Factores que influyen en la actividad enzimática

PRACTICA N° 03
INFORME DE LABORATORIO:
“FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA”
DOCENTE : Lic. Héctor H. Toledo Acosta.
INTEGRANTES : Martínez Gil, Fiorella
Dámazo Gálvez, Lizbeth
Ogura Esteban, Josselyn
Medina Quiroz, Mishell
Taype Arone, Fortunato
Bullón Guzmán, Danny
Gonzales Chávez, Frank
E.A.P. : INGENIERÍA AMBIENTAL
GRUPO : II.
FECHA : 29 de Abril del 2014.
HUACHO - PERÚ
2014

UNJFSC INGENIERÍA AMBIENTAL BIOQUÍMICA
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
1. RESUMEN
En este informe daremos a conocer los resultados de la tercera sesión de
laboratorio de Bioquímica, que trata sobre los factores en la actividad de las
enzimas.
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica que aceleran las
reacciones que tendrían lugar de manera espontánea sin perderse ni modificarse
en su acción, permitiendo las reacciones bioquímicas celulares indispensables para
los seres vivos.
La actividad enzimática se encuentra determinada por las condiciones tales como
la cantidad de enzima, sustrato, la temperatura, el pH, el tiempo de reacción,
presencia de cofactores, presencia de moduladores, presencia de inhibidores.
En el laboratorio se realizaron 6 experiencias y se dividieron en 5 pruebas, las
cuales fueron desarrolladas de forma cualitativa, teniendo en cuenta la
concentración del sustrato que es uno de los factores que se aplican sobre la
enzima para determinar su actividad. En este caso como sustrato se cuenta con
peróxido de hidrogeno que a distintos cambios físicos - químicos nos ayudara a
identificar la enzima catalasa que se encuentra en la organela llamada peroxisoma.
En dicha organela abunda la enzima.
Es importante que conozcamos la estructura y propiedades químicas de los
compuestos que se van a utilizar, por lo que es recomendable acudir a notas de
clase o a un libro de texto de bioquímica general para un mejor entendimiento y
aprovechamiento de la práctica y para presentar y discutir los resultados
obtenidos en el cuaderno de prácticas.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
 Demostrar in vitrio la actividad enzimática de los peroxisomas en
diferentes células.
2.2. Objetivos Específicos
 Identificar de forma cualitativa las propiedades de las enzimas.
 Poner en evidencia enzimas mediante su actividad frente a un sustrato de
H2O2.
 Observar si la temperatura y el pH influyen en la actividad enzimática.
 Realizar un cuadro comparativo de los resultados de las experiencias.

3. MARCO TEÓRICO
ENZIMAS
3.1. DEFINICIÓN:
La Enzima Como Unidad Fundamental De
Vida. Cada célula y cada tejido tienen su
actividad propia, lo que comporta continuos
cambios en su estado bioquímico, en la
base de la cual están las enzimas, que
tienen el poder de catalizar, facilitar, y
agilizar determinados procesos sintéticos y
analíticos. Los propios genes son
reguladores de la producción de las
enzimas; por tanto, genes y enzimas pueden
considerados como las unidades
fundamentales de la vida.
3.2. IMPORTANCIA
Sin enzimas, no sería posible la
vida que conocemos. Igual que la
biocatálisis que regula la velocidad
a la cual tienen lugar los procesos
fisiológicos, las enzimas llevan a
cabo funciones definitivas
relacionadas con salud y la
enfermedad. En tanto que, en la
salud todos los procesos
fisiológicos ocurren de una manera
ordenada y se conserva
la homeostasis durante los estados
patológicos, esta última puede ser
perturbada de manera profunda.
3.3. ESTRUCTURAS
Las proteínas globulares que
presentan las enzimas son muy
complejas y grandes, estas se pliegan
en sí mismas formando un surco en la
que encaja la molécula o las moléculas
reactivas denominadas sustrato y
donde tiene lugar las reacciones
biológicas. Esta región de la enzima es
conocida como sitio activo el cual está
formado por aminoácidos.
El sitio activo no solo tiene una
configuración tridimensional
complementaria al sustrato, sino
también tiene una distribución
complementaria de cargas y de zonas
hidrofilitas o hidrofóbicas sobre la
superficie de unión. De tal modo que
el sitio activo no solo reconoce al
sustrato sino que lo orienta en una
dirección en particular.

3.4. CLASIFICACIÓN
3.4.1. DE ACUERDO A SU COMPLEJIDAD
Se clasifican como:
En las proteínas conjugadas podemos distinguir dos partes:
a. APOENZIMA: Es la parte polipeptídica de la enzima.
b. COFACTOR: Es la parte no proteica de la enzima. La combinación
de la apoenzima y el cofactor forman la holoenzima. Los
cofactores pueden ser:
 Iones metálicos: Favorecen la actividad catalítica general de la
enzima, si no están presentes, la enzima no actúa. Estos iones
metálicos se denominan activadores. Ejemplos: Fe2+
, Mg2+
, Cu2+
,
K+
, Na+
y Zn2+
.
3.4.2. SEGÚN SU ACTIVIDAD
TIPO DE ENZIMAS ACTIVIDAD
HIDROLASAS Catalizan reacciones de hidrólisis.
ISOMERASAS
Catalizan las reacciones en las cuales un
isómero se transforma en otro, es decir,
reacciones de isomerización.
LIGASAS Catalizan la unión de moléculas.
LIASAS
Catalizan las reacciones de adición de enlaces
o eliminación, para producir dobles enlaces.
OXIDORREDUCTASAS Catalizan reacciones de óxido-reducción.
TANSFERASAS
Catalizan la transferencia de un grupo de una
sustancia a otra.
3.5. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
3.5.1. REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:
La actividad metabólica de las células está regulada por la
síntesis de productos necesarios para su óptimo
funcionamiento; esta regulación depende de la actividad
enzimática. Los principales factores que limitan la acción
enzimática son las concentraciones de moléculas de enzimas
y sustratos, al igual que la disponibilidad de cofactores.
3.5.2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
a. Efecto del pH
b. La temperatura
c. Interacciones alostéricas
d. Inhibición competitiva
e. Inhibición no competitiva
f. Inhibición irreversible

4. MATERIALES
4.1. INSTRUMENTOS Y REACTIVOS DE LABORATORIO
4.1.1. Instrumentos:
 1 Cocina eléctrica.
 1 Gradilla
 1 Mortero de
porcelana.
 1 Cuchillo.
 1 Pizeta.
 2 Vasos de precipitado
de 100 y 400 ml.
 3 Pipetas de 10ml.
 5 Tubos de ensayo.

4.1.2. Reactivos:
 24 gta. de HNO3 (en
solución conc. al 80%).
 6 ml. de ETANOL
(ALCOHOL).
 60 gta. de NaOH (en
 30 ml. de H2O2 (en
4.2. INSUMOS Y MATERIALES ADQUIRIDOS POR LOS ESTUDIANTES
4.2.1. Insumos:
 250 gr. de hígado.
 5 ramas de apio.
 3 papas.
 1 cojín de agua
destilada.
4.2.2. Materiales:
 1 lápiz marcador.
 1 cinta masketein.
 Toallas de papel.
 Cámara fotográfica.

5. PROCEDIMIENTO
5.1.Cortar, lavar y cocer las muestras: La papa, el apio y el hígado.
5.2. PRUEBA CON EL APIO CRUDO
1° PASO
Cortar y lavar las muestras:
La papa, el apio y el hígado.
2° Paso
Cocer la mitad de las
muestras.
3° PASO
Esperar que hierva por
un perdiodo de 10 min.
4° PASO
Esperar que hierva por
un periodo de 10 min.
PASO 1:
Machacar el apio crudo.
PASO 2:
Picar en pequeños
dados el apio.
PASO 3:
Introducir el apio en
cada uno de los 5
tubos de ensayo.
PASO 4:
Enumerar los 5 tubos de ensayo.

5.2.1. Tubo 1
5.2.2. Tubo 2
PASO 1:
Agregar 10 gr de apio machacado a un
tubo de ensayo.
PASO 2:
Adicionar 5 ml. de H2O2 y
homogenizar.
PASO 3:
Cubrir con el dedo pulgar la parte
superior del tubo de ensayo y agitar
durante 5 min.
PASO 4:
Llevar el tubo al lavadero y
retirar el dedo pulgar.
PASO 5:
Observar y tomar nota.
PASO 1:
Agregar 10 gr de apio en trozos
en un tubo de ensayo.
PASO 2:
homogenizar.
PASO 3:
durante 5 min.
PASO 4:
PASO 5:
Observar y tomar
nota.

5.2.3. Tubo 3
5.2.4. Tubo 4
PASO 1:
Agregar 10 gr de apio machacado
a un tubo de ensayo.
PASO 2:
Añadir 4 gotas de HNO3 y
agitar.
PASO 3:
Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 4:
superior del tubo de ensayo y
agitar durante 5 min.
PASO 5:
PASO 1:
Agregar 10 gr de apio machacado
PASO 2:
Añadir 1 ml.de alcohol y
agitar.
PASO 3:
homogenizar.
PASO 4:
PASO 5:

5.2.5. Tubo 5
5.3.PRUEBA CON LA PAPA CRUDA
PASO 1:
Agregar 10 gr de apio machacado a un
tubo de ensayo.
PASO 2:
Añadir 4 gotas de H2SO4 y
agitar.
PASO 3:
Añadir 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 4:
PASO 5:
PASO 1:
Machacar la papa cruda.
PASO 2:
Picar en pequeños dados la
papa.
PASO 3:
Introducir la papa en cada uno
de los 5 tubos de ensayo.
PASO 4:
Enumerar los 5 tubos de ensayo.

5.3.1. Tubo 1
5.3.2. Tubo 2
PASO 1:
Agregar 10 gr de papa machacada a un
tubo de ensayo.
PASO 2:
homogenizar.
PASO 3:
durante 5 min.
PASO 4:
PASO 5:
PASO 1:
Agregar 10 gr de papa en trozos
en un tubo de ensayo.
PASO 2:
homogenizar.
PASO 3:
durante 5 min.
PASO 4:
PASO 5:
Observar y tomar
nota.

5.3.3. Tubo 3
5.3.4. Tubo 4
PASO 1:
Agregar 10 gr de papa machacada
PASO 2:
Añadir 4 gotas de HNO3 y
agitar.
PASO 3:
Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 4:
PASO 5:
PASO 1:
Agregar 10 gr papa machacada a
un tubo de ensayo.
PASO 2:
Añadir 1 ml.de alcohol y
agitar.
PASO 3:
homogenizar.
PASO 4:
PASO 5:

5.3.5. Tubo 5
6. RESULTADOS
PRIMERA PRUEBA
TUBO PAPA COCIDA H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacada. 5 ml. No reacciono.
2 En trozos. 5 ml. No reacciono
3 Machacada con 4 gts. de HNO3. 5 ml. No reacciono
4 Machacada con 1 ml de ETANOL. 5 ml. No reacciono
5 Machacada con 10 gts. de NaOH. 5 ml. No reacciono
SEGUNDA PRUEBA
TUBO APIO COCIDO H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacado. 5 ml. No reacciono.
2 En trozos. 5 ml. No reacciono
3 Machacada con 4 gts. de HNO3. 5 ml. No reacciono
4 Machacada con 1 ml de ETANOL. 5 ml. No reacciono
5 Machacada con 10 gts. de NaOH. 5 ml. No reacciono
PASO 1:
Agregar 10 gr de papa machacada a un
tubo de ensayo.
PASO 2:
Añadir 4 gotas de H2SO4 y
agitar.
PASO 3:
Añadir 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 4:
PASO 5:

TERCERA PRUEBA
TUBO HÍGADO COCIDO H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacado. 5 ml.
Menor liberación
de gas.
2 En trozos. 5 ml.
Menor liberación
de gas.
3 Machacada con 4 gts. de HNO3. 5 ml. No reacciono.
4 Machacada con 1 ml de ETANOL. 5 ml.
Menor liberación
de gas.
5 Machacada con 10 gts. de NaOH. 5 ml. No reacciono.
CUARTA PRUEBA
TUBO PAPA CRUDA H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacada.
5 ml. Mayor liberación
de gas.
2 En trozos.
5 ml. Media liberación
de gas.
3 Machacada con 4 gts. de HNO3. 5 ml. Ínfima liberación.
4 Machacada con 1 ml de ETANOL.
5 ml. Menor liberación
de gas.
5 Machacada con 10 gts. de NaOH. 5 ml. Ínfima liberación.
QUINTA PRUEBA
TUBO APIO CRUDO H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacado. 5 ml.
Mayor liberación
de gas.
2 En trozos. 5 ml.
Menor liberación
de gas.
Menor liberación
de gas.
SEXTA PRUEBA
TUBO HÍGADO CRUDO H2O2 OBSERVACIONES
1 Machacado. 5 ml.
Mayor liberación
de gas.
2 En trozos. 5 ml.
Media liberación
de gas.
Menor liberación
de gas

7. CUESTIONARIO
a. ¿Qué son las peroxisomas?
Los orgánulos pequeños que
participan en la producción y
degradación del peróxido de
hidrogeno (H2O2), son de formas
esférica limitados por una
membrana que contiene enzimas
oxidativas en particular la
CATALASA y otras peroxidasas.
¿Cuál es la estructura de las peroxisomas?
El peroxisoma es una organela celular que
consta de una membrana, constituida por
una doble capa lipídica (de grasas) que
contiene diversas proteínas. En su interior
se halla una matriz peroxisomal, que
contiene proteínas de función enzimática
(capaces de transformar unos compuestos
en otros). Estas enzimas catalizan muchas
reacciones de síntesis y degradación de
compuestos de gran importancia
metabólica.
¿Cuál es la función?
Los peroxisomas tienen
múltiples funciones. Destacan
las relacionadas con el
metabolismo lipídico.
Entre ellas se hallan las
reacciones de degradación,
como la β- oxidación de los
ácidos grasos de cadena muy
larga (AGCML: de más de 22
átomos de carbono) y del ácido
fitánico y también reacciones
de formación de
plasmalógenos (lípidos complejo
s localizados en
la mielina), colesterol y ácidos
biliares.
La β-oxidación peroxisomal de
los AGCML acorta la longitud de
su cadena para que puedan
seguir degradándose en el
interior de la mitocondria.

b. ¿Qué es una enzima y como se relaciona con los peroxisomas?
Los peroxisomas se relacionan con las enzimas, por poseer o contener una
abundante cantidad de enzima, tales como: Peroxidasa, catalasa, D-aminoácido -
aminoácido - oxidasa y urato oxidasa.
Siendo la principal la enzima catalasa, la cual inmediatamente desdobla el
peróxido de hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno evitando que la célula se lesiones.
c. ¿Cuáles son los efectos del etanol sobre las enzimas?
Ninguno, ya que la enzima catalasa degrada al alcohol.
¿Cuáles son los efectos del ácido nítrico sobre las enzimas?
El efecto es desnaturalizarlas, ya que las enzimas poseen un pH característico
donde su actividad es máxima: por encima o debajo de ese pH la actividad
disminuye.
d. Al cocinar los alimentos demasiado: ¿Cómo influye en la actividad de las
enzimas?
Existen dos factores que alteran o modifican la actividad enzimática: el pH y la
temperatura, por ello al ser cocidos los alimentos las enzimas presentes se
desnaturalizan por el cambio de temperatura.
e. Describe las enzimas presentes en el peroxisoma.
Los peroxisomas contienen básicamente tres enzimas oxidantes:
 D-amino-acid oxidase: Es una enzima peroxisomas que contiene FAD como
cofactor que se expresa en una amplia gama de especies de levaduras a
humano. No está presente en las plantas o en las bacterias que en su lugar
utilizan deshidrogenasa de D-aminoácido. Su función es la de oxidar D-
aminoácidos a los ácidos aminos correspondientes, la producción de amoniaco
y peróxido de hidrógeno.
 Urato oxidasa: Es una enzima de la clase de las oxidorreductasas, que está
presente en varios organismos tanto unicelulares como pluricelulares,
notándose sin embargo su ausencia en los seres humanos y en algunos
primates, presentándose activa en el catabolismo de las purinas.
 Catalasa: Es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas
que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno(H202) en oxígeno y
agua.
De las cuales la catalasa es la que nunca falta. Esta enzima descompone el H2O2 y
por lo tanto, es de gran importancia en el metabolismo de los ROS.

8. RECOMENDACIÓN
 Al cocer las muestras evitas que se aplasten.
 Utilizar ácido nítrico en lugar del ácido clorhídrico.
 Ser muy cuidadosos al momento de utilizar el HNO3 a las muestras.
 Sería conveniente realizar otra prueba con las muestras crudas de los tubos 3 y 4,
donde se incrementaría 2 gotas más de HNO3 de lo indicado.
 Se debería realizar una prueba tomando en cuenta la velocidad de la reacción de
las enzimas con el sustrato.
 Se debería realizar una prueba tomando en cuenta el pH que requieren algunas
enzimas para realizar su actividad enzimática.
9. CONCLUSIÓN
 Las peroxisomas posee gran cantidad de enzimas entre ellas la catalasa, la cual
degrada a sustancias toxicas como el H2O2 (principal componente del agua
oxigenada) convirtiéndolos en H2O y O2.
 EN LA PRUEBA DE LAS MUESTRAS CRUDAS
 TUBO N° 1 Y 2:
Al comparar los tubos 1 y 2, donde las muestras se encuentran machacadas y
en trozos respectivamente. Concluimos que la muestra al ser fragmentada lo
más pequeña posible, liberara mayor cantidad de catalasa expidiéndola a que
reaccione con el H2O2. Por lo tanto en el los tubos 1 y 2 hubo liberación de gas,
formándose H2O y O2. Es redundadle aclarar que en las muestras se
encuentran activas las enzimas llamadas catalasas.
 TUBO N° 3
La liberación de gas, se dio en menor cantidad. Concluimos que el alcohol no es
un factor que influya en la disminución o destrucción de la acción de la enzima
llamada catalasa. Sin embargo la pregunta es ¿Por qué la liberación de gas fue
en menor cantidad?, la respuesta es sencilla: El alcohol cubre la muestra (papa,
apio e hígado) haciendo que la velocidad de actividad enzimática sea menor.
 TUBO N° 4
La liberación de gas, se dio en ínfimas cantidades. Concluimos que la enzima
llamada catalasa se desnaturalizo en un 98% aproximadamente. La explicación
es concreta: El pH fue uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas. Por
lo tanto se requiere de una mayor cantidad de ácido nítrico para poder
desnaturalizar a las enzimas presentes en las muestras.
 TUBO N° 5
La liberación de gas, se dio en ínfimas cantidades. Concluimos que los
hidróxidos y bases influyeron en la actividad enzimática. La explicación es
concreta: Así como el tubo 4, el pH es uno de los factores que desnaturalizan a
las enzimas. Por lo tanto se requiere de una mayor cantidad de NaOH para
poder desnaturalizar a las enzimas presentes en las muestras.

 EN LA PRUEBA DE LAS MUESTRAS COCIDAS
En estas experiencias las conclusiones la realizaremos por tipo de muestra:
 MUESTRA DE PAPA:
No hubo liberación de gas. Concluimos que la muestra al ser expuesta a altas
temperaturas (al ser hervidas), las enzimas presentes se desnaturalizaron. La
explicación es sencilla: La temperatura es uno de los factores que
desnaturalizan a las enzimas.
 MUESTRA DE APIO
No hubo liberación de gas. Concluimos que la muestra al ser expuesta a altas
temperaturas (al ser hervidas), las enzimas se desnaturalizaron. La explicación
es sencilla: La temperatura es uno de los factores que desnaturalizan a las
enzimas.
 MUESTRA DE HÍGADO
En los tubos 1, 2 y 4: La liberación se dio en menor cantidad. Concluimos que la
muestra al ser expuesta a altas temperaturas (al ser hervidas), una gran parte
de las enzimas se desnaturalizaron y el otro pequeño remanente sobrevivió al
calor. Este último realizo la actividad enzimática, liberando gas donde se
formaron H2O y O2.
En los tubos 2 y 5: No hubo liberación de gas. Concluimos que el pequeño
remanente de enzimas que sobrevivió al calor, fueron desnaturalizados por la
acción del HNO3 y NaOH. Es redundadle aclarar que el pH fue uno de los
factores que desnaturalizan a las enzimas.
PREGUNTAS:
¿EN CUÁL DE LOS TUBOS HUBO MAYOR LIBERACIÓN DE GAS?
RPTA:
La mayor liberación de gas se dio EN EL TUBO 1, ya que no existió
ningún componente que influyera en la destrucción y disminución de la
actividad enzimática en las muestras.
¿POR QUÉ EN LAS MUESTRAS DE HÍGADO COCIDO NO SE DESTRUYERON LAS
ENZIMAS?
RPTA:
Porque el hígado cuenta con una gran cantidad de enzimas con
funciones oxidativas y reductivas. Por ello la muestra al ser hervidas,
una gran parte de las enzimas se desnaturalizan y el otro pequeño
remanente sobrevive al calor.

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