ P(VMo11O40)3− + 11 H2O (1)
En esta identificación interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato
yarseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la
longitud de ondautilizada (420 nm, absorción del P(VMo11O40)3−). Para eliminar
dicha interferencia sepreparará un blanco (sin fosfato) cuya absorbancia se
restará de la del resto de las muestras.Adicionalmente, es posible que la
absorbancia del complejo se vea afectada por efectos de matriz. La matriz puede
potenciar o atenuar la absorbancia de luz por el complejo,lo cual puede conducir a
resultados erróneos. Para minimizar este efecto, aplicaremos elmétodo de
adiciones estándar, que consiste en la adición de cantidades crecientes del
analitode interés (fosfato en nuestro caso) a una cantidad fija de muestra. Éste
procedimiento resultamás efectivo que un calibrado externo(recta de calibrado con
disoluciones patrón) cuando lamatriz interfiere en la detección. En esta práctica
estudiaremos la importancia de los efectosde matriz, determinando la
concentración de fosfato mediante ambos métodos y comparandolos resultados.
5- ANALISIS
En el experimento de lectura del espectro de absorción para soluciones
coloreadas, se obtuvieron datos que correspondieron debidamente a cada rango
de longitud de onda óptima de cada color indicado por la teoría. Estos fueron
(referencie tabla 1):
Para la solución amarrilla (esta solución se torna un poco amarillo verdoso) en la
longitud de onda que se determinó mayor absorbancia (1.426)fue en 405 nm, y en
el gráfico 1 se puede evidenciar más puntalmente; por ende la longitud de onda
optima para una solución amarilla es de 404 nm.
Para la solución de color azul se demostró que la longitud de onda optima es 578
nm, ya que se presentó una absorbancia mayor (0,838) con respecto a las demás.

11. (Gráfico 2).Aunque la longitud de onda óptima para el color azul es de 580, el
espectrofotómetro utilizado no la tiene, en su reemplazo nos permite utilizar la de
578 nm.
En la solución de color rojo en la longitud de onda que alcanza una mayor
absorbancia es en 500 nm, a esta longitud de registró 0.518 de absorbancia.
(Gráfico 3).
En la prueba de control precisión y exactitud fotométrica (referencie tabla 2), los
datos arrojados por el instrumento están dentro de los limites de aceptabilidad,
puesto que al hacer los cálculos se confirma una inexactitud de -0.98 % y el
%inexactitud aceptado es de +-3 %. El instrumento tiene exactitud. Al calcular la
impresión del instrumento obtenemos un coeficiente de variación menor de 1.5 %
el cual fue de 0.17%, podremos decir entonces que el instrumento presenta
precisión.
En el experimento de estabilidad fotométrica se observa una deriva del - 0.2 % y
un ruido del 0.115 %, por lo anterior se puede deducir que la medición presentó
más ruido que deriva pero en un porcentaje muy bajo encontrado dentro de los
criterios de aceptabilidad.
6- CONCLUSIONES
El conocer el adecuado uso del espectrofotómetro permitió obtener en el
laboratorio resultados con alta calidad analítica en las mediciones que son
emitidas por éste.
Se determinó la longitud de onda óptima a las tres soluciones coloreadas
teniendo como resultados las siguientes: solución amarilla 404 nm, para
solución de color azul 578, y para la solución de color rojo una longitud de
onda de 500 nm, concluyendo que los datos obtenidos experimentalmente,
se encuentran dentro de los datos teóricos.
Se identificó que el equipo presenta una adecuada precisión y exactitud
determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.

12. Se conocieron algunas aplicaciones (medición de fosfatos en agua-
determinación de bilirrubina en sueros) que tiene la espectrofotometría en
el campo de estudio de la microbiología tanto industrial-ambiental como en
el bioanálisis.
CIBERGRAFIA
[1] Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de
biomoléculas.http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
[2]http://es.scribd.com/doc/8510425/Tecnica-de-bilirrubina
[3]http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/QUIMICA%20CLINICA/11515%20115
11%2011510.pdf