H παρουσίαση της εργασίας μου στα πλαίσια του μεταπτυχιακού μου στο ΕΑΠ

1. Ρυθμιστικοί ρόλοι των μορίων RNA.
Μηχανισμοί, εφαρμογές και
σύγχρονες εξελίξεις.
ΜΙΧΑΗΛ Ι. ΣΚΡΙΜΠΑΣ
Επιβλέπων καθηγητής: ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ
ΑΘΗΝΑ
ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ,2013

2. Ο κόσμος του RNA
Coding
messenger RNA (mRNA)
 Μεταφέρει την γενετική πληροφορία
 Λάθη στην επεξεργασία του, οδηγούν
σε σοβαρές παθήσεις
Non-coding
• Ribosomal RNA (rRNA)
• Transfer RNA (tRNA)
• Small nuclear RNA (snRNA)
• Small nucleolar RNA (snoRNA)
• Interference RNA (RNAi)
• Short interfering RNA (siRNA)
• Micro RNA (miRNA)
Ribonucleic acid - Ριβονουκλεϊκό οξύ
Σπουδαιότητα:
Καταλύει την μεταγραφή του DNA.
Μόριο RNA είναι εκείνο που «εκφράζεται» σε πρωτεϊνες.
Ρυθμίζει διάφορες λειτουργίες του κυττάρου.
Αντιμετώπιση γονιδιακών ανωμαλιών που οδηγούν σε ασθένειες
όπως ο καρκίνος.
Μόρια RNA

3. Μηνυματοφόρο RNA – messenger RNA
 RNA πολυμεράσες μεταγράφουν
το δίκλωνο DNA σε μονόκλωνο
RNA.
 Τροποποίηση των άκρων του pre-
mRNA ώστε να εξέλθει από τον
πυρήνα και να αποκτήσει
σταθερότητα (capping και poly-A
ουρά).
 Ειδικά μικρά RNAs αποκόπτουν
τα εσώνια και δημιουργούν το
ώριμο, προς μετάφραση, mRNA.
 Το ώριμο mRNA μεταφράζεται
στο κυτταρόπλασμα από το
ριβόσωμα.
 Το εναλλακτικό μάτισμα
δημιουργεί διαφορετικά mRNA
οπότε και παραγωγή διαφορετικών
πρωτεϊνών.

4. Μη κωδικά RNA – non coding RNA
• Συμμετέχουν στην ενδονουκλεοτιδική
διάσπαση και σύνθεση RNAs.
• Έχουν ενζυμική δράση.
• Επεξεργάζονται και τροποποιούν άλλα RNAs.
• Συμμετέχουν στην μεθυλίωση του DNA.
• Συνθέτουν τελομερή του DNA.
• Συμμετέχουν στην γονιδιακή ρύθμιση.

5. Μικρά πυρηνισκικά RNA -snoRNAs
•Μέγεθος <100nt, διαχωρίζονται σε: C/D box και
H/ACA box.
•Τροποποιούν άλλα μόρια RNA κυρίως rRNA,
tRNA και snRNA.
•Συμπλοκοποιούνται με πρωτεΐνες σε snoRNP
τέμνοντας το pre-mRNA.
•Δείκτες θετικής διάγνωσης μη μικροκυτταρικού
καρκίνου αλλά και του καρκίνου του εγκεφάλου.
Μικρά πυρηνικά RNA -snRNAs
•Πλούσια σε ουρακίλη - δρουν στο πυρηνόπλασμα
έχοντας συντεθεί από την pol-II.
•Ομάδα Sm με αλληλουχία U ανάμεσα σε δύο
δομές διχάλας και ομάδα LSM με την αλληλουχία U
στο 3΄ άκρο.
• Αποτελούν τον πυρήνα του σπλισεοσώματος
εκτός του U7 που συμμετέχει στην επεξεργασία των
ιστόνων του pre-mRNA.
•Ρόλος σε γενετικές ανωμαλίες που προκαλούν την
νωτιαία μυική ατροφία αλλά και tauopathies.

6. RNAs σωματιδίων Cajal - scaRNAs
•Βρίσκονται στα σωματίδια Cajal και περιέχουν και
την C/D και την H/ACA ομάδα.
•Τροποποιούν snRNAs με μεθυλίωση και με
σύνθεση ψευδοουρίνης.
•Έχουν σημαντικό ρόλο, μέσω των snRNAs, στην
εμφάνιση της Νωτιαίας Μυϊκής Ατροφίας.
RNA υπομονάδα τελομεράσης
• Ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο που
επιμηκύνει τα τελομερή.
• Αποτελείται από την TERT και την
TERC.
• Συνεργάζεται με πρωτεϊνες και
μεταλλάξεις της οδηγούν σε νόσους
όπως η συγγενής δυσκεράτωση
(πρόωρη γήρανση).
• «Τελομεριδιακή θεωρία της
γήρανσης».

7. Οδηγοί RNA - guide RNAs
•Απαραίτητα στην ωρίμανση και σωστή
λειτουργία των περισσοτέρων πρωτεϊνών του
μιτοχονδριακού mRNA.
•Προσθέτουν κατάλοιπα ουρακίλης σε
συγκεκριμένες θέσεις του mRNA.
•Προκαλούν σίγηση ή ενίσχυση της
παραγωγής συγκεκριμένης πρωτεΐνης.
•Χρήση στην αντιμετώπιση πολλών μορφών
καρκίνου.
Σωμάτιο αναγνώρισης σήματος - SRP RNA
•Αποτελείται από RNA και πρωτεϊνες και
προσκολλάται σε υποδοχείς στο ER.
•Αναγνωρίζει συγκεκριμένη αλληλουχία
αμινοξέων στο άκρο πρωτεϊνών, βοηθά την
μετακίνηση τους.
•Aλληλουχίες Alu που ανιχνεύονται σε
πολλές γενετικές ανωμαλίες.
• Το 7SL SRP RNA περιέχεται στο πακέτο
ρετροϊών.

8. Αντινοηματικά RNAs - antisense RNAs
•Έχουν συμπληρωματική αλληλουχία ως προς την
περιοχή-στόχο του mRNA.
•H ένωση asRNA-mRNA στον πυρήνα, εμποδίζει την
επεξεργασία και την μεταφορά στο κυτταρόπλασμα ενώ
ένωση στο κυτταρόπλασμα εμποδίζει την μετάφραση.
•Αναστολή έκφρασης γονιδίου “gene knock down”,
αντιμετώπιση μεταλλάξεων “gain of function” αλλά και
υπερέκφρασης πρωτό-ογκογονιδίων.
RNAs εξαρτώμενα από PiWi πρωτεΐνες - piRNA
• Έλεγχος της δράσης των μεταθετών
στοιχείων (transposable elements TEs), που
έχουν ως αποτέλεσμα την αλλοίωση και την
μετάλλαξη της γονιδιακής αλληλουχίας.
• Το σύμπλοκο piRISC, αναγνωρίζει και
απενεργοποιεί την δράση των Tes.
• Δυσλειτουργίες σε δύο μέλη των PIWI
πρωτεϊνών σε ποντίκια, οδηγούν σε
αντιμεταθέσεις της ανδρικής γαμετικής
σειράς προκαλώντας στειρότητα.

9. • Προέρχονται από την επεξεργασία του 5’ ή 3’ άκρου του tRNA.
• Τρεις ομάδες, ανάλογα με την περιοχή του tRNA από την οποία προήλθαν.
Η πρώτη προήλθε από το 5΄ άκρο ώριμο ή πρώιμου tRNA, η δεύτερη από
το 3΄ άκρο που περιλαμβάνει και την CCA αλληλουχία και η τρίτη ομάδα
προήλθε από το 3΄ άκρο πρώιμου tRNA ή pre-tRNA, ονομάζονται 3΄
ακόλουθοι (trailers).
• Η έκφραση τους συνδέεται με την εμφάνιση καρκίνου, τον κυτταρικό
πολλαπλασιασμό και την στοχευμένη γονιδιακή αποσιώπηση.
Θραύσματα tRNA - tRFs

10. Ριβοένζυμα
• RNA με καταλυτικές ιδιότητες, ανατρέπουν την άποψη πως μόνο οι
πρωτεΐνες μπορεί να αποτελούν ένζυμα καθώς και την θεωρία της
εξέλιξης. (Πως έγινε η σύνθεση DNA χωρίς ένζυμα ή αντίστροφα
πως έγινε η σύνθεση ενζύμων χωρίς DNA;)
• Καταλύουν χημικές αντιδράσεις και δεσμούς σε άλλα μόρια αλλά
και στον εαυτό τους.
• Εκτός άλλων, περιλαμβάνουν το ριβοένζυμο της ηπατίτιδας D, το
ριβοένζυμο “φουρκέτα” και το σφυροκέφαλα ένζυμα εμπλέκονται
στην διαδικασία της RNA αντιγραφής διαχωρίζοντας και ενώνοντας
νουκλεοτίδια.
• Το ριβόσωμα περιέχει ριβοένζυμα διότι παραμένει ενεργό ακόμη
και μετά την απομάκρυνση των συνεργαζόμενων με αυτό
πρωτεϊνών. Η πεπτιδυλοτρανσφεράση δεν περιέχει πρωτεϊνικά
στοιχεία.
• Καταλυτικά RNAs είναι και οι ριβοδιακόπτες (Glms σε βάκιλους).

11. microRNAs•Ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση!!!
•RNA μόρια μεγέθους περίπου 22nt που προσδένονται στο mRNA και
καταστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση.
•Βιοσυντίθενται από το πρόδρομο microRNA με την βοήθεια των
ενδοριβονουκλεασών Drosha και Dicer.
•Είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του οργανισμού αλλά και στην κυτταρική
διαφοροποίηση.
•Σχετίζονται με διάφορους τύπους καρκίνου ως προς την ανίχνευση τους αλλά και
στην ύπαρξη μετάσταση τους.

12. microRNAs
• Το πρώιμο-miRNA μεταγράφεται στον πυρήνα και έχει συνήθως μεγάλο
μέγεθος, ενώ περιλαμβάνει 5’ κάλυμμα και poly-A ουρά.
• “Κόβεται” από το ένζυμο Drosha σε ένα μετάγραφο μεγέθους 70nt με
δομή φουρκέτας (pre-miRNA).
• Μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα από την Exportin 5.
• “Κόβεται” από το ένζυμο Dicer (της οικογένειας της RNase III) σε δίκλωνα
μετάγραφα μήκους 19-22nt.
• Ενώνεται με το σύμπλοκο RiSC και οδηγείται στην 3’ UTR περιοχή του
mRNA στόχου, του οποίου ρυθμίζει την έκφραση.

13. • Έχουν μέγεθος 20-25nt και
συμμετέχουν στην τεχνική της
παρεμβολής RNA (RNA interference)
αλλά και στην μεταγραφική γονιδιακή
ρύθμιση (TGS).
• Αποτελούν εργαλείο για τους
επιστήμονες ως προς την σίγηση και
την υπερέκφραση γονιδίων και
υπάρχουν πολλοί τρόποι να
εισαχθούν στο κύτταρο.
• Δίκλωνο RNA κόπτεται από την DICER
σε μικρά κομμάτια siRNAs τα οποία
ενώνονται με το RiSC και
κατευθύνονται στο mRNA στόχο.
Μικρά παρεμβαλόμενα RNAs - siRNAs

14. siRNAs
Μπορούν να δημιουργηθούν και να εισαχθούν στα κύτταρα από/με:
• Χημικές ή ενζυμικές διεργασίες.
• Από την δράση RNaseIII/Dicer σε μεγάλα dsRNAs.
• Με πλασμίδια ή ιϊκά πακέτα,επείτα από μελέτες έκφρασης in vivo.

15. Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής
έκφρασης
• Μεταγραφικοί μηχανισμοί
– Είδη ενισχυτών και RNA πολυμεράση
– Έλεγχος της μεταγραφής
– Μεταγραφικοί παράγοντες
• Μεταφραστικοί παράγοντες
– Micro RNAs (miRNAs)
• Έλεγχος μετάφρασης
• αποδόμηση mRNA
– επεμβατικά RNAs (siRNAs & RISC complexes) που αποσιωπούν γονίδια
• Επιγενετικοί μηχανισμοί
– Έλεγχος της δομής της χρωματίνης
– Τροποποιήσεις των ιστόνων (ακετυλίωση, φωσφορυλίωση κ.α.)
– Μεθυλίωση DNA

16. Η σημασία της ανακάλυψης του μηχανισμού RNA interference
• Ο μηχανισμός RNA interference προστατεύει έναντι των ιϊκών
μολύνσεων. (αποσιώπηση της έκφρασης των ιικών γονιδίων)
• Το RNAi διασφαλίζει την σταθερότητα του γονιδιώματος με το να
διατηρεί αποσιωπημένα διάφορα μεταθετά στοιχεία (transposons
elements). Με την RNAi μπορούμε να τα εξαλείψουμε ή να τα
απενεργοποιήσουμε.
• Καταστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης και ρύθμιση της ανάπτυξης των
οργανισμών.
• Διατήρηση της χρωματίνης σε συμπυκνωμένη κατάσταση και
παρεμπόδιση της μεταγραφής.
• Ο RNAi μηχανισμός αποτελεί ένα νέο πειραματικό εργαλείο για
ειδική γονιδιακή καταστολή.
• Ο RNAi μηχανισμός μπορεί να αποτελέσει μια χρήσιμη προσέγγιση
για μελλοντική γονιδιακή θεραπεία
Παρεμβολή RNA – RNA interference

17. Παρεμβολή RNA – Μηχανισμός
1) Το dsRNA μέσω της Dicer δίνει μικρά siRNA.
2) Το siRNA συνδέεται με το RISC.
3) Τα siRNA θα γίνουν μονόκλωνα με αλληλουχία συμπληρωματική προς
εκείνη του mRNA στόχου.
4) Το μονόκλωνο siRNA συνδέεται με το συμπληρωματικό mRNA και το
mRNA θα κοπεί μέσω της Slicer.

18. RNAi – TGS - PTGS
• Το σύμπλοκο RISC (RNA-induced silencing complex-RISC) που αποτελείται
από πρωτεΐνες που ανήκουν στην ομάδα Argonaute.
• Η Dicer είναι ριβονουκλεάση της ομάδας ΙΙΙ και ονομάζεται ένζυμο
διασπαστής το οποίο καταλύει τη διάσπαση μεγάλων δίκλωνων
μορίων RNA σε μικρότερα των 20-25 νουκλεοτιδίων.
• Τα siRNAs έχουν τέλεια συμπληρωματικότητα ως προς την αλληλουχία
στόχο ενώ τα miRNAs,όχι. Επίσης τα miRNAs έχουν ενδογενή «καταγωγή»
ως προς το κύτταρο ενώ τα siRNAs συνήθως εισάγονται στο κύτταρο.
• Η τεχνική RNAi θέλουμε να επεκταθεί ώστε να εφαρμόζεται σε
περισσότερα του ενός γονίδια κάθε φορά και αυτό μελετάται με τις
γονιδιακές σαρώσεις.
• Η «μεταγραφική γονιδιακή σίγηση» συνήθως αφορά την μεθυλίωση του
DNA άρα κληρονομείται.
• Η RNAi στα φυτά ονομάζεται μετα-μεταφραστική αποσιώπηση (PTGS).

19. RNAi και έλεγχος της χρωματίνης
• siRNA ή piRNAs μεθυλιώνουν τις ιστόνες
προκαλώντας σίγηση του γονιδίου
(μεθυλίωση της λυσίνης της ιστόνης
H3)
• RNA-induced transcriptional silencing
(RITS), πρωτεϊνικό σύμπλοκο που
ενώνεται με τα siRNAS και αλληλεπιδρά
με κατάλοιπα λυσίνης.

20. Εφαρμογές μεθόδου RNAi
• Καρκίνος
– Η οικογένεια miR-17-92 σε συνδυασμό με
την myc, συμβάλει στην ανάπτυξη όγκων.
Άρα miRNAs δρουν ως ογκογονίδια.
– Υποέκφραση των miRNAs οδηγεί σε
καρκινογένεση (πχ. miR-15a στην χρόνια
λεμφοκυτταρική λευχαιμία) .
– Η p53 ρυθμίζει την έκφραση τριών
miRNAs και αυτό οδηγεί σε αναστολή της
έκφρασης μιας ομάδας γονιδίων-στόχων
που φυσιολογικά υποστηρίζουν την
ανάπτυξη του όγκου.
– Παρεμβολή RNA με στόχο την
αποσιώπηση της έκφρασης της myc είχε
ως αποτέλεσμα την αναστολή της
ογκογένεσης σε ποντίκια.

21. Εφαρμογές μεθόδου RNAi
• Καρκίνος
– Όταν απορρυθμίζονται τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs τότε
δρούν ως ογκογονίδια ή ως ογκοκαταστολείς.
– Η θεραπευτική RNAi τεχνολογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί
κάνοντας εισαγωγή in vitro συντεθειμένου μικρού RNA (small
interfering RNA, siRNA).
– Συνήθως ως φορείς χρησιμοποιούνται ιοί λόγω της εξειδίκευσης
που παρουσιάζουν ως προς συγκεκριμένα κύτταρα αλλά και της
αποτελεσματικής εισόδου τους στα κύτταρα.
– Χρειάζεται να ανιχνευτούν καλύτεροι τρόποι εισαγωγής των
μορίων στα κύτταρα αλλά και τρόποι αντιμετώπισης της
ανοσοαπόκρισης του οργανισμού στο μόριο – «εισβολέα».
– Αποδοτικός σχεδιασμός του siRNA ώστε να επιτευχθεί η σύνδεση
του στο mRNA στόχο.

22. Εφαρμογές μεθόδου RNAi

23. Εφαρμογές μεθόδου RNAi
• Λοιμώδεις νόσοι
Εισαγωγή στο μολυσμένο κύτταρο dsRNA συμπληρωματικό στο mRNA
του ιού. Η μεταξύ τους σύνδεση σταματά την παραγωγή των
πρωτεϊνών που χρειάζεται ο ιός. (πχ HIV ιός)
• Νευροεκφυλιστικές διαταραχές
Οφείλονται σε γενετικές μεταλλάξεις και στόχος της παρέμβασης είναι η
καταστολή της έκφρασης των μεταλλαγμένων γονιδίων. Για παράδειγμα
στην χορεία Huntington, siRNAs καταστέλλουν την έκφραση της τοξικής
μεταλλαγμένης htt πρωτεΐνης.
• Καρδιαγγειακές νόσοι
Η αρτηριοσκλήρυνση οφείλεται στην τοπική παραγωγή κυτοκινών που
οδηγεί στην απόπτωση λείων μυϊκών κυττάρων. Παρέμβαση με siRNAs
που θα είχαν ως στόχο συγκεκριμένη αλληλουχία του mRNA θα
παρεμπόδιζε την παραγωγή των κυτοκινών.

24. Προοπτικές
• Η αποσαφήνιση του ρόλου των γονιδίων και ο έλεγχος της
λειτουργίας μπορεί να οδηγήσει στην θεραπεία σημαντικών
ασθενειών
• Με την μεθυλίωση των ιστόνων και τον έλεγχο της μορφής της
χρωματίνης μπορούμε να παρεμποδίσουμε την έκφραση μη
επιθυμητών χαρακτηριστικών.
• Με την παρεμβολή RNA μπορούμε να δημιουργήσουμε πιο
αποτελεσματικά θεραπευτικά πρωτόκολλα.
• Προκλήσεις που μένουν να αντιμετωπιστούν.
α) Η αποτελεσματική σύνθεση siRNAs και η δημιουργία
«βιβλιοθήκης» RNAi.
β) Η ενίσχυση της επιθυμητής και αποτροπή της λανθασμένης
σύνδεσης των μορίων της RNAi σε off-target αλληλουχίες.
γ) Ο έλεγχος της ανοσοαπόκρισης του οργανισμού.

25. Σας ευχαριστώ για την
προσοχή σας
Μιχάλης Ι. Σκρίμπας