2. Introduzione
Lo scopo di questa esperienza è quello
di osservare la molecola del DNA.
Il DNA è una struttura a forma di
elica, sede delle informazioni
genetiche, contenuta all’interno della
cellula nel nucleo di tutte le molecole
eucariote, mentre in quelle
procariote è sparsa nel citoplasma.
3.
4. Il campione di partenza da cui estrarremo il
DNA potrebbe essere di vario tipo ma per
la facile reperibilità, useremo la polpa di
alcuni frutti.
Possiamo suddividere questa esperienza in
cinque diverse fasi:
• Preparazione del materiale (preparazione
della poltiglia e della soluzione di
estrazione);
• Demolizione della struttura cellulare;
• Digestione delle proteine;
• Precipitazione del DNA;
• Colorazione del DNA.
5. Preparazione del materiale :
Campione in esame
• Pesare circa 50 g di frutta o di verdura
e pestarla delicatamente in un mortaio
per non più di 2-3 minuti aggiungendo
qualche mL di acqua, se necessario.
N.B: se si pesta troppo a lungo, il DNA
si rompe e i filamenti risulteranno
troppo corti e difficili da osservare.
6. Preparazione del materiale:
Soluzione di estrazione
In un cilindro graduato da 100 ml misurare
10 ml di detersivo per piatti, pesare 4 g e
versarli nel cilindro, portare a volume con
acqua distillata. Mescolare con una bacchetta
evitando la formazione di schiuma.
N.B: L’NaCl si dissocia in Na+Cl- denaturando
le proteine (istoni), la cui funzione è quella
di compattare il filamento di DNA. Il
detersivo contiene sostanze tensioattive che
sciolgono i lipidi presenti nelle membrane
cellulari.
9. Demolizione della
struttura cellulare
• Mettere in un beker il campione in esame e la
soluzione di estrazione.
• Prendere il beker e metterlo a bagno maria a
60°C per 15 minuti agitando di tanto in tanto
(l’alta temperatura facilita la rottura delle
membrane e inibisce l’attività della DNasi).
• Raffreddare poi in bagno di ghiaccio per circa 5
minuti agitando per uniformare la temperatura
(si deve impedire che l’alta temperatura
protratta nel tempo possa causare la rottura del
DNA);
• Filtrare il contenuto in una provetta fino ad
ottenere circa 5ml di soluzione.
10. Digestione delle proteine
• Aggiungere 5 gocce di pepsina attivata
in HCl , agitare delicatamente e far
agire per 5 minuti (liberazione
definitiva del DNA dagli istoni).
11. Precipitazione del DNA
• Aggiungere circa 5 ml di alcol etilico
gelato (tenuto in freezer) facendolo
scorrere lungo le pareti della provetta,
mantenuta inclinata, in modo da farlo
stratificare sulla soluzione.
• Far riposare nel portaprovette;
• Osservare il DNA che appare come un
filamento gelatinoso nello strato
superiore di etanolo.
12. Colorazione del DNA
• Allestire un vetrino “a fresco”
colorando con blu di metilene
(0,02% - 0.04%).
13. Ricapitolando….
Preparare soluzione
Preparare soluzione
estrazione, pesare 4g di NaCl +
estrazione, pesare 4g di NaCl +
10 ml di detersivo per piatti,
10 ml di detersivo per piatti,
portare aa100 mL con H2O
portare 100 mL con H2O
distillata
distillata
Preparazione poltiglia,
Preparazione poltiglia,
schiacciare frutta sbucciata in un
schiacciare frutta sbucciata in un
mortaio con qualche mL di H2O
mortaio con qualche mL di H2O
distillata.
distillata.
Versare in un beker entrambe le soluzioni, mescolare delicatamente,
Versare in un beker entrambe le soluzioni, mescolare delicatamente,
mettere aabagno maria aa60°C per 15 minuti eesuccessivamente in
mettere bagno maria 60°C per 15 minuti successivamente in
bagno di ghiaccio per 5 minuti.
bagno di ghiaccio per 5 minuti.
Filtrare, raccogliere 5 mL di filtrato in una provetta
Filtrare, raccogliere 5 mL di filtrato in una provetta
eeaggiungere 5 gocce di pepsina, lasciando agire
aggiungere 5 gocce di pepsina, lasciando agire
per 5 minuti. Aggiungere alcol etilico gelato al
per 5 minuti. Aggiungere alcol etilico gelato al
filtrato facendolo scorrere lungo le pareti, far
filtrato facendolo scorrere lungo le pareti, far
riposare eeosservare la formazione del DNA.
riposare osservare la formazione del DNA.
Allestire un vetrino colorando con blu di metilene.
Allestire un vetrino colorando con blu di metilene.
