ASOCIADO A PRACTICA LABORATORIO DE BIOQUIMICA UNAL

1. JEIMER KALEB USUGA
LONDOÑO
JUAN DAVID LOPEZ NOREÑA

2. ¿QUE ES LA FOTOCOLORIMETRIA?
 Método que sirve para hallar concentraciones de diferentes
muestras coloreadas.
 Consiste en medir la intensidad de luz absorbida(A) o
transmitida(T) por una solución coloreada de compuestos.
 El fundamento de la fotocolorimetria se debe a la capacidad de las
moléculas para absorber radiaciones.
 La absorción de luz en un compuesto coloreado puede variar debido:
la longitud de onda( ), concentración del compuesto, longitud de
celda que contiene la muestra.

3. ¿A QUE SE LLAMA LONGITUD DE ONDA( )?
 La describe cuán larga es la onda; y corresponde a la
distancia existente entre dos crestas o dos valles
consecutivos.
V=velocidad de propagación.
F=frecuencia de onda.

4. SUSTANCIAS COLOREADAS
 Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite
radiación en la región visible del espectro
electromagnético.
 Cuando una molécula absorbe radiación u.v. o visible, lo
que fundamentalmente ocurre es que se excitan los
electrones de valencia.

5. ¿QUE ES UNA ONDA?
 Se entiende por onda a aquella perturbación que transporta
energía, y que se propaga en el tiempo y espacio, la onda
tiene una vibración de forma ondulada que se inicia en un
punto y continúa hasta que choca con otro cuerpo.
 Existen 3 tipos de ondas según el medio en que se propagan:
las electromagnéticas, las mecánicas y la gravitacionales.

6. REGION VISIBLE DEL ESPECTRO
 Es la región del espectro electromagnético que el ojo humano es
capaz de percibir. A la radiación electromagnética en este rango
de longitudes de onda se le llama luz visible o simplemente luz.
 El rango de las en las cuales la luz es visible es entre 400nm -
700nm

7. EL FOTOCOLORIMETRO

8.  Es un instrumento usado en la química para determinar la concentración
de sustancias disueltas en líquidos o sólidos mientras sean transparentes
a la luz visible, ultravioleta o infrarroja, midiendo y comparando sus
colores.
 El aparato consta de un sistema lumínico para iluminar las muestras y se
mide con un sistema electrónico la cantidad de luz que pasa.
 Los colorímetros se basan en el principio de que la absorbancia de una
sustancia es proporcional a su concentración, y es por eso que las
sustancias más concentradas muestran una lectura más elevada de
absorbancia.

9. ESPECTRO DE ABSORCION
 Es el nombre de una grafica, la cual muestra la intensidad
de la energía absorbida por una molécula, a partir de
diferentes longitudes de onda.

10.  A partir de la grafica(espectro de absorción), se puede
deducir la longitud de onda en la cual el compuesto
absorbe la mayor o menor intensidad de energía.
 Al saber estas características, facilita según sea el caso, la
detección de una sustancia, ya sea para determinar su
concentración o diferenciarla de otros compuestos.

11. LA ABSORCION DE ENERGIA
 La absorción es el fenómeno por el cual la energía de un
fotón es tomada por otra partícula, como por ejemplo un
átomo cuyos electrones de valencia efectúan una
transición entre dos niveles de energía electrónica.
 La cantidad de energía para lograr que los electrones de
valencia sean excitados se dan por la formula:
hc
E h
ΔE = cantidad de energía (ergios).
v = frecuencia de la radiación (Hertz).
h = constante de Planck.
c = velocidad de la radiación en el vacío.
λ = longitud de onda de la radiación (cm.).

12. TRANSICIONES ELECTRONICAS Y
LONGITUDES DE ONDA
 Cuando una molécula absorbe energía, sus electrones de valencia
al absorber un fotón de energía el electrón puede ocupar un
orbital superior, los cuales se denominan “orbital antienlace.”
- <165nm:compuestos saturados. - >165 nm: compuestos insaturados.
- >185nm y >270nm: compuestos con pares de electrones libres.

13. EJEMPLO DE TRANSICIONES ELECTRONICAS
EN ALGUNOS GRUPOS FUNCIONALES

14. TRANSMITANCIA
 La transmitancia es una magnitud que expresa la
cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad
de tiempo.
 La transmitancia óptica que se define como la fracción
de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que
pasa a través de una muestra.

15. ABSORBANCIA
 Medida de la cantidad de luz absorbida por la muestra.
 La absorbancia A de una muestra se define como:

16. LEY DE BEER
 La Ley de Beer es una ecuación que relaciona
la absorción de luz con las propiedades del material
atravesado.
Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un
medio absorbente se cumple que la absorbencia de este es
directamente proporcional a la concentración de la muestra.
A=ϵxcxl

17.  A = Absorción (Intensidad de energía absorbida)
C = Concentración de la muestra en mol/l
l = Longitud de la celda
ϵ = Coeficiente de extinción molar o absortividad molar.
 La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión
de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia,
así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la
luz atraviesa. Si conocemos y α, la concentración de la sustancia
puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

18. CONCENTRACION
 La concentración de una disolución es la proporción o relación que
hay entre la cantidad de soluto y la cantidad de disolvente, donde el
soluto es la sustancia que se disuelve, el disolvente la sustancia que
disuelve al soluto, y la disolución es el resultado de
la mezcla homogénea de las dos anteriores. A menor proporción de
soluto disuelto en el disolvente, menos concentrada está la
disolución, y a mayor proporción más concentrada está.

19. USO DE LA LEY DE BEER
El uso o aplicación mas importante de la ley de Beer es
la determinacion de concentraciones desconocidas de
soluciones de sustancias que absorben en la región u.v-
visible. Podemos calcular la concentración de una
muestra problema, si las condiciones son iguales,
definimos las siguientes formulas:

20. CURVA DE CALIBRACION
 Para determinar concentraciones desconocidas mas precisas por
medio de la ley de beer, usualmente se prepara una curva de
calibración a partir de una series de soluciones patrón, cuyas
concentraciones sean próximas a la reales.

21. PRACTICA NO. 1
CURVA DE CALIBRACION POR
FOTOCOLORIMETRIA

22. REACTIVOS Y PRODUCTOS
 Fotocolorímetro.
 Reactivo de Biuret.
 Solución de albúmina, (solución patrón, estándar de BSA (albúmina de
suero)).
 Solución salina al 0.9%
 Muestras problema: caseína, suero sanguíneo, gelatina (sin sabor).

23. DETERMINACION DEL ESPECTRO DE
ABSORCION DE LA ALBUMINA
 En un tubo de ensayo agregue 4 ml. de las solución de albúmina y 1
ml. del reactivo de biuret. Agite y espere 30 minutos para que se
desarrolle el color.
 Tome dos celdas del fotocolorímetro y agregue, en una, agua
destilada que se empleará como blanco, y en otra, solución
coloreada de la albúmina. Llénela solo hasta las 3/4 partes de su
volumen.
 Lleve al instrumento ( fotocolorímetro ) la celda que contiene el agua
destilada, y ajuste la lectura de absorbancia en cero.
Lleve luego la celda con la solución coloreada y anote la absorbancia
que indica el instrumento.

24. ESPECTRO DE ABSORCION(GRAFICA
HIPOTETICA)
(nm) ABS
400 0.172
420 0.136
440 0.196
460 0.303
480 0.520
500 0.590
520 0.600
540 0.570
560 0.488
580 0.415
600 0.392
620 0.360
640 0.324

25. PREPARACION DE LA CURVA DE
CALIBRACION DE LA ALBUMINA
 Rotular diez tubos con las características especificadas.
 Agregar a cada tubo 4 ml del reactivo de biuret.
 Seleccionar en el fotocolorímetro la de mayor
absorbancia y ajustar el “cero” de absorbancia con el
“blanco”.
 Calcular la concentración de la proteína en los
tubos que tienen la solución patrón(c1v1=c2v2).

26. CURVA DE CALIBRACION DE LA
ALBUMINA(HIPOTETICA)

27. VIDEO