Микрокалориметрия: биологическое применение

Микрокалориметрия
Биологическое применение

Содержание
Оборудование
Применение
 Диагностика инфекций
 Почвы
 Титрационные эксперименты
 Другие применения
8 800 200 4225 www.intertech-corp.ru

TAM III - мультиканальная система
• TAM – мультиканальный монитор
термической активности
• Температурный диапазон: 15 – 150 °C
• Изотермический режим и медленное
сканирование (2°C/час)
• Температурная стабильность:
< 0.01 мK/24 час
• Мультифункциональные калориметры и
приставки
• Различные режимы измерения
• Высокая производительность
• До 48-ми двухканальных
калориметров теплового потока.
• Чувствительность в диапазоне нВт -
мВт и непревзойденная
долговременная стабильность
• Работа в сети TCP/IP

TAM 48 – высокая производительность
 Одновременный
анализ до 48-ми
образцов
 Кратковременный шум
менее ± 100 нВт
 Дрейф базовой линии
не более 200 нВт/сутки

Типы калориметров
Нанокалориметр Мультикалориметр
12-ти канальный
Микрокалориметр
Прецизионный
калориметр
растворения и
тирования
Миникалориметр
20 мл

Калориметры
 Нанокалориметр: Для изотермических и сканирующих
экспериментов с высокой чувствительностью теплового потока
 Изотермический титрационный калориметр: комплект из
нанокалориметры, титрационной ампулы и насоса для подачи
титранта
 Микрокалориметр: Для изотермических и сканирующих
экспериментов с образцами большого объема
 Мини/мультикалориметр: Массив миникалориметров с
высокой чувствительностью, объединяющий группы по 3 или 6
отдельных устройств (зависит от объема ампулы).
 Прецизионный калориметр растворения: Для выполнения
полуадиабатических измерений тепла, выделяющегося или
поглощающегося при растворении твердых и жидких образцов в
растворителе.

Типы ампул
 Закрытые и герметичные (статичные) ампулы
 Открытые ампулы – реакционные Micro Reaction System
 Ампулы микрорастворения Micro Solution Ampoule

Температурные режимы TAM III
 Изотермический
 Пошаговое сканирование
 Медленное сканирование (max ±2 °C/час)
СканированиеИзотермический Пошаговый
- Температурный профиль
- Тепловой поток
Тепловойпоток
Время

Калориметрия, как средство
быстрой диагностики
инфекций
На основе презентации
Andrej Trampuz, MD
University Hospital Basel, Switzerland

Микрокалориметрия: применения
Объекты Случаи
Концентраты
тромбоцитов
Культуры крови
Спинномозговая
жидкость
Синовиальной жидкости
Асцит, жидкости диализа
Кровь
Клеточные культуры
Безопасность
пациентов
Сепсис
Бактериальные
менингиты
Септические артриты
Перитониты
Малярия
Вирусные инфекции

Выделение энергии
Тепло выделяется или
поглощается при химических
реакциях или при изменении
физического состояния
Все живые организмы
выделяют тепло (метаболизм)
Если тепло (энергия)
поглощается и выделяется, то
происходит изменение
температуры Δ T
Движение атомов или
молекул

Миникалориметр
Образец
Температура термостата
37°C
Изменение температуры ∆T
<10-6°C
Предел обнаружения ± 20
нВт ≈ 2000 бактериальных
клеток
Образец
сравнения
Ampoule
Lifter
Зона
уравновешивания
Тепловой детектор
(термоэлектрический
модуль)

Выделение тепла клетками
Клетки Тепловыделение,
пВт/клетка
Адипоциты 50 (26 при ожирении)
Фибробласты 40
Опухолевые клетки ?
Гранулоциты 3
Лимфоциты 2
Эритроциты 0,01
Тромбоциты 0,06
S. aureus 10
K. pneumoniae 5
C. albicans 1

Калориметрические параметры
Высота
пика (PHF)
Время пика (TTP)
Время детекции (TTD)
Низшая точка
10 мкВт
Время (часы)
Тепловойпоток(мкВт)

Примеры кривых теплового потока
S. aureus
S. epidermidis
S. epidermidis
106 КОЕ
1 КОЕ
0.1 КОЕ
0 3 6 9 12
Время (час)
0 3 6 9 12
Время (час)
≈104 КОЕ

Бактериальное заражение тромбоцитов
 Хранение тромбоцитов при 20°С вызывает
бактериальный рост (срок хранения = 5 дней)
 Риск инфекционного заражения при трансфузии
1:2000-3000, смертность 10 – 40%. Надежных
методов скрининга нет.
Blajchman MA. NEJM 2006; 355:1303

Кривые теплового потока
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (hr)
Heatflow(µW)
0
100
200
300
400
500
600
700
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Time (hr)
Heatflow(µW)
0
50
100
150
200
250
300
350
0 8 16 24 32 40 48 56 64
Time (hr)
Heatflow(µW)
0
50
100
150
200
0 8 16 24 32 40 48 56 64
Time (hr)
Heatflow(µW)
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
E. coli
105
103
10
1
1
10
105
103
105
103
10 1
105 103
10
1
Streptococcus sanguis

Время детекции (в часах)
Микроорганизмы (ATCC) 105 КОЕ 103 КОЕ 10 КОЕ
S. epidermidis (12228) 10,8 24,1 33,4
S. aureus (29213) 3,2 5,8 18,6
S. sanguis (43046) 1,8 5,1 7,8
E. coli (25922) 2,6 4,7 6,9
P. acnes (11827) 26,9 46,4 73,6
C. albicans (14053) 24,5 54,9 43,8
Trampuz A, Salzmann S et al. Transfusion 2007 (in press)

Сравнение с колориметрическим методом
ЭДТА + кровь
E. coli (ATCC 25922)
S. aureus (ATCC 29213)
40 мл среды
Чашка для аэробных
культур
BacT/ALERT 3D –
колориметрический
метод
Одинаковая инкубация
37°C в течение 72 часов
46.5 мл
105
103
101
0
КОЕ 7.5 мл
3 мл TSB

0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 4 8 12 16 20 24
Time (h)
Heatflow(uW)
Результат: E. coli
105
103 101
0
КОЕ

Результат: S. aureus
0
50
100
150
200
250
300
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Time (h)
HeatFlow(uW)
0
50
100
150
200
250
300
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Time (h)
HeatFlow(uW)
105
103
101
0
КОЕ

Результат сравнения
Микроорганизм КОЕ
Колориметрический
метод (7 мл)
TAM III
(1 мл)
Разница (часов)
Staphylococcus aureus 7.0 x 103 12.0 4.1 -7.9
Staphylococcus epidermidis 3.9 x 104 22.5 26.6 +4.1
Streptococcus vestibularis 1.2 x 105 14.3 6.9 -7.4
Streptococcus pneumoniae 3.7 x 104 13.0 5.0 -8.0
Enterococcus faecalis 4.3 x 104 11.2 4.2 -7.0
Enterobacter cloacae 5.5 x 104 12.8 6.1 -6.7
Escherichia coli 7.6 x 103 10.3 3.5 -6.8
Klebsiella pneumoniae 5.4 x 104 9.8 6.7 -3.1
Pseudomonas aeruginosa 6.2 x 104 13.3 6.5 -6.8
Campylobacter jejuni 5.0 x 103 neg 29.2 -29.2
Candida albicans 9.0 x 104 17.7 7.5 -10.2

Микрокалориметрия почв

Почвы
Биомасса почвы
Пригоршня почвы (около 200 г)
содержит около 0,5 г биомассы
“Биологический двигатель Земли”
При загрязнении почвы
снижается доля биомассы.
Можно ли использовать TAM III
для оценки негативного
влияния?

Почвы
Normalizedheatflow(µW/g)
Time (hour)
0 8 16 24 32 40 48
0
50
100
150
200
Soil 17 (3-15-10).rslt, Ca(NO3)2 Glu Soil 16 (3-19-10).rslt, Straw+N Glu
Soil25 (3-26-10).rslt, 25 FYM Gluc Soil 23 (3-19-10).rslt, Sludge Glu
Soil 45 (3-19-10).rslt, (NH4)2SO4 Glu
Normalizedheat(J/g)
Time (hour)
8 16 24 32 40 48
0
2
4
6
8
5 проб обработанных
почв с добавкой 0,07 М
глюкозы
Тэкс = 25°С
Время = 48 часов

Титрование
Эксперименты ITC

Комплект для титрования TAM III
 Управление:
 Объемом, интервалами и
скоростью инжекций
 Скоростью перемешивания
титруемой пробы
 Включает:
 Станция титрования для
двух шприцев
 Модуль управления
 Можно выбрать шприцы
объемом от 100 мкл до 2 мл
 Управление ПО TAM Assistant,
которое включает модуль
анализа лигандообразования

 Важный метод для
изучения
межмолекулярного
взаимодействия и
термодинамических
исследований
связывания.
 Наиболее используемый
метод для исследования
биологических молекул
и систем.
Heatflow(µW)
Time (hour)
0 1 2 3
0
5
10
15
20

Основное средство для изучения
взаимодействия биологических макромолекул:
- Антигены – Антитела
- Пептиды – Протеины
- Липиды – Протеины
- Нуклеиновые кислоты – Протеины
- Углеводы – Протеины
- Маленькие молекулы/Лекарства – Протеины
- Протеины – Протеины
- Протеины – Рецепторы (растворенные и связанные
на мембранах)

Преимущества ITC
Высокая точность и воспроизводимость
Применимость для большинства
исследований
Нет необходимости в химической
модификации
Нет необходимости в иммобилизации, но она
возможна
Равновесные условия
Нет ограничений для непрозрачных
образцов, в том числе суспензий

Характеристики связывания
Константа связывания, KD
 Для высокопрочных связей требуются наномоли образца
 Для более слабых связей макромолекул тебуются
микромоли образца
Стехиометрия связывания, n
Термодинамические величины , ΔH, ΔG, ΔS и ΔCp
 ΔH – измерение теплового эффекта
 ΔCp – измерение температурной зависимостиΔH (dDH/dT)
 ΔG – измерение константы равновесия (ΔG = -RTlnK)
 ΔS – измерение «упорядоченности» системы (ΔG = DH-
TΔS)

Термодинамические профили ITC
-20
-15
-10
-5
0
5
10
kcal/mole
Схема A Схема B Схема C
DG
DH
-TDS
Favorable hydrogen bonds
Conformational change
Доминирование
гидрофобных
взаимодействий
Favorable hydrogen bonds
Гидрофобные взаимодействия

Профили связывания ВИЧ-протеазы
-20
-15
-10
-5
0
5
kcal/mole
DG
DH
-TDS
Indiravir Nelfinavir Saquinavir Ribonavir Amprenavir Lopinavir KNI-272 KNI-764
Ранние фармпрепараты на основе связывания ВИЧ-протеазы имели сильный
энтропийный компонент, что приводило к побочным эффектам при применении.
Современные ингибиторы HIV-1 имеют сильный энтальпийный компонент, что дает
лучшую специфичность.

Взаимодействие протеин-ДНК
Раствор 85 мМ репрессора
метионина (MetJ) без добавки
(верхняя кривая титрования) и с
добавкой 150 мМ ДНК (нижняя
кривая титрования) титруются
раствором 2,2 мМ аденозил
метионина (SAM)
Температура 25oC
Фосфатный буфер, pH 7.0
KD = 1.1x10-5
ΔG = -6.8 ккал/моль
ΔH = -10.5 моль
ΔS = +0.01 e.u
Cooper, A., et al. FEBS Letters (1994) 348, 41-45.

Контроль качества
Качество протеинов
 Сравнение групп
антител анти-хинидина
 Количественное
определение антител,
иммобилизированных
на металлических
частицах
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
-10
-8
-6
-4
-2
0
Molar Ratio
kcal/moleofinjectant
Активное
Частично активное

Титрование одной инжекцией
 Метод одной инжекции: быстрый и
универсальный метод для изучения
кинетики быстрых и медленных реакций
Пенициллин: инъекция 15 мкл, 10,2 мМ
Пенициллиназа: 950 мкл 7.7 x 10-11 M
A: исходные данные
B: степень гидролиза (нормализовано по
[E]), график построен методом
линеаризации по Лайнуиверу и Берку
(Lineweaver-Burk) (зависимость обратной
скорости от 1/[S]);
Vmax = пересечение с осью Y,
KM = пересечение с осью X,
kcat = Vmax/[Etotal]
• KM = 30,7 мМ
• Vmax = 1.4 x 10-10 моль/сек
• kcat = 1950 1/сек
A
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
time / s
heatrate/µW
B
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 20 40 60 80 100 120 140 160
[S] / µM
rate/s
-1

Титрование одной инжекцией
Ингибирование энзимов
Синий: введено 10 мкл 5,1 x 10-7 M
трипсина в 950 мкл 1,44 x 10-4 M BAEE
Красный: + 1,36 x 10-4 M бензамида
Энтальпия одинакова в обоих случаях,
ΔH = -6.33 ккал/моль BAEE
 (-) ингибитор: KM = 4.17 мМ; Vmax = 0.091
мМ/сек, kcat = 17.8 1/сек
 (+) inhibitor: KM = 35.1 мМ; Vmax = 5.9 x 10-4
мМ/сек, kcat = 0.11 1/сек, Ki = 18.4 мМ
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
time / s
heatrate/µW
B
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60 80 100 120 140
[S] / µM
rate/s
-1

ITC: метаболизм
Титрование раствора Micrococcus 10 мг/мл в воду
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 2000 4000 6000 8000 10000
Elapsed Time (s)
HeatRate(µJ/s)
Инжекция 5 мкл
Кислород израсходован

Другие применения TAM III
8 800 200 4225

Мониторинг донных отложений
1 - Донные отложения с азотсодержащими ОВ
2 - Донные отложения с хлорорганическими соединениями серы
Смирнова Л. Л. Микробиологические методы при экологическом мониторинге донных отложений
черноморского шельфа. Екологічна безпека прибережної та шельфової зон та комплексне
використання ресурсів шельфу : зб. наук. пр..- Севастополь - 2013. - Вип. 27. - С. 422-430

Тепловыделение корнями пшеницы
1 – контрольная проба
2 – проба с добавкой 0,02 мМ нистатина
Гордон Л.Х и др.,
Энергетический обмен
клеток корней пшеницы
при модификации
ионной
проницаемости
плазмалеммы
каналоформером
нистатином.
Цитология,
47(12): 1088–1094.

Активность макрофагов и наночастицы
M. H. D. Kamal Al-Hallak, Microcalorimetric Method to Assess Phagocytosis: Macrophage-Nanoparticle
Interactions AAPS J. 2011 March; 13(1): 20–29

Сорбция воды наночастицами
RH Perfusion Ampoule
 В ампуле можно создавать атмосферу с
заданным значением влажности или
парциального давления летучего
органического вещества.
 Блок управления потоками газа служит для
управления влажностью в ампуле.
 Влажность может меняться ступенчато или по
линейному закону.
 Можно использовать стальные, стеклянные
ампулы или ампулы из сплава Hastelloy (pH <4)
объемом 1, 4 или 20 мл

Сорбция воды наночастицами
Monica Ratoi, Peter H.
M. Hoet, Alison
Crossleyc and Peter
Dobsond, Impact of lung
surfactant on wettability
and cytotoxicity of
nanoparticles, RSC Adv.,
2014, 4, 20573

Ферментация молока
Молоко + 1% стартовой культуры
Без добавки, +декстроза, +NaCl, +Na-
бензоат
Ампулы 20 мл при 19oC

0 50 100
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
time / h
heatproductionrate/mW
Ферментация молока
Без добавки
+декстроза
+NaCl
+ Na бензоат

Активность насекомого
10000 20000 30000 40000
Time(s)
0.0
40.0
80.0
120.0
20.0
60.0
100.0
Heatflow(W)
ActiveMillipede!
NoticedecreasedsignalduetoO2consumption
Baseline(~0W)
Conditions:
TAMTemperature25°C
SideA:Millipedesealedinside4mLSSscrewcapampoule
SideB:Empty4mLSSscrewcapampoule
Примечание: один красный муравей дает ~30 мкВт*
* Ни одно насекомое не пострадало в ходе эксперимента.
Exo

Контакты
Москва
Минск
Екатеринбург
Красноярск
Новосибирск
Алматы
Донецк
Ростов-на-Дону
8-800-200-4225
(звонок бесплатный по РФ)
www.intertech-corp.ru
info@intertech-corp.ru
Киев
Волжский
Хабаровск

Микрокалориметрия: биологическое применение

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (13)

Similar to Микрокалориметрия: биологическое применение

Similar to Микрокалориметрия: биологическое применение (20)

Микрокалориметрия: биологическое применение