3. O que é Engenharia Genética?
É um conjunto de tecnologias que permitem
a manipulação (modificação) de material
genético in vitro
Também conhecida como Tecnologia do
DNA Recombinante
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de
genes, recombinação de genes, ou DNA de
diferentes espécies, e transferência de
genes de uma espécie para outra,
contornando o processo reprodutivo
4. Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que
codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-
lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA isolar um fragmento
específico de DNA do cromossomo, introduzi-
lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer
milhões de cópias idênticas
8. Isolamento do DNA- PCR
Após vários ciclos...
Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!
9. Isolamento de DNA e Biblioteca
de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente,
todo o material genético de um organismo clonado
em um vetor
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.
B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
10.
11. Isolamento de DNA- Biblioteca
genômica
Extração do DNA Genômico;
Clivagem com enzimas de restrição;
Ligação dos Fragmentos nos vetores;
Transformação Celular;
Replicação do vetor.
12. Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo
celular específico;
- “primer” de oligo dT e
transcriptase reversa;
- DNA Polimerase I e
dNTPs;
- Clonagem em um vetor
de escolha
13. Clonagem Molecular- Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo;
2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!
3) Célula hospedeira;
4) Método para introduzir moléculas de DNA para
dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
5) Método para selecionar moléculas de DNA
quimérico ou recombinantes;
6) Métodos para o screening da característica
procurada .
21. Enzimas de Restrição
São endonucleases que clivam o DNA
em seqüências específicas chamadas
sítio de restrição.
Quebram a ligação fosfodiéster
Os sítios de restrição são, geralmente,
seqüências palindrômicas (mesma
seqüência nos dois sentidos)
22. Enzymes for DNA manipulation –
restriction enzymes
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
23. Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type I
cleavage occurs 400-7000 bp
from recognition site
Type II
cleavage occurs adjacent or
within recognition site
Type III
cleavage occurs 25-27 bp
from recognition site
• Endonucleases sítio-específicas
isoladas de procariotos
• Protegem a bactéria do ataque de
vírus (fagos)
• Protegem seu próprio DNA
metilando-o no sítio de restrição
• Enzimas do tipo II são as mais
utilizadas em Biologia Molecular
EcoRI metilase
24. DNA Ligase
Promover a união de moléculas de DNA
pela formação de uma ligação
fosfodiéster entre uma extremidade 3’-
OH e outra 5’-PO4.
25.
26. DNA Polimerases
Polimerizam a molécula de DNA a
partir de uma extremidade 3´-OH e
usando uma das fitas do DNA como
molde.
Exe: Taq polimerase
29. Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o
DNA clonado.
Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula contendo o
vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);
•Sítios de clonagem únicos.
30. Tipos de vetores
Plasmídios
Bacteriófagos (fagos)
Cosmídios
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
Vetores especiais para plantas, células de
insetos e mamíferos
31. Plasmídios
Moléculas de DNA fita dupla circulares e de
replicação autônoma (ORI);
Têm marcas de seleção para resistência a
antibióticos ou complementação auxotrófica.
37. O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado.
O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima
está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA
recombinante no plasmidio.
40. Vetores baseados no fago
Foram retirados 20 Kb do genoma do fago
necessários para integração/excisão para
serem substituídos por DNA exógeno e
formar um genoma de 50 Kb que é
empacotado in vitro.
Genomas maiores ou menores não são
empacotados.
Ciclo lítico compulsório
47. Células hospedeiras
Características:
Permitir a duplicação do vetor;
Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou
auxotrofia);
Não pode representar perigo ao meio ambiente;
Não deve modificar o DNA exógeno;
Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras,
células vegetais, cultura de células de insetos e
mamíferos).
48. Métodos de introdução do DNA na
célula hospedeira
Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);
Transdução (fagos empacotados in vitro);
Transfecção (células de mamíferos);
Eletroporação (leveduras e bactérias);
Biolística ou “bombardeamento” (plantas);
Microinjeção (ovos e oócitos).
49. O canhão gênico é uma
nova forma de
transformação celular.
Esta arma usa uma
particula de
bombardeamento -
Biolística
Inserindo genes nas células
56. Análise da estrutura/função de genes
Produção de proteínas de interesse
industrial e terapêutico
Engenharia proteica
Criação de organismos transgênicos
Terapia gênica
Diagnóstico molecular (doenças
parasitárias e genéticas)
Teste de paternidade / medicina
forense
Arqueologia molecular / evolução
