Wyklad 4

Wykład 4 – Biokataliza. Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Biokatalizatory:

Enzymy – zbudowane z aminokwasów (białka)

Rybozymy – zbudowane z rybonukletydów (RNA)


Enzymy są „superkatalizatorami”

• niezwykle duża efektywność katalizy

• wysoka aktywność katalityczna w umiarkowanych warunkach

• swoistość reakcji

• specyficzność substratowa

• stereospecyficzność

• praktycznie 100% wydajność; brak produktów ubocznych


Siła katalityczna enzymów jest zdumiewająca


SWOISTOŚĆ SUBSTRATOWA
L-asparaginaza EC 3.3.1.1

Substrat Aktywność KM × 105 (M) V
względna

L-asparagina 100 1 0.965

D-asparagina 5 6200 0.177

Amid kwasu bursztynowego 20 1500 0.240

Diamid kwasu bursztynowego 0 - -


Stereospecyficzność działania enzymów


Dlaczego enzymy są tak efektywnymi katalizatorami?

-grupy funkcyjne w centrum aktywnym

-hydrofobowy charakter centrum aktywnego

-współdziałanie koenzymów

-kataliza kwasowo-zasadowa

-maksymalne zbliżenie i optymalne ustawienie substratu(ów)

-wzbudzone dopasowane enzymu


Centrum aktywne
Centrum aktywne

Kompleks
enzym:substrat
Struktura kompleksu
enzym-substrat

Centrum aktywne może obejmować reszty
odległe od siebie w sekwencji aminokwasowej
Centrum aktywne może obejmować
reszty aminokwasowe odlegle od siebie
łańcucha polipeptydowego
w sekwencji aminokwasowej enzymu
W centrum aktywnym znajdują się reszty wiążące
substrat (ew, także koenzym) oraz reszty katalityczne


Niektóre enzymy potrzebują pomocników...

Koenzym – niewielka cząsteczka organiczna współpracująca
z cząsteczką enzymu podczas aktu katalitycznego,
której obecność jest niezbędna dla katalizy.
Koenzym wiąże się z enzymem tylko w trakcie
aktu katalitycznego

Grupa prostetyczna – cząsteczka organiczna lub jon metalu
niezbędna dla działania enzymu,
połączona trwale z cząsteczka enzymu


Szybkość reakcji enzymatycznej
Enzym, podobnie jak każdy inny katalizator, przyśpiesza reakcję,
ale nie zmienia jej stanu równowagi.

Enzymy katalizują jedynie reakcje termodynamicznie możliwe,
czyli takie, dla których ∆G≤0.
Uwaga: enzymy w komórkach mogą katalizować reakcje, dla których
∆G°>0. Warunek: sprzężenie z reakcją, dla której ∆G°<0.

Warunkiem zajścia reakcji jest efektywne zderzenie cząsteczek
(cząsteczki muszą posiadać odpowiednią energię oraz być
odpowiednio ustawione względem siebie)

Najmniejsza energia, którą należy dostarczyć molowi substratów,
aby każda z cząsteczek stała się reaktywna – energia aktywacji

Szybkość reakcji zależy od energii aktywacji układu.
v = f (∆G*)


Enzymy obniżają energię aktywacji układu


Enzym wiążąc substrat przyjmuje konformację
komplementarną do stanu przejściowego

Indukowane dopasowanie enzymu Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Konformacja heksokinazy zmienia się w wyniku związania substratu
Indukowane dopasowanie substratu


Enzym przyciąga substrat do centrum aktywnego

Sposoby oddziaływań elektrostatycznych
enzymu z substratem

Rozkład potencjału elektrostatycznego wokół
enzymu – dysmutazy nadtlenkowej
Pokazano obszary potencjału dodatniego i ujemnego.
Substrat: O2-. jest naładowany ujemnie

Efekt Kirke

Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez
enzym od stężenia substratu ma kształt hiperboliczny

V [S ]
v=
K M + [S ]

Czynniki wpływające na aktywność enzymu
v

• temperatura
•odczyn środowiska
•potencjał redoks
T

Zależność aktywności enzymu
od temperatury
∆ [P] v
t1
50oC

70 oC

80 oC
Zależność aktywności t2
enzymu od pH
t1 t2 t T

Kształt wykresu v = f(T) może się zmieniać
w zależności od momentu pomiaru


Wytwarzanie enzymów

Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące się
warunkami:

1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celów
przemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes)
2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów
terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości

Obecne tendencje w produkcji enzymów:

1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przez
enzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkach
nadprodukcji
2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojów
ekstremofilnych
3. Zastosowanie inżynierii białka – enzymy o zmienionych właściwościach


Schemat technologiczny wytwarzania enzymu
typu „bulk”


Enzymy proteolityczne w przemyśle
Enzym Reakcja Źródło enzymu Zastosowanie
lub substrat
Papaina Hydroliza białek Papaya latex Usuwanie zmętnienia
piwa, kruszenie mięsa

Renina Ścinanie mleka Żołądki cielęce, białko Wytwarzanie serów
rekombinowane
Kruszenie mięsa,
Trypsyna, Hydroliza białek Jelita zwierzęce zastosowania
chymotrypsyna medyczne

Proteazy grzybowe Aspergillus oryzae Kruszenie mięsa,
Hydroliza białek piekarnictwo,
Aspergillus niger piwowarstwo
Serowarstwo
Mucor pusillus
Rhizomucor miehei
Cryptonectria parasitica

Proteazy bakteryjne Bacillus subtilis Środki piorące,
Hydroliza białek usuwanie żelatyny


Enzymy metabolizujące węglowodany w przemyśle
Enzym Reakcja Źródło Zastosowanie
lub substrat enzymu
Amylaza Hydroliza wiązań Bacillus subtilis Hydroliza skrobi
α(1→4) glikozydowych Aspergillus oryzae

Celulaza Hydroliza wiązań Trichoderma viride Hydroliza celulozy
β(1→4) glikozydowych Aspergillus niger do celobiozy

β-galaktozydaza; laktoza Aspergillus spp. Otrzymywanie cukrów prostych
sacharaza; sacharoza Sacharomyces z disacharydów
β-glukoozydaza

Oksydaza glukozowa Glukoza + O2 → Aspergillus niger Analityka medyczna
Glukonolakton + H2O2 Usuwanie cukru
z produktów jajecznych
Usuwanie O2 z majonezu
i soków
Izomeraza ksylozowa Glukoza → Fruktoza Streptomyces spp. Otrzymywanie słodkich
Lactobacillus brevis syropów

Inne enzymy znajdujące zastosowanie w przemyśle

Enzym Zastosowanie

Izomeraza 11βsterydowa Biotransformacja sterydów

Aminoacylaza Otrzymywanie optycznie
czynnych aminokwasów

Penicylinaza Otrzymywanie kwasu 6AP

Hydrataza nitrylowa Synteza aminokwasów

Lipaza Hydroliza triacyloglicerydów

Pektynaza Klarowanie soków


Immobilizacja enzymów
Metody immobilizacji
a) Adsorpcja na powierzchni nośnika (alumina, hydroksyapatyt, kaolinit
szkło, matryce jonowymienne);
b) Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem (poliakrylamid, nylon, celuloza,
dekstran, Sephadex, Sepharose, Agarose, żel krzemionkowy,
kulki szklane). Konieczna aktywacja nośnika;
c) Uwięzienie w matrycy
- akrylamid polimeryzowany w roztworze enzymu
- żele tworzone in situ w roztworze enzymu;
d) Kapsułkowanie w membranie
półprzepuszczalnej
liposomy, kapsułki nylonowe,
celofanowe, celuloidowe,
poliuretanowe
e) Sieciowanie międzycząsteczkowe
Czynniki sieciujące:
aldehyd glutarowy,
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen;
.


Metody kowalencyjnej
immobilizacji enzymów



Immobilizacja enzymu z zastosowaniem molekularnego wysięgnika

1 – immobilizacja bez wysięgnika; 2 - immobilizacja z użyciem krótkiego wysięgnika;
3 – immoblizacja z użyciem długiego wysięgnika; 4 – wysięgnik zbyt długi;
5 – immobilizacja wielopunktowa; 6, 7, 8 – relacja wysięgnik:centrum aktywne
Immobilizowanego enzymu


Otrzymywanie sol-żeli z zastosowaniem różnych dodatków oraz metod suszenia

Sol-żele: żele nieorganiczne
Otrzymywane głównie z tlenków
krzemu, tytanu, cyrkonu, glinu
i glinokrzemianów

Większe możliwości – alkoksydy
Si(OR)4 i alkoksysilany
XSi(OR)3 oraz XX’Si(OR)2

Aerożele – wysuszane przez usunięcie płynu w stanie nadkrytycznym (CO2 – Tk = 31°C)
Ambiżele – z materiałów zawierających dużą liczbę grup hydrofobowych



Schemat immobilizacji enzymów w hydrożelach: a) alginianie wapnia; b) karagenianie



Schemat silanizacji szkła oraz immobilizacji enzymów po uprzedniej funkcjonalizacji
podstawników silanowych

Przykłady procesów przemysłowych prowadzonych
z użyciem immobilizowanych enzymów
Enzym Matryca Metoda Zastosowanie
immobilizacji

Aminoacylaza DEAE-Sephadex Adsorpcja Otrzymywanie
L-aminokwasów

Izomeraza Amberlit IRA904 Adsorpcja Otrzymywanie
glukozowa syropu fruktozo-
glukozowego

Termolizyna Układ dwufazowy Otrzymywanie
aspartamu

β-galaktozydaza Krzemionka Adsorpcja Otrzymywanie mleka
wolnego od laktozy

Amidaza Poloakrylamid, Uwięzienie w Otrzymywanie 6-
penicylanowa celuloza matrycy APA

Oksydaza Kapsułkowanie Oznaczanie glukozy
glukozowa
Peroksydaza


Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych

Charakterystyka biokatalizy dwufazowej w układzie woda/rozpuszczalnik organiczny

Potencjalne zalety:
-wysoka rozpuszczalność substratu i produktu
-zmniejszenie możliwości inhibicji przez produkt lub nadmiar substratu
-ułatwione wyodrębnienie produktu i odzysk biokatalizatora
-wysoka rozpuszczalność gazów w rozpuszczalnikach organicznych
-korzystne przesunięcie równowagi reakcji

Potencjalne wady:
-możliwa denaturacja i.lub inhibicja biokatalizatora przez rozpuszczalnik organiczny
-zwiększona złożoność reakcji



prof. Ernest Sym

zapoczątkował na PG
badania w dziedzinie
biotechnologii;
światowy pionier badań
nad katalizą enzymatyczną
w układach niewodnych.



Biokompatybilne rozpuszczalniki organiczne

Kryterium – wartość parametru Hanscha - log Poct - współczynnik podziału
w układzie n-oktanol/woda

Rozpuszczalniki charakteryzujące się log Poct <2 są uważane za nieprzydatne do
biokatalizy; log Poct = 2 ÷ 4 – biokompatybilność pośrednia i zmienna; log Poct > 4
rozpuszczalniki biokompatybilne

Przykłady:
n-dekanol 4,0 n-heptan 4,0
n-dodekanol 5,0 n-nonan 5,1
eter difenylowy 4,3 n- undekan 6,1
benzoesan pentylu 4,2
oleinian butylu 9,8
ftalan dibutylu 5,4



(a) dwufazowa emulsja wody
w oleju
(b) dwufazowa emulsja oleju
w wodzie
(c) enzym immobilizowany
na porowatym nośniku
w układzie dwufazowym
(d) enzym w odwróconej miceli
(e) kowalencyjnie zmodyfikowany
enzym (np. glikolem
polietylenowym) w rozp. org.
(f) immobilizowany enzym
rozpuszczony w rozp. org.
(g) sproszkowany enzym
rozpuszczony w rozp. org.

Biokataliza w innych układach

Układ faza stała/faza gazowa
Brak problemów z przenikaniem masy
Kataliza z udziałem enzymów takich jak: dehydrogenaza alkoholowa, oksydaza
alkoholowa, lipazy. Reakcje – synteza związków lotnych, jak aldehydy, estry, ketony

Reakcje w cieczach nadkrytycznych
Duże szybkości przenikania masy i łatwe wyodrębnianie produktów. Aparatura
wysokociśnieniowa

Stosuje się głównie ditlenek węgla (Tk = 31°C). Reakcje dotyczące związków
hydrofobowych, m.in. utlenianie cholesterolu przez oksydazę cholesterolową,
stereoselektywne hydrolizy estrów przez immobilizowane lipazy, syntezy dipeptydów
z użyciem enzymów proteolitycznych

Biokataliza w cieczach jonowych
Sole nie krystalizujące w temperaturze pokojowej (kation 1,3-dialkiloimidazoliowy lub
N-alkilopirydyniowy i anion BF4-, BF6- lub NO3-. Wiele enzymów wykazuje trwałość
w cieczach jonowych, a nawet korzystniejsze właściwości (dotyczy to m.in. lipaz)


Przykłady zastosowań

Działanie fosfolipaz na fosfatydylocholinę

Schemat procesu usuwania fosfolipidów z olejów (odśluzowywanie)


Schemat produkcji syropu glukozowego
E1 – alfa amylaza, E2 - glukoamylaza


Reakcje katalizowane przez monooksygenazy wykorzystywane
do biotransformacji w praktyce przemysłowej

(a) hydroksylowanie alkanów

(b) hydroksylowane arenów

(c) epoksydacja alkenów

(d) utlenianie heteroatomów

(e) utlenianie ketonów do estrów


Biokatalityczna synteza optycznie czynnych aminokwasów
O O O
R R R
OH NH2 OR2
NHC(O)R1 NH2 NHR1

Acylaza Amidaza Esteraza
lub proteaza

CO2H

H NH2
R dehydrogenaza
liaza
redukcyjne aminowanie
addycja amoniaku
do podwójnego wią zania
O
O R
OH
R OH O

ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIA
OPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW

aspartaza COOH
H COOH
L
NH3 + C C
HOOC H H2N H CH2COOH

amoniako-liaza
COOH
H COOH fenyloalaninowa
NH3 + C C
L
aminoacylaza
H z Aspergillus oryzae 2N L-aminokwas + CH3COO-
H H CH2
synteza NAc-DL-aminokwas
chemiczna
NAc-D-aminokwas
racemizacja

Biosynteza optycznie czynnych aminokwasów białkowych



ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIA
OPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW
O
OH O
D
amidohydrolaza D OH
O NH
O NH2
DL NH hydantoinaza NH2
N O
H O
racemizacja, pH 8 L NH
N
H O

Synteza/biosynteza optycznie czynnych pochodnych glicyny
– substratów dla otrzymywania penicylin półsyntetycznych

Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne

Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G


Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)
Warunki hydrolizy enzymatycznej
Biotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V
przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pH
na poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH, NaOH lub wody aminiakalnej. Produkty:
6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się
poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika
organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się,
a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracany
jako dodatek do nowej fermentacji

Korzyści z zastąpienia chemicznej
hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę
enzymatyczną
Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników
organicznych, toksycznych odczynników i odpadów
oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia;
prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach;
łatwa kontrola pH, temperatury;
zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych;


Synteza aspartamu z zastosowaniem biotransformacji enzymatycznej


Biotransformacje sterydów

Wyklad 4

Recommended

Recommended

More Related Content

More from marwron

More from marwron (20)

Wyklad 4