2. INMUNOHISTOQUIMICA
Inmunohistoquímica consiste en una serie de
métodos para localizar antígenos específicos en
tejidos o células basados en una reacción
antígeno-anticuerpo. Estos métodos tienen sus
bases en tres disciplinas fundamentales: la
histología, la inmunología y la química.
Los
métodos
inmunohistoquímicos
se
desarrollaron a partir de 1941, año en el que
Albert Hewett Coons, describe un método de
inmunofluorescencia para detectar antígenos
celulares en secciones de tejido.
25 años después Nakane, Pierce y Avrameus,
revolucionaron la técnica hasta hacerla
práctica, útil, de fácil realización y aplicabilidad
clínica
general,
llegando
a
la
inmunohistoquímica como es hoy.
Albert Hewett Coons
3. La Inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico que se basa
en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado
mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un
sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un
complejo con el antígeno.
4. INMUNOHISTOQUIMICA
UTILIDAD
Diagnóstico y clasificación de tumores malignos indiferenciados.
Marcadores
predictivos y pronósticos de tumores (receptores
estrogenicos y Her2 para C.A. de Mama).
Identificación de agentes infecciosos en tejidos (Virus, bacterias,
hongos, parásitos).
Clasificación de leucemias y linfomas.
Determinación del origen de tumores metastáticos.
6. PREPARACION DE LA MUESTRA
FIJACIÓN
Permite preservar el tejido del deterioro provocado por la putrefacción y
autolisis derivada de la muerte celular. El fijador más empleado es el
formaldehído en microscopía de luz, mientras que en microscopía
electrónica se utiliza más el glutaraldehído.
7. FIJADORES
FIJADORES POR METODOS
FISICOS
FIJADORES POR METODOS
QUIMICOS
Se emplea enfriamiento por congelación
del tejido. Se utiliza para estudios
morfológicos
o
funcionales
que
requieran
conservar
intacta
la
estructura antigénica del tejido.
Ej.: liofilización
Los
fijadores
desnaturalizan
e
insolubilizan la proteínas tisulares,
bloqueando la autolisis por inactivación
enzimática .
Ejemplo: alcohol etílico, acetona, acido
acético
8. FORMALDEHÍDO O FORMOL
Barato
Conserva estructura tisular.
Buen desinfectante y no endurece los tejidos.
A temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de
las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas.
Compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan
rutinariamente en Anatomía patológica
9. INCLUSION
Consiste en sustituir el agua tisular por un medio liquido
capaz de solidificar a fin de proporcionar a la muestra la
consistencia y homogeneidad adecuadas para obtener
secciones muy delgadas mediante un instrumento llamado
micrótomo.
Deshidratación
Tiene como finalidad la eliminación completa del agua de la
muestra tisular para que se pueda embeber en medios de
inclusión.
10. Deshidratación
Parámetros
1. Se emplean una serie de alcoholes de concentración
ascendente (50,70,80,95 y 100%)
2. El volumen del baño debe ser 10 veces superior al
volumen de la muestra que se va a deshidratar.
3. La deshidratación debe ser completa
4. La exposición prolongada al agente deshidratante
provoca un endurecimiento de los tejidos.
5. Se recomienda el empleo de sulfato de cobre anhídrido,
oxido de calcio, resinas humectantes.
11. El principal agente deshidratante es el alcohol etílico.
Otros: alcohol metílico, acetona, alcohol butírico, dióxido de etilo.
12. Aclaramiento o Desalcoholización
Sustitución del agente deshidratante por una sustancia que pueda
disolverse con el medio de inclusión que va a utilizarse.
Principal agente :
Xileno
Rápido
Endurece poco los tejidos
Se elimina fácilmente del medio de inclusión
Desventajas:
Toxico
Solo aclara desde alcohol absoluto
Por mucho tiempo, endurece el tejido
13. Infiltración o impregnación
Una vez que la muestra ha sido totalmente embebida por el xilol
(aclaramiento) se transfiere a un baño de parafina derretida dentro de
una estufa. La estufa es mantenida a 58 grados centígrados (el punto de
fusión de la parafina es 56-57 grados) y la muestra es transferida a través
de tres baños sucesivos de parafina. De esta forma la parafina caliente
desplaza al xilol y difunde dentro de la muestra o tejido. A este paso se lo
denomina Inclusión en parafina.
14. Encastramiento del tejido y confección de los bloques
Consiste en la obtención de un
bloque de tejido, mas el medio
de inclusión, mediante el
enfriamiento lento a 10-15°C
Las Estaciones de Inclusión
forman los bloques; formados
por:
Dispensador
de
parafina
liquida
Placa
caliente
para
la
orientación de las piezas.
Placa fría para la solidificación
del bloque.
15. Corte
Las secciones producidas a partir de un tejido en parafina, suelen
tener un espesor entre 4 y 6 micras. Hay secciones mas gruesas de
entre 10 y 20 micras y se emplean para el estudio del sistema
nervioso central.
Los cortes se realizan con el micrótomo.
21. METODO DE AVIDINA- BIOTINA
Incubación de los cortes en antisuero primario especifico.
2. Incubación en anticuerpo secundario biotinizado
3. Incubación en solución ABC (complejo avidina-biotinaperoxidasa).
4. Incubación en Diaminobencidina y peróxido de
hidrogeno.
1.
22.
23.
24.
25. ASPECTOS PRACTICOS EN EL DESARROLLO DE LA
INMUNOHISTOQUIMICA
El tiempo de fijación debe ser el necesario para preservar la
muestra, el exceso de fijación reduce la inmunorreactividad
del tejido.
La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis.
La inclusión en parafina caliente produce perdida de la
antigenicidad.
La albumina de huevo, gelatina, poli-L-lisina, cromogel son
adhesivos de las secciones de la muestra al portaobjeto. Un
exceso de éste causa el aumento de tinción inespecífica de
fondo.
26. BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
ENDOGENA
Se inhibe su actividad por la incubación de secciones
con metanol absoluto que contenga peróxido de
hidrogeno al 3%, de 10-30 minutos a temperatura
ambiente.
BLOQUEO DE LA TINCION DE FONDO
Tinción de fondo especifica
Tinción de fondo inespecífica
27. Tinción de fondo especifica
Presencia de Ag en lugares distintos a aquel en que se
quiere detectar.
El antisuero contenga Ac contra Ag distintos al que se
quiere determinar .
Tinción de fondo inespecífica
Se forma unión no inmunológica del antisuero a ciertos
componentes del tejido, ejemplo: colágeno.
Se evita usando antisuero primario en diluciones muy altas .
28. PENETRACIÓN DE REACTIVOS
Para la escasa penetración se emplea el uso de
detergentes como el Tritón X- 100 y la saponina que
permeabilizan las membranas.
CONTROLES
Control negativo: se omite el antisuero primario y se
reemplaza por suero no inmune o Buffer.
Control Positivo: se utiliza una sección de tejido donde
se encuentre el antígeno a determinar.
29. CROMOGENO
Actúan como oxidantes y afectan el grado de tinción:
Luz intensa
Incremento o disminución de la porción entre el
cromógeno y sustrato.
Recomendaciones:
El revelado no debe realizarse en condiciones de
iluminación intensa
El peróxido de hidrogeno no debe exceder una
concentración del 3%.
El DAB no debe exceder una concentración del 0.5%.
30. CICLOOXIGEASA-2
La ciclooxigenasa (COX) es una
enzima que cataliza la síntesis de
prostaglandinas.
Se han demostrado incrementos en
la expresión de la COX2 en
enfermedades inflamatorias y en
distintas
neoplasias
como
carcinomas de colon, estomago,
esófago, mama , pulmón, hígado,
ovario y páncreas.
Se ha relacionado al COX-2 en la
carcinogénesis
por
la
estimulación de la angiogénesis y
esto es un proceso crucial para el
crecimiento y expansión tumoral.
31. K i 67
Ki-67 es una proteína nuclear
expresada en las células durante
las fases activas del ciclo celular
(G1,S,G2,M). Es empleada para
medir el crecimiento de tejidos en
las
neoplasias
malignas.
Establece una relación directa
entre la presencia o no de lesión
intraepitelial y la extensión de
células positivas .
Marcador poco específico porque
su expresión aumenta en cuadros
reactivos
epiteliales
(inflamación).
32. OSTEOPONTINA
La osteopontina (OPN) es una glicoproteína sintetizada por una gran
variedad de células, incluyendo:
linfocitos T, macrófagos, células epiteliales, células endoteliales, células
del músculo liso, fibroblastos, osteoclastos, osteoblastos y células
Tumorales.
La OPN media interacciones célula-célula y célula-matriz.
Es una proteína anti-apoptotica y se sobreexpresa en una variedad de
cánceres, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer
colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de ovario, carcinoma papilar de
tiroides, melanoma.
33. REPORTE
Cuantificación del resultado inmunohistoquímico (J
Histoch 2005; 28:89)
Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las células
“diana” con menor intensidad que el control.
Positividad débil (+/-): más del 50% de las células “diana” con
menor intensidad que el control.
Positivo (+): más del 50% de las células “diana” con igual o
mayor intensidad que el control.
El límite de intensidades entre negativo y positividad débil o
positivo se hace por comparación con un control interno
existente
34. REPORTE
Determinación de c-erbB-2/neu en cáncer de mama: análisis
comparativo
de
la
determinación
mediante
análisis
inmunoenzimático (ELISA) e inmunohistoquímico.
Dra Maria L Lamelas Suarez-Pola , Dr Julio Vázquez , Dr. Luis O
González , A Rodil , Dra Paula Vérez , Dr Francisco Vizoso y Dr
Pablo Raigoso
0: no tinción
+: tinción incompleta o débil de membrana
++: tinción completa de membrana en al menos el 10% de las
células
+++: fuerte tinción completa de membrana en la mayoría de las
células .
35. Tinción inmunohistoquímica
(+)cerbB2/neu en un carcinoma de mama
(400x)
Tinción inmunohistoquímica
(++)cerbB2/neu en un carcinoma de
mama (400x)
Tinción inmunohistoquímica (+++) de
c-erbB2/neu en un carcinoma ductal
infiltrante de mama (400x)
36. Ki 67
Tesis doctoral caracterización inmunofenotípica del cáncer de cuello
uterino asociado a la infección por virus papiloma humano (hpv),
Morelva Toro de Méndez. universitat de valencia, 2006.
El porcentaje de células neoplásicas o normales con reactividad fue
estimado considerando un mínimo de 100 células por disco tisular. La
distribución de las células inmunoreactivas se efectuó mediante una
escala semicuantitativa como se describe a continuación:
37. KI 67
Negativo: < del 5% de células reactivas.
+: de 5% a <25% de células reactivas.
++: de 25% a 50% de células reactivas.
+++: > del 50% de células reactivas.
La evaluación de la inmunoreactividad de Ki-67 consideramos esta
reacción como baja cuando observamos menos del 5% de las células
teñidas.
38. CICLOOXIGENASA 2
Tesis doctoral:
estudio de la expresión imuohistoquímica de
ciclooxigeasa-2 en pacientes con cáncer avanzado de laringe sometidos
a quimioterapia de inducción, con la intención de conservar la función
fonatoria. Óscar E. Cazorla Ramos. Málaga, 2008.
se utilizo un anticuerpo monoclonal de ratón, COX2, diluido a 1:900.
39. CICLOOXIGENASA 2
Para la cuantificación de COX-2 utilizaron s el método descrito por Davies y cols.
La expresión de COX-2 fue evaluada, de manera semicuantitativa, valorando la
intensidad de tinción citoplasmica clasificada en:
- 0: Ausencia de tinción
- 1: débil tinción
- 2: moderada tinción
- 3: fuerte tinción
Posteriormente se realizo una estimación del porcentaje de células positivas para
cada intensidad en 10 campos de gran aumento. Se multiplico el porcentaje de
células que presentaba cada intensidad de tinción, y el resultado se sumo
obteniendo un valor que oscilaba de 0 a 300. Finalmente, se considero:
- Negativo: 0 a 100
- Positivo: 101 a 300
40. OSTEOPONTINA
Osteopontin
is
overexpressed
in
colorectal
carcinoma and is correlated with P53 by
immunohistochemistry. 2012
JING LI1, GUANG-ZHI YANG, ZI-MAN ZHU, ZHI-YONG
ZHOU and LIN LI1
The expression of OPN and P53 was determined in each case
when positive cells were >10%, since the positive pattern
was often diffuse and similar in staining intensity.
OPN only displayed weak staining in a few cells and the ratios
were much <10%, therefore all the cases were determined
as negative
