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Organización de un laboratorio de
Introducción al laboratorio de microbiología de alimentos
microbiología de alimentos
Recibo de muestras
Almacén
Preparación de
medios de cultivo
Siembra
Descontaminación el
material, lavado
María Marcela Martínez Miranda esterilización y
preparación todo
M.Sc. Microbiología
excepto los medios de
Dpto. de Ingeniería de Alimentos cultivo
Universidad de Caldas
Administrativa
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Material necesario en el laboratorio de Material necesario en el laboratorio de
microbiología de alimentos microbiología de alimentos
Equipo de esterilización: • Otros instrumentos:
autoclave. – microscopio
Sistema de conducción – balanza
de gas dotado con – Centrífuga
mecheros Bunsen.
– nevera
Sistema de eliminación – peachímetro
de residuos.
– agitadores magnéticos
Estufas de aire seco. – homogenizador
Estufas y baños de agua – cuenta colonias
caliente. – equipo de filtración
Campanas de flujo – jarra de anaerobiosis
laminar
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Material necesario en el laboratorio de Toma de muestra de los diferentes alimentos:
microbiología de alimentos normas generales y protocolos
• Material menor: mecheros, cuchillos, espátulas, sacabocados, asas
de platino, pipetas de vidrio, automáticas, material de vidrio,
material de plásticos desechable, etc.
• Medios de cultivo
El muestreo de alimentos destinados al análisis
• Reactivos microbiológico es la operación que consiste en separar un
numero determinado de muestras de un lote, remesa, partida,
• Agua destilada o desionizada etc. con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. La
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
muestra tiene que ser representativa del total.
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Objetivos del muestreo Toma de muestras para microbiología
 Detectar la presencia de Debe ser representativa del lote del producto.
microorganismos patógenos.
 Evaluar el cumplimiento de
No debe sufrir daño o transformación durante el transporte y
las normas microbiológicas. almacenamiento.
 Conocer la vida útil del
producto.
Debe protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el
 Conocer el estado higiénico aire, el recipiente de muestreo, los equipos de toma de muestra o
por una incorrecta manipulación.
de la industria, ambiente,
equipos, manipuladores, etc.
 Investigar brotes alimentarios. Debería (siempre que sea posible) enviarse al laboratorio en su
Marcela Martínez M.Sc.
recipiente original, sin abrir.
Marcela Martínez M.Sc.
Toma de muestras para microbiología
La muestra debe ser identificada de manera clara y
completa.
Si el producto es voluminoso, se transfiere en condiciones
asépticas, una porción a un recipiente estéril. Información mínima necesaria para el laboratorio:
 Naturaleza del alimento.
El recipiente no debería llenarse en más de ¾ de su capacidad  Peso de la muestra.
para evitar posibles vertidos y favorecer el mezclado en el
laboratorio.  Fecha, lugar y hora del muestreo.
 Razones del muestreo.
Utensilios para el muestreo: cucharas, sacabocados, espátulas,  T del producto en el momento del muestreo.
taladros, cuchillos, pipetas, siempre estériles y escogidos de
acuerdo a la naturaleza del alimento.  T de recepción.
De esto depende la aceptación de la muestra !!!
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Transporte de la muestra Temperaturas de transporte recomendadas
Debe asegurar que se minimice la alteración en el número de
microorganismos presentes.
 Productos estables: temperatura ambiente
(por debajo de 40 ºC)
La muestra se envía al laboratorio con prontitud, manteniendo
dentro de lo posible, las condiciones de almacenamiento originales.  Productos inestables a temperatura
ambiente: entre 1 ºC y 8 ºC
Debe empaquetarse de forma que se eviten roturas o derrames.
 Productos congelados y ultracongelados:
Las muestras que necesitan refrigeración o congelación deben menos de - 15 ºC, preferiblemente menos
transportarse en contenedores aislantes, con refrigerantes o hielo de - 18ºC
seco, a fin de mantener las temperaturas de transporte
respectivas.
Referencia:
NTC 4092:2009 Microbiología de los alimentos y productos para
No debe utilizase hielo suelto para alimentación animal- Requisitos generales y directrices para
evitar contaminaciones.
Marcela Martínez M.Sc.
análisis microbiológico. Marcela Martínez M.Sc.
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Recepción de la Muestra
Si las condiciones no son satisfactorias o la muestra es
Almacenamiento de la muestra
insuficiente, el laboratorio debería rechazarla. Temperaturas de almacenamiento
Documentar las muestras admitidas de tal manera que se recomendadas (NTC 4092:2009)
garantice la trazabilidad en todas las fases:
- Identidad y codificación.
• Productos estables: temperatura ambiente
entre 18 ºC y 27 ºC
- Fecha y hora de recibo.
- Detalles del muestreo (fecha, hora y lugar). • Productos inestables a temperatura de
- Nombre y dirección del cliente. refrigeración: 3 ºC 2 ºC
- Temperatura de recepción. • Productos congelados y ultracongelados:
Examinar las muestras tan pronto sea posible: menos de - 15 ºC, preferiblemente menos
- Productos altamente perecederos (mariscos): antes de - 18ºC
de las 24 h.
- Productos perecederos: Máximo de 36 h.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS.
Se debe asegurar la separación física de las Esta operación exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como
muestras destinadas al análisis durante el la utilización de material y diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior
del alimento. Se utilizan campanas o cámaras de flujo laminar adecuadas para la
almacenamiento a fin de evitar la preparación de muestras, que suponen una gran ayuda para evitar el riesgo de
cualquier contaminación
contaminación cruzada
Reactivos y
Muestras de Medios incubados y medios de
análisis cultivos de cultivo no
3 ºC 2 ºC microorganismos inoculados Marcela Martínez M.Sc.
Marcela Martínez M.Sc.
5 ºC 3 ºC 5 ºC 3 ºC
Trituración y homogeneización de Preparación de diluciones
alimentos
Muestras sólidas
• Jarra: Consiste en un envase de Solución madre: Muestras líquidas
1/10 de alimento
vidrio o acero provisto de una hélice. en Diluyente
Solución madre:
1/10 de alimento
• Vástago: Provisto de una hélice en en Diluyente
su extremo, que se introduce en la
mezcla que se va a triturar. Necesita
un envase de vidrio o acero que se 10 ml
10 ml
adapte especialmente al vástago.
• Triturador de paletas (Stomacher), 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
que actúa golpeando rítmicamente la
mezcla de alimento y diluyente que BPW Agua de peptona tamponada
Peptona 10 g
Diluyente Agua de triptona Solución Tinger 1/4
ha sido introducida previamente en (Tryptone Water: TW) Cloruro sódico 9g Cloruro sódico 5g
Triptona 10 g Cloruro cálcico anhidro 0,42g Fosfato disódico 9g
una bolsa de plástico estéril. Cloruro sódico 5g Hidrogeno Carbonato sódico 0,20g Fosfato potásico 1,5g
Agua destilada 1.000 ml Agua destilada 1.000 ml Agua destilada 1.000 ml
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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Recuento de viables:(Método indirecto) Métodos de siembra para recuento
de viables
Consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra
sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número
de viables contando el número de colonias que se forman puesto Ventajas: sólo células viables, sencillo, sensible
que cada una de estas deriva de una UFC. Para que la medida sea
correcta desde el punto de vista estadístico, es necesario contar
Desventajas: dispersar bien los microorganismos, hay
entre 30 y 300 UFC. Marcela Martínez M.Sc. que esperar de 24 a Marcela Martínez tener resultados
48 h para M.Sc.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
Método de siembra en superficie Método de siembra en masa
RECUENTO
Agar nutritivo de recuento
RECUENTO (Plate Count Agar: PCA)
U.F.C. = C x 1/D x 1/i
Triptona 5g
Suspensión madre 1:10 TW U.F.C. = C x 1/D x 1/i Suspension madre 1:10 TW Extracto de levadura 2,50 g
C= nº colonias contadas
Dextrosa 1g
C= nº colonias contadas D= dilución
Agar 2g
10 ml D= dilución 10 ml I= inóculo
Agua destilada 1.000 ml
I= inóculo
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1 ml
0,1ml
Agar PCA
Agar PCA Incubación 31ºC, 72h
Incubación 31ºC, 72h
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Recuento
Cálculo del número de
unidades formadoras
de colonias (ufc)/ml
ufc/ml= n° de colonias (30-300) x 1/dilución x 1/vol.sembrado (ml)
Marcela Martínez M.Sc. Ej. ufc/ml= 50 x 1/10-6 x 1/0.1ml=50 x 107 = 5.0 x 108
Marcela Martínez M.Sc.
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GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (NTC-
4092)
Rangos para el recuento:
– 30-300 UFC: Aerobios mesófilos; coliformes,
recuento de bacterias termófilas, proteolíticas,
lipolíticas.
– 20-200 UFC: S. aureus, B. cereus,
Clostridium sulfito reductores etc.
– 15-150 UFC: Mohos y levaduras, levaduras
osmofílicas.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Recuento y expresión de Recuento y expresión de
resultados Recuento y expresión de resultados
resultados
1. Se calcula el promedio de colonias para cada una 4. Se redondea el resultado calculado a dos
de las diluciones a examinar multiplicando el cifras significativas. Para esto si la última cifra
resultado por el factor inverso de la dilución
respectiva. es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica;
si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior
2. Dividir el resultado obtenido de la mayor dilución
(Menos concentrada) por el resultado de la menor
se incrementa en una unidad.
dilución (más concentrada). 5. Los resultados se expresan en UFC por gramo
3. Si el cociente de esta división es mayor a 2, o mililitro de producto según la naturaleza del
reportar el resultado obtenido en la dilución más mismo, expresado como un número entre 10 y
concentrada. Pero, si el cociente es menor de 2 99 (dos cifras significativas enteras)
reportar la media aritmética de los recuentos de
las dos diluciones consecutivas. multiplicado por 10X donde x es la potencia
Marcela Martínez M.Sc. apropiada de 10. Martínez M.Sc.
Marcela
Casos especiales
• CASO 1: Cuando el número de UFC se
encuentran por debajo del rango
mínimo en ambas cajas, se informará así:
– Se descarta el recuento obtenido en la mayor
dilución y se calcula la media aritmética de
las colonias presentes en las dos cajas de la
menor dilución multiplicándose por el inverso
de la dilución y se informa el resultado como
sigue:
– Conteo estimado de UFC por gramo o
Marcela Martínez M.Sc. mililitro Marcela Martínez M.Sc.
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Casos especiales Casos especiales
• CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las • CASO 3: Crecimiento abundante, si las dos cajas
correspondientes a la primera dilución presentan
dos cajas correspondientes a la primera crecimiento mayor de 300 colonias:
dilución no presentan crecimiento se – Se divide la caja en 2, 4, 6, 8 cuadrantes
reportará como negativo y se informa el – Se cuenta el número de colonias presente en un
resultado como sigue: cuadrante y se multiplica por el total de
cuadrantes y por el inverso de la dilución.
– Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro
– Se continua el recuento como en el caso general
– < 1x10X UFC por gramo o mililitro según pero se informa el resultado como Conteo
estimado de UFC por gramo o mililitro
corresponda. C.E.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de viables en medio líquido Recuento de viables por
Número más probable (NMP) filtración con membrana
Ventajas: se puede usar en muestras diluidas, células
viables
Marcela Martínez M.Sc.
Desventajas: tarda de 24h Martínez M.Sc.
Marcela
a 48h
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“Solo una cosa vuelve a un sueño imposible:
el miedo a fracasar”
Marcela Martínez M.Sc. Paulo Coelho
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