Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí

TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOAHỌC TỰ NHIÊN
GV. TS.VoõMinh Trí
ðẠI HỌC QUỐC GIATP. HỒ CHÍ MINH
SINH HỌC PHÂN TỬ
(MOLECULAR BIOLOGY)
1
CBGD: GV.TS.VoõMinh Trí

NỘI DUNG
1. Giới thiệu
2. Cấu trúc và sự nhân bản của vật liệu di truyền
3. Biểu hiện gene
4. ðiều hòa biểu hiện gene
5. Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử
6. Enzyme dùng trong sinh học phân tử
7. Một số phương pháp trong sinh học phân tử
2

GIỚI THIỆU GV. TS.VoõMinh Trí
3
 Sinh học phân tử là gì?
 Môn học tìm hiểu những hiện tượng sinh học ở
mức ñộ phân tử: ñịnh nghĩa này khó phân
biệt sinh học phân tử với sinh hóa (biochemistry).
 Môn học nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
gen ở mức ñộ phân tử.
 Trong lịch sử, sinh học phân tử phát triển từ môn
di truyền học và sinh hóa học.
 ðiểm bắt ñầu của sinh học phân tử từ nhữngthí
nghiệm di truyền của Mendel từ giữa thế kỷ 19.
 Di truyền tính trạng
 Sinh học phân tử ra ñời vào 1944 khi thành phần
hóa học của gen ñược khám phá.

5
CẤU TRÚC VÀ SỰ NHÂN BẢN CỦA VẬTLIỆU
DI TRUYỀN
 Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào
 DNA là vật liệu di truyền
 Thành phần và cấu trúc DNA
 Cơ chế sao chép
 Cơ chế sửa sai và bảo vệ DNA

6
PHÁT HIỆN VÀ VỊ TRÍ CỦA DNA TRONG TẾBÀO
 1896 Friedrich Meischer ñã phân lập DNAtừ
tinh trùng cá và mủ từ vết thương.
 Vì phân lập từ vùng nhân (nuclei), F. Meischer
ñặt tên cho thành phần hóa học mới này là nuclein
 Tên ñược ñổi thành nucleic acid, sau ñó
là deoxyribonucleic acid (DNA)
 1914 Robert Feulgen phát hiện DNAnhuộm
màu với thuốc nhuộm fuchsin

Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào
7

Vị trí của DNA trong tế bào
8

9
DNA LÀ VẬT LIỆU DI TRUYỀN
 Thí nghiệm chứng minh hiện tượng biến nạp
ở vi khuẩn của Griffith (1928)
 Thí nghiệm chứng minh nhân tố gây biến
nạp là DNA của Avery, Loeod, và Carty
(1944)
 Thí nghiệm xác ñịnh vật liệu do phage bơm
vào vi khuẩn là DNA của Hershey và Chase (1952)

HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GrG
ifV
f.
iT
tS
h.V
)oõMinhTrí
 Streptococcus pneumoniae:
phế cầu khuẩn gây viêm phổi
 Chủng ñộc (S, smooth):
khuẩn lạc trơn, gây chết chuột
 Chủng lành (R, rough):
khuẩn lạc thô, không gây
chết chuột
10

 ðun diệt chủng ñộc,tiêm
vào chuột: chuột sống.
HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG
fV
f.
itT
hS.
)VoõMinhTrí
11
 ðun diệt chủng ñộc, trộn
với chủng lành, tiêm vào
chuột: chuột chết.
 Kết luận: tế bào chết chủng
ñộc ñã truyền tính gây bệnh
cho chủng lành.
 Biến nạp (transformation):
 Griffith: hiện tượng truyền tính
gây bệnh từ vi khuẩn ñộc sang
vi khuẩn lành.
 Sinh học phân tử hiện ñại: sự
tiếp nhận DNA trần bởi tế
bào nhận.

HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG
fV
f.
itT
hS.
)VoõMinhTrí
12

NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA (Avery, LoeodG
,V.
CTS
a.
rVo
tõ
yM
)inhTrí
13

NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA(Avery, LoG
eV
o.
dTS
,.V
Coõ
aM
rin
th
yTr
)í
14
 Huyền phù chủng ñộc ñã bị ñun chết ñược trộn
với các enzyme khác nhau trước khi trộn với chủng
lành và tiêm vào chuột:
 Xử lý với protease (thủy phân protein): chuột chết.
 Xử lý với ribonuclease (thủy phân RNA): chuột chết.
 Xử lý với endonuclease
(thủy phân DNA):
chuột sống.
 Trộn DNA từ chủng ñộc
chết với chủng lành, tiêm
vào chuột: chuột chết.
 Kết luận: DNA là vật
liệu di truyền ở hiện tượng biến nạp

VẬT LIỆU DO PHAGE BƠM VÀO VI KHUẨN LÀ DNA (Hershey, Chase)
15
 Sự xâm nhập và nhân bản
bacteriophage ở vi khuẩn
 Nuôi cấy bacteriophage

SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG
ỞV.T
VS.
IVo
KõM
Hinh
UTr
Ẩí
N
 Bacteriophage (phage,
thực khuẩn thể): vi rút
của vi khuẩn
16
 Phage T2:
 Vỏ protein bên ngoài
 DNA bên trong
 Phage T2 xâm nhiễm vi
khuẩn E. coli
 Gắn lên bề mặt vi khuẩn
 Chuyển vật chất vào vi khuẩn
 Làm tan vi khuẩn và phóng
thích các phage mới
 Protein hay DNAñược
chuyển vào E. coli?

SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG
ỞV.T
VS.
IVo
KõM
Hinh
UTr
Ẩí
N
17

THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)
 ðánh dấu protein của phage bằng 35S bằng cách
nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường
có chứa chất dinh dưỡng 35S
 Phage ñược sinh ra có protein mang 35S
19

 ðánh dấu DNA của phage bằng 32P bằng cách
nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường
có chứa chất dinh dưỡng 32P
 Phage ñược sinh ra có DNA mang32P
20

21
 Nhiễm phage ñã ñánh dấu 35S và 32P lên E. colinuôi
trong môi trường không chứa ñồng vị phóng xạ
 Tách phần gắn của phage lên bề mặt E. coli
bằng cách lắc mạnh
 Ly tâm ñể làm lắng E. coli ở ñáy ống ly tâm
 Thu E. coli ở cặn lắng (cặn ly tâm, precipitant) ñáy
ống ly tâm và thu dịch không lắng (dịch nổi,
supernatant) chứa phage

22
 Xác ñịnh hàm lượng ñồng vị phóng xạ 35S và 32P
ở phần cặn (chứa E. coli) và phần dịch nổi
(chứa phage):
 Tế bào E. coli (phần cặn) chứa 70% tổng 32P
 Dịch nổi chứa phage chiếm 80% tổng 35S
 Kết luận:
 DNA của phage ñược chuyển vào trong tế bào E. coli,
cho phép nhân bản tạo nhiều phage mới trong E. coli
 Vật chất di truyền của phage là DNA

23

THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC DNA
 Thành phần hóa học và ñặc ñiểm DNA sợiñơn
 Mô hình cấu trúc DNA mạch ñôiWatson-Crick
 ðặc tính ñối songsong
 Các cấu hình DNA
 Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào
tiền nhân (prokaryote)
 Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào
nhân thật (eukaryote)
24

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA
25

26

SỰ HÌNH THÀNH NUCLEOSIDE VÀ NUCLEOTIDE
28

CÁC DẠNG NUCLEOTIDE MONOPHOSPHATE TỪ ADENINE: AMP,cAMP
29

Các dạng deoxyribonucleotide
30

Các dạng ribonucleotide
31

PHÂN LOẠI NUCLEOTIDE VÀ NUCLEIC ACID
32

SỰ TẠO THÀNH PHÂN TỬ POLY-(RIBO)NUCLEOTIDE BẰNG LIÊN KẾT PHOSPHODIESTER
33

SỰ SẮP XẾP BASE, RIBOSE VÀ PHOSPHATE TRONGMẠCH
NUCLEICACID
 Khung: mạch ribose và liên kết phosphodiester
 ðầu chứa gốc phosphate tựdo:
ñầu 5’ phosphate (ñầu5’)
 ðầu chứa gốc hydroxyl tựdo:
ñầu 3’ hydroxyl (ñầu3’)
 Các base gắn vuông gốc với mặt phẳng ñường ribose
 Mạch nucleic acid có tính ñịnh hướng
34

LIÊN KẾT HYDROGEN GIỮA CÁC CẶP BASE PURINE-PYRIMIDINE
TRONG NUCLEIC ACID MẠCH KÉP
35

TÍNH ðỐI SONG SONG CỦA HAI MẠCH TRONG PHÂN TỬ DNA
36

MÔ HÌNH DNA KÉP CỦA WATSON-CRICK(1953)
37

CÁC CẤU HÌNH CỦA DNA TRONG TẾBÀO
 DNA tồn tại ở nhiềucấu
hình khác nhau:
 Bán kính phân tử (r)
 Khoảng cách giữa 2
nucleotide (h)
 Các cặp nucleotide/vòng
xoắn (n)
 Dạng B: trong ñiều kiện
sinh lý bình thường
 Các dạng khác (A, C,…, Z):
các ñiều kiện môi trường,
nội môi trường khác nhau
38

CÁC THÔNG SỐ ðẶC TRƯNG CỦA DNA DẠNG A, B, Z
39

KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA
40

KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ DNA
41

CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA
DNA Ở PROKARYOTE
42

CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE
43

CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE
44

CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE
45

46
CƠ CHẾ SAO CHÉP DNA
 Sao chép theo khuôn, bán bảo tồn
 Cơ chế phân tử của sự sao chép
 So sánh sao chép ở prokaryote và eukaryote

CÁC MÔ HÌNH SAO CHÉP DNA
 Sao chép (sao mã, replication)
47

THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958)
48

49

15N-15N 15N-15N 15N-15N
15N-14N
14N-14N
50

SAO CHÉP THEO KHUÔN, BÁN BẢO TG
ỒV.T
NS.VoõMinh
Trí
51

52
CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ SAO CHÉP DNA
 ðiều kiện của phản ứng tổng hợp DNA (saochép):
 Cần khuôn mạch ñơn
 Xúc tác bởi DNApolymerase
 Cần ñoạn mồi (primer): ñoạn RNA ngắn bổ sung
với khuôn
 Cơ chất: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP)
 Mạch mới ñược tổng hợp bằng cách kéo dài mồi theo
chiều 5’ -> 3’: ñầu 5’-phosphate của nucleotide mớisẽ
gắn vào ñầu 3’-OH của ñường ribose trong oligonucleotide
 Các nucleotide ñược nối với nhau bằng liên kết
phosphodiester giữa 5’-P và 3’-OH

CÁC DNA POLYMERASE Ở E. coli
53

CƠ CHẤT CỦA PHẢN ỨNG TỔNG HỢP RNA, DNA
54

KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ ->3’
55

KHUÔN, MỒI VÀ TỔNG HỢP THEO CHIỀU 5’ -> 3’
56

57
BA BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAOMÃ)
 Khởi sự (Initiation): hình thành phức hợp sao chép
(replisome) ở trình tự khởi sự sao chép ori, hình
thành khuôn mạch ñơn, hình thành chẻ ba sao chép
(replication fork), tạo primer
 Tổng hợp (kéo dài, Elongation): kéo dài primer, tổng
hợp sợi DNA theokhuôn
 Kết thúc (Termination): giải thể phức hợp replisome,
kết thúc sao mã

CÁC PROTEIN CẦN CHO QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ)
58
 DnaA: nhận diện, gắn vào ori, cảm ứng tách mạch,
cảm ứng gắn DnaB, DnaC
 DnaB: tạo phức hợp với DnaC
 DnaC: giúp gắn DnaB vào khuôn
 DnaG: primase
 SSB: gắn và ổn ñịnh DNA mạchñơn
 DNA gyrase: giải xoắn DNA
 DNA polymerase III: kéo dài primer, tạo mạch
DNAmới, có hoạt tính 3’=> 5’exonuclease ñể loại
bỏ nucleotide sai
 DNA polymerase I: thủy phân mồi RNA vàthay
bằng DNA
 DNA ligase: nối các ñoạnOkazaki

GẮN DnaA VÀO OriC VÀ HÌNH THÀNH KHUÔN MẠCH ðƠN Ở E. coli
59

KHỞI SỰ SAO CHÉP (SAO MÃ)
60

VỊ TRÍ VÀ HOẠT ðỘNG CỦA CÁC PROTEIN TRONG SAOCHÉP
61

TƯƠNG TÁC CHẶT CHẼ GIỮA CÁC DNA POLYMERASE GIỮA HAI
KHUÔN TRONG SAO CHÉP
62

TỒNG HỢP LIÊN TỤC Ở MẠCH TRƯỚC VÀ KHÔNG
LIÊN TỤC Ở MẠCH SAU
63
 Mạch trước: tổng hợp
liên tục, hướng ñi vào
ngã ba sao chép
 Mạch sau: tổng hợp
không liên tục theo
từng ñoạn Okazaki
(1000-2000bp), theo
hướng ñi ra khỏi ngã
ba sao chép
 Tốc ñộ sao chép ở
E. coli 5 x 104 nu/phút

VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU
64

VAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH SAU
65

GV. TS.VoõMinh TríVAI TRÒ CỦA DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE Ở TỔNG HỢP MẠCH
SAU
66

TỔNG HỢP THEO MỘT VÀ HAI CHẺ BA SAOCHÉP
67

SAO CHÉP VÀ PHÂN TÁCH DNA CON Ở PROKARYOTE
68

KẾT THÚC SAO CHÉP Ở E. coli
69

PHÂN TÁCH DNA CON KHI HOÀN TẤT SAO CHÉP
70

SAO CHÉP Ở EUKARYOTE
 Sao chép phức tạp
và chậm hơn so với
prokaryote
(3000nu/phút)
 Nhiều ñiểm xuất
phát sao chép
(replicon) trên
1 nhiễm sắc thể
 Cơ chế kiểm soát
sự sao chép lặp
lại trên 1 ori
71

SAO CHÉP ðỒNG THỜI TRÊN NHIIỀU REPLICON Ở
EUKARYOTE
72

CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆDNA
 Các dạng ñột biến trên DNA
 Sửa sai trong sao chép
 Sửa sai các ñột biến
 Các hệ thống bảo vệ DNA
73

74
CÁC DẠNG ðỘT BIẾN TRÊNDNA
 ðột biến do sai sót trong saochép
 ðứt mạch do cơhọc
 Thủy phân liên kết N-glycoside làm mất base
 Methyl hóa trên base dẫn ñến bắt cặp sai
 Mất nhóm amine dẫn ñến bắt cặp sai
 Chuyển dạng enol-keto, amino-imino dẫn ñến
bắt cặp sai
 Tạo dimer thymine trên cùng một mạch do tia UV

THỦY PHÂN LIÊN KẾT N-GLYCOSIDE LÀM MẤTBASE
 Xảy ra với tỷ lệ cao ñối với purine so với pyrimidine
 1/105 purine/ngày/tế bào người trong ñiều kiện
bình thường
75

MẤT NHÓMAMINE
76

CHUYỂN DẠNG ENOL-KETO, AMINO-IMINO
77

TẠO DIMER THYMINE TRÊN CÙNG MỘT MẠCH DO TIAUV
78

79
HỆ THỐNG SỬASAI DNAðẢM BẢO TÍNH ỔN ðỊNH CỦA
VẬT LIỆU DI TRUYỀN DNAQUACÁC THẾ HỆ
 Tần số sai sót của sao chép in vitro: 10-5
 Tần số sai sót của sao chép in vivo: 10-9
 Hệ thống sửa sai DNA:
 Sửa sai trong sao chép: DNA polymerase III,
DNA polymerase I
 Sửa sai do ñột biến

HỆ THỐNG SỬA SAI TRÊN DNA Ở E. coli
80

MẠCH DNA MẸ VÀCON
PHÁT HIỆN NUCLEOTIDE
SAI TRÊN MẠCH CON
81

THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE SAI BẰNG ðOẠN MỚI
82

THAY ðOẠN CHỨA NUCLEOTIDE MẤT BASEBẰNGG
ðV.
OTS.
ẠV
NoõM
Minh
ỚTr
Ií
 Vị trí apurinic
 Vị trí apyrimidinic
83

THAY BẰNG ðOẠN MỚI
84

85
HỆ THỐNG BẢO VỆ DNA
 Hệ thống sửa sai
 Hệ thống SOS
 Hệ thống giới hạn-biến ñổi

HỆ THỐNG SOS (SOS REGULATORY SYGV
S.T
TS.
EVo
MõMin
)h
Trí
86

HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI
87
(RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM
 Giúp vi khuẩn phân biệt DNA chính mình vớiDNA
ngoại lai (phage) và thủy phân DNA ngoạilai
 ðặc ñiểm:
 Nhận diện một trình tự nucleotide chuyên biệt (trình tự
nhận biết) có tính ñối ngẫu (palindrome, trình tự 5’ => 3’
của hai sợi ñồng nhất)
 Có hoạt tính methyl hóa một nucleotide trên trình tự nhận
biết: hoạt tính methylase
 Có hoạt tính cắt liên kết phosphodiester tại trình tự nhận
biết, hoặc một vị trí nhất ñịnh so với trình tự nhận biết:
hoạt tính endonuclease
 Hoạt tính endonuclease chỉ có ñối với trình tự nhận biết
không bị methyl hóa

HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI
(RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM
88

89
BIỂU HIỆN GEN: PHƯƠNG THỨC SỬ DỤNG
THÔNG TIN DI TRUYỀN TRONG TẾ BÀO
 Học thuyết trung tâm
 DNA và mã di truyền
 Phiên mã ở prokaryote
 Phiên mã ở eukaryote
 ðặc ñiểm, chức năng các sản phẩm phiên mã(RNA)
 Dịch mã
 Biến ñổi sau dịch mã

90
HỌC THUYẾT TRUNG TÂM
 Gen và tính trạng
 Nguyên tắc truyền thông tin di truyền trong tế bào
và qua các thế hệ
 Các bước trong quá trình biểu hiện của gen

SAI HỎNG CỦA GEN DẪN ðẾN CÁC SAI HỎNGGV.
ST
IS.
NVo
HõMin
HhT
Órí
A
 Bệnh niệu
alkaptonuria
(Garrod, 1908): ñột
biến lặn liên quan ñến
homogentisic acid
oxidase
 Các bệnh di truyền ñột
biến lặn khác trong chu
trình phenylalanine
91

1 GEN – 1 ENZYME
 Beadle, Tatum (1941): thí nghiệm trên mốc vàng
Neurospora crassa
 Tạo các chủng mốc ñột biến khuyết dưỡng (mất
khả năng tự tổng hợp một nhu cầu dinh dưỡng,
ví dụ 1 acid amin
 Xác ñịnh mỗi chủng ñột biến liên quan ñến 1 gen:
giả thuyết “1 gen-1 enzyme”
 Mở rộng khái niệm:
 1 gen - 1 protein
 1 gen - 1 polypeptide
 1 gen - 1 ñại phân tử sinh học
92

NGUYÊN TẮC TRUYỀN THÔNG TIN DI TGV
R.T
US.V
YoõM
Ềin
Nh
Trí
TRONG TẾ BÀO VÀ QUA CÁC THẾ HỆ
Truyền thông tin
giữa 2 thế hệ
Truyền thông tin
trong tế bào
93
Functional protein

Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV
Ớ.TS
C.VoõMinh
Trí
94
TRUYỀN THÔNG TIN
 Phiên mã (transcription):
 Chọn lựa phần thông tin di truyền cần sử dụng từ bộ gen
 Chuyển thông tin di truyền từ DNA thành RNA
 Kích thước RNA nhỏ 1/1000 lần so với DNA
 RNA kém bền do có C2’-OH, chỉ tồn tại trong một thời
gian nhất ñịnh trong tế bào
 Phương thức mã hóa thông tin không thay ñổi
 Bản chất hóa học và kiểu kiên kết hầu như không thay ñổi

Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV
Ớ.TS
C.VoõMinh
Trí
95
TRUYỀN THÔNG TIN
 Dịch mã (translation):
 Thông tin di truyền ñược dịch thành trình tự các amino
acid có bản chất hóa học và kiểu liên kết khác
 Các sản phẩm phiên mã ñược dịch mã ở mức ñộ khác nhau
 Sản phẩm dịch mã có cấu trúc và chức năng ña dạng
 Protein không bền vững và bị phân hủy sau một thời
gian nhất ñịnh
 Biến ñổi sau dịch mã (post-translational
modification)
 Giúp kiểm soát ở mức ñộ cao hơn sự biểu hiện của gen
 Thực hiện bằng những biến ñổi cộng hóa trị và
không cộng hóa trị

CHỨC NĂNG ðA DẠNG CỦAPROTEGV
I.T
NS.VoõMinh Trí
96

DÒNG THÔNG TIN Ở TẾ BÀO PROKARYOTE VÀ EGV
U.T
KS.
AVo
RõM
Yinh
OTr
Tí
E
 Prokaryote: DNA=>RNA=>protein=>functional protein
 Eukaryote: DNA=>pre-mRNA=>RNA=>protein=>functional protein
97

MÃ DI TRUYỀN (CODON)
98

GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE
 Là phản ứng sinh tổng hợp
RNA trong tế bào từ DNA
khuôn.
 ðiều kiện của phiên mã in vivo:
 RNA polymerase có hoạt tính
(tạo liên kết phosphodiester
giữa các rNTP dựa theo khuôn
DNA mạch ñơn)
99
 Có ñủ rNTP (rATP, rGTP,
rCTP, rUTP)
 Gen ñược mở
 Sự phiên mã ñược thực hiện
theo từng ñơn vị phiên mã
 Sự tổng hợp RNAluôn
theo chiều 5’ =>3’.

ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV.TS.VoõMinh Trí
 ðơn vị phiênmã:
 Promoter: trình DNA nơi RNA polymerase gắn vào
 Trình tự mang mã: gồm trình tự các bộ ba mã hóa
(codon) bắt ñầu bằng ATG và kết thúc bằng bộ ba kết thúc
 Terminator: trình tự mã hóa cấu trúc kết thúc phiên mã
 RNA polymerase gắn với promoter thôngqua
nhân tố sigma
100

101
PROMOTER VÀ SỰ NHẬN DIỆN BỞI SIGGVM.TS.AVoõMinh Trí
 Promoter: vùng chứa trình tự bảo tồn ở các nucleotide -10
(TATAAT) và -35 (TTGACA) so với ñiểm bắt ñầu +1.
 Nhân tố sigma nhận diện và gắn với promoter tại
vùng -10 và -35.
 Sigma gắn với promoter
ở cả hai mạch, mạch xuôi
5’ => 3’chứa trình tự
bảo tồn ñược nhận diện
là mạch mang mã,
mạch ñối diện là mạch
khuôn dùng ñể tổng
hợp RNA.
 Trình tự ribonucleotide
của RNA tương tự với
trình tự nucleotide
của mạch mang mã.

CÁC SỰ KIỆN TRONG KHỞI SỰ PHIÊN MGVÃ.TS.VoõMinh
Trí
102

BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KÉGOV.TDS.VÀoõMIinhTrí
103

BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí
104

BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí
105

PHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠN VỊ PHIÊN MÃ
Maïch DNAkhuoân
Maïch DNA mang maõ
106

GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ THEO
CÁC ðƠN VỊ
PHIÊN MÃ
107

SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE
 Prokaryote:
 Một loại RNA polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA
108
 mRNA thường chứa nhiều ORF (nhiều gene, polycistron)
 Eukaryote:
 Vùng mang mã di truyền của gene (exon) bị gián ñoạn
bởi các ñoạn không mang mã (intron)
 mRNA ñược tổng hợp qua hai bước: tiền mRNA
(pre mRNA) và mRNA trưởng thành (mature mRNA)
 Pre mRNA có chứa chóp 7-methyl-guanosine ở ñầu 5’và
chứa ñuôi polyA (100-200 adenine) ở ñầu 3’
 Pre mRNA ñược chế biến (splicing) ñể loại bỏ intron và
nối các exon lại trước khi ñi vào tế bào chất
 mRNA trưởng thành trong tế bào chất chứa thông tin
liên tục

SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE
 Eukaryote:
 mRNA chỉ chứa 1 ORF
(một gen, monocistron)
 RNA polymerase I và III:
tổng hợp rRNA, tRNA và các
RNA nhỏ khác
109
 RNA polymerase II: tổng hợp
mRNA

PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE
110

GẮN CHÓP 5’, ðUÔI POLYAVÀ SPLICING TRONG PHIÊNMÃ
Ở EUKARYOTE
111

CÁC VÙNG CHỨC NĂNG VÀ ðỘ BỀN CỦAGmV.TRS.NVoAõMinhTrí
 Các vùng chức năng:
 5’-UTR (untranslated region): vùng 5’ không dịchmã
 Vùng dịch mã: một hay nhiều khung dịch
mã (ORF, open reading frame)
 3’-UTR: vùng 3’ không dịchmã
 Terminator: cấu trúc kết thúc
 ðộ bềnmRNA:
Phụ thuộc vào cấu trúc bậc cao ở ñầu 5’và 3’, mũ 5’và ñuôi polyA
mRNA của prokaryote có cấu trúc ñơn giản, thờigian
bán phân ngắn (phút)
mRNA của eukaryote có thời gian bán phân dài (30 phút – 24giờ)
Vùng 5’không
dịch mã
112
Vùng dịch mã, ORF Vùng 3’không
dịch mã

ðƠN VỊ PHIÊN MÃ CỦA OPERON RNA ỞPROGKV.ATSR.VYoõOMinThETrí
113

RNA RIBOSOME (rRNA)
114

CẤU TRÚC BẬC 2 CỦA rRNA
115

RNA VẬN CHUYỂN (tRNA)
116

SỰ GẮN CHUYÊN BIỆT AMINO ACID LÊN tRNATƯGV
Ờ.T
NS.
GVoõM
Ứin
Nh
GTrí
 Liên kết ester hình thành giữa 3’-OH của tRNA
và –COOH của amino acid tương ứng nhờ sự xúc
tác của aminoacyl-tRNA synthetase tương ứng
117

MÔ HÌNH PHÂN TỬ MINH HỌA TÍNH CHUYÊN BG
IV
Ệ.T
TS.V
Goõ
IM
Ữin
AhTrí
ENZYME, AMINO ACID VÀtRNA
118

DỊCH MÃ
119
 Là quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào
trên khuôn mRNA và ribosome.
 ðiều kiện của dịch mã in vivo:
 Có ñủ amino acid và aminoacyl-tRNA (tRNAgắn
amino acid)
 Có ñủ các nhân tố dịch mã
 Ribosome hoạt ñộng và mRNA
 Sự dịch mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị là ORF
 Sự dịch mã luôn theo chiều 5’ => 3’ của mRNA,
ñầu 5’ tương ứng với -NH2 (ñầu N), ñầu 3’ tương
ứng với -COOH (ñầu C) của polypeptide

DỊCH MÃ TRÊN POLYSOME
ðỒNG THỜI VỚI PHIÊN MÃ
Ở PROKARYOTE
120

BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KHỞI SỰ
121
 Gồm các sự kiện lắp ghép có trực tự
của mRNA, các tiểu phần ribosome,
tRNA-fMet tại codon khởi sự trước
khi hình thành một liên kết peptide
 Ribosome hoàn chỉnh có ba vị trí:
 A: nơi tiếp nhận tRNA gắn amino acid
 P: nơi tiếp nhận tRNA-fMet và
nơi chứa tRNA-peptide
 E: vị trí thoát của tRNA
 ðược kiểm soát bởi các nhân tốkhởi
sự dịch mã IF (Initiation factor)

TƯƠNG TÁC GIỮA 16S rRNA VÀ TRÌNH TGV
Ự.TS.
SVo
HõM
Iin
NhT
Erí
- DALGARNO Ở ðẦU 5’CỦA mRNA
122

BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG
DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
 Các nhân tố kéo dài dịch mã EF (elongation factor)
giúp ñưa tRNA mang amino acid vào vị trí A và
cảm ứng sự xúc tác hình thành liên kết peptide
123

DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
 Ribosome di chuyển 1 bộ ba
theo chiều 5’ => 3’của mRNA
 Vị trí của các tRNAtrên
ribosome thay ñổi
 Năng lượng ñược
cung cấp từ sự thủy
phân GTP
124

DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
125

HÌNH THÀNH LIÊN KẾT PEPTIDE VÀ SGV
Ự.TS
D.Vo
ỊõM
Cin
Hh
Trí
CHUYỂN CỦA RIBOSOME TRONG DỊCH MÃ
126

127
BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KẾT TG
HV.T
ÚS.
CVoõMinhTrí
 Vị trí A củaribosome
gặp codon kết thúc
 Nhân tố kết thúc
dịch mã RF
(releasing factor)
gắn vào
 Thủy phân liên kết
ester giữa peptide
và tRNA
 Hai tiểu phần
ribosome tách ly
và rời khuôn
mRNA

BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ (POST-TRANSLATIONALMODG
IV
F.T
IS
C.V
Ao
TõM
Ii
Onh
NTr
)í
 Biến ñổi cộng hóa trị: gắn thêm ñường, phosphate,
methyl…
 Biến ñổi không cộng hóa trị:
 Gắn với một hợp chất phân tử lượng nhỏ (tác nhân biến cấu)
 Gắn với một protein khác
 Tương tác với chaperon phân tử
128

 ðột biếnñiểm:
ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõMHinÌhNTrHí
 Thêm hoặc mất một nu: làm lệch khung dịch mã
 Thay thế nu này bằng nu khác: ñột biến lệch nghĩa
(mis-sense), ñột biến trung tính (neutral) hay lặn (silent),
ñột biến mất nghĩa (non-sense)
 Hồi biến (reverse mutation): ñột biến ñiểm trở lại nu ban ñầu
 ðột biến mất ñoạn, thêm ñoạn, ñảo ñoạn, chuyểnvị:
làm bất hoạt gen và mất khung dịch mã
 Tần số ñột biến tự nhiên:
 ðột biến trong sao chép: 10-4-10-8/thế hệ
 ðột biến mất nghĩa: 10-6-10-8/thế hệ
 Chuyển vị gene: 10-4/thế hệ
 Tác nhân gây ñột biến: tia xạ, hóa chất, sinh học…129

ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõ
MHinÌhNTrHí
130

ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VÀG
KV.
IT
ỂS.
UVo
HõM
Ìin
Nh
HTrí
131

ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦAGENE
VÀ SỰ PHÁT TRIỂN
132
 Hiện tượng ñiều hòa biểu hiện của gene
 ðặc ñiểm cơ bản của sự ñiều hòa biểu hiệncủa
gene ở prokaryote và eukaryote
 Các mức ñiều hòa sự biểu hiện của gene
 Kiểm soát dương và kiểm soát âm ở prokaryote
 Cấu trúc protein ñiều hòa
 ðặc ñiểm kiểm soát phiên mã của gene ởeukaryote
 ðiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóavà
phát triển

133
HIỆN TƯỢNG ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CGV
Ủ.TS
A.Vo
Gõ
M
Einh
NTrí
E
 ðáp ứng thích nghi của tế bào, cá thể về hìnhthái,
sinh lý, sinh hóa… ñối với sự thay ñổi của
môi trường
 Sự biểu hiện nối tiếp, có chương trình của các
gene ở vi sinh vật
 Sự biệt hóa thành nhiều tế bào có chức năng khác
nhau trong cơ thể ña bào bậc cao

ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞPROG
KV.
ATS.
RVo
YõMi
OnhT
Trí
E
 Sự biểu hiện
của gene ñáp
ứng theo thay
ñổi của môi
trường
 Hầu như không
có biệt hóa
134

ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞEUKGV
A.T
RS.V
Yoõ
M
Oinh
TT
Erí
 Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn và có sự biệt hóa
135

136
CÁC MỨC ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦGV
A.TS
G.Vo
Eõ
M
Ninh
ETrí
 Mức DNA:
 Thay ñổi cấu trúc bậc cao
 ðột biến, sắp xếp lại DNA
 Mức phiên mã: tăng cường hay ức chế phiên
mã tạo mRNA
 Mức dịch mã:
 Tính ổn ñịnh và cấu trúc mRNA
 Hiệu quả tổng hợp protein
 Mức sau dịch mã:
 Hình thành cấu hình tự nhiên
 Chức năng và hoạt tính protein

ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE MÃHÓA
ENZYME Ở MỨC PHIÊN MÃ, DỊCH MÃ VÀ
SAU DỊCH MÃ
137

ðIỀU HÒA SỰ TỔNG HỢP ENZYMEVÀGV.
HTS
O.Vo
ẠõMi
TnhTrí
TÍNH ENZYME
138

BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ BẰNG CƠ CHẾ BIẾN CẤU
(BIẾN ðỔI LẬPTHỂ)
139

140
ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV:.TKS.VIoỂõMMinh
Trí SOÁT ÂM (NEGATIVE CONTROL)
 Liên quan tới repressor và operator
 Khi repressor gắn vào operator => không tạo mRNA
 Repressor ñược ñiều hòa sau dịch mã => trạng thái
có hoạt tính và không có hoạt tính:
 Repressor ñược hoạt hóa bởi Effector và gắn vào
operator: sự biểu hiện của trp operon bị ức chế (repression)
bởi tryptophane
 Repressor bị bất hoạt không gắn vào operator: sự biểu hiện
của lac operon ñược cảm ứng (induction) bằng lactose

XÚC TÁC SỰ THỦY PHÂN
LACTOSE BỞI
-GALACTOSIDASE
141

KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON LGV
A.T
CS.
TVo
OõM
Sin
Eh
Trí
142

KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON TRG
YV.
PTS
T. V
Ooõ
PMi
Hnh
ATr
Ní
E
143

144
ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ: KIỂM SOÁTDƯƠNG
(POSITIVE CONTROL)
 Liên quan tới activator và activator-binding site
(hoặc enhancer)
 Activator gắn vào enhancer => tăng cường
tạo mRNA
 Activator ñược ñiều hòa sau dịch mã: trạng thái
có hoạt tính và không có hoạt tính
 Activator ñược hoạt hóa bởi effector (cAMP)
ñể gắn vào activator-binding site: trường hợp
lac operon, mal operon

ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lac OPEROG
NV.TS.VoõMinhTrí
145

ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lacOG
PV.
ETS.
RVo
OõMi
Nnh
Trí
146

ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở malOGV
P.T
ES.
RVoõ
OMin
Nh
Trí
147

VAI TRÒ CỦA ACTIVATOR TRONG KIỂM SOÁTGV
D.TS
Ư.V
ƠoõM
Nin
Gh
Trí
148

TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID
 Tương tác không chuyên biệt: histone-DNA
 Tương tác chuyên biệt: protein là dimer, mỗi
monomer gắn vào một trình tự xác ñịnh trên một
sợi DNA
 ðặc ñiểm của trình tự gắn protein: lặp lạiñảo
ngược (trên một mạch)
149

TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID
150

151
ðẶC ðIỂM CẤU TRÚC CỦA DNA-BINDINGPROTEIN
 Cấu trúc bậc 2 (xoắn -helix), phần ổn ñịnh cấu
hình và phần chứa trình tự nhận diện (nơi gắn)
 Xoắn-gập-xoắn (Helix-turn-helix motif)
 Ngón tay gắn kẽm (zinc finger)
 Dây kéo leucine (leucine zipper)

MỘT SỐ CẤU TRÚC DNA BINDING PROTEIN
152

153
ðẶC ðIỂM ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE
 Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn
 Promoter bao gồm: TATAbox và UPE (upstream
element)
 Hầu hết các gene ñược ñiều hòa bởi ñồng thời nhiều
trình tự ñiều hòa
 ðiều hóa theo cơ chế kiểm soát dương bởi activator
và các enhancer nằm cách xa về phía thượng lưu
hoặc hạ lưu của promoter
 ðiều hòa theo cơ chế kiểm soát âm bởirepressor
và trình tự ñiều hòa (repressor-binding site)

PROMOTER Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE
154

ENHANCER VÀ KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở EUKARYOTE
155

157
ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE TRONGQUÁ
TRÌNH BIỆT HÓA VÀ PHÁTTRIỂN
 Các tế bào khác nhau ở cơ thể ña bào ñều có lượng
DNA như nhau và có khả năng bắt cặp bổ sung
với nhau
 Các tế bào biệt hóa khác nhau có hàm lượng, chủng
loại mRNA và protein khác nhau
 Các gene ñược biểu hiện theo chương trình thời gian
 Phiên mã là cơ chế chủ yếu của sự ñiều hòa biểu
hiện của gene trong biệt hóa và phát triển

158
MỘT SỐ ENZYME CƠ BẢN DÙNG TRG
OV.
NTS
G.VoõMinhTrí
SINH HỌC PHÂN TỬ
 DNApolymerase:
 Taq polymerase
 Pfu polymerase
 Enzyme cắt hạn chế:
 Enzyme cắt ñầu dính
 Enzyme cắt ñầu bằng
 Enzyme nối DNA:
 T4 DNAligase

Taq polymerase
 DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng
thích hợp ở 70-80oC
 Chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở
suối nước nóng
 Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng
1000-1500nu/phút
 ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro
 Taq polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH
của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo
mạch khuôn
159

Taq polymerase
160
 Taq polymerase sẽ gắn thêm một nucleotide adenine
(A), làm cho mạch mới tổng hợp sẽ dư một Aso
với mạch khuôn (75% sản phẩm PCR)
 ðộ chính xác không cao (10-4errors/bp)
 Phản ứng ñược xúc tác bởi Taq polymerase phải có
ñầy ñủ các thành phần sau:
 Mạch DNA ñơn làm khuôn
 Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải
bổ sung với mạch DNAkhuôn
 dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP
 Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp
ñể duy trì hoạt tính của Taq polymerase

Taq polymerase
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’
3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’
3’-TGATCGAT-5’
5’-ATCGGC-3’
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’
3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’
3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’
161

162
Pfu polymerase
 Là DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng
thích hợp ở 70-80oC
 Chiết tách từ vi khuẩn cổ Pyrococcus furiosus sốngở
suối nước nóng (nhiệt ñộ thích hợp 100oC )
 Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng
500-1000nu/phút
 ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro
 Pfu polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH
của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo
mạch khuôn

163
Pfu polymerase
 Pfu polymerase không gắn nucleotide vào ñầu 3’OH
 ðộ chính xác cao (10-6 errors/bp)
 Phản ứng ñược xúc tác bởi Pfu polymerase phải có
ñầy ñủ các thành phần sau (cũng tương tự
Taq polymerase):
 Mạch DNA ñơn làm khuôn
 Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải
bổ sung với mạch DNAkhuôn
 dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP
 Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp
ñể duy trì hoạt tính của Pfu polymerase

Pfu polymerase
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
3’-TGATCGAT-5’
5’-ATCGGC-3’
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
164

Enzyme cắt hạn chế
 Là enzyme của vi khuẩn dùng ñể cắt DNAcủa
bacteriophage (phage) xâm nhiễm vi khuẩn,
nhờ ñó bảo vệ vi khuẩn khỏi bị phage tiêu diệt
 Thủy phân liên kết phosphodiester trên sợi
DNA tại vị trí chuyên biệt sẽ giải phóng sợi
DNA có ñầu 5’P và 3’OH
 Có nhiều loại enzyme cắt hạn chế
 Sau khi cắt sản phẩm DNAcó
thể ñầu dính hay ñầu bằng
 Tên gọi của enzyme cắt hạn chế ñược gọi theo tên
viết tắt của loài vi sinh vật ñầu tiên có enzyme cắt
giới hạn ñó
165

GV. TS.VoõMinh TríCác loại enzyme cắt hạn chế
166

167
Tên gọi của enzyme cắt hạn chế
HindIII: Haemophilus influenzae serotype d
EcoRI: Escherichia coli RY13
BglII: Bacillus globigii

Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế
 Trình tự ñối ngẫu: ñối xứng qua một trục
 Cắt ñầu dính:
5’-G-3’OH
3’-CTTAA-5’P
5’P-AATTC-3’
3’OH-G-5’
5’-A-3’OH
3’-TTCGA-5’P
5’P-AGCTT-3’
3’OH-A-5’
168

Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế
 Cắt ñầu bằng:
169
5’-CCC-3’OH
3’-GGG-5’P
5’P-GGG-3’
3’OH-CCC-5’
5’-AGG-3’OH
3’-TCC-5’P
5’P-CCT-3’
3’OH-GGA-5’

170
T4 DNAligase
 ðược tìm thấy và chiết tách từ bacteriophageT4
 Xúc tác sự hình thành phosphodiester giữa 3’OH
của chuỗi DNA này với ñầu 5’P của một chuỗi
DNAkhác
 T4 DNA ligase có thể nối DNAsợi ñôi hoặc DNA
sợi ñơn/RNA ñể tạo thành một phântử
 Trong trường hợp DNA sợi ñôi, các ñoạnDNA
ñã xử lý với enzyme cắt hạn chế thì T4 DNAligase
chỉ có thể nối các ñoạn DNA cắt cùng loạienzyme

T4 DNA ligase
171

Phân tử DNA 1 ñã xử lý vớiEcoRI
5’-ATATATACCGGAG-3’OH
3’-TATATATGGCCTCTTAA-5’P
Phân tử DNA 2 ñã xử lý vớiEcoRI
5’P-AATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
3’OH-GAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
T4 DNAligase
5’P3’OH
3’OH5’P
5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
- - - - - -
3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
Liên kết hydro ñược tạo thành giữa
các base nitơ bắt cặp bổ sung
5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
- - - - - -
3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
T4 DNA ligase sẽ xúc táchình
thành liên kết phosphodiester
ở cả hai mạch tạo thành 1 phân tử DNA
172

MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠG
NV.T
GS.V
PoõM
Hin
Áh
Tr
Pí
DÙNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ
 Pipetman, eppendorf
 Máy ly tâm, phương pháp ly tâm
 ðiện di và phát hiện nucleic acid
 Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
 Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleic acid
 Biến tính DNA
 Lai DNA
 Giải trình tự DNA
 Tách chiết DNA bộ gene và plasmid
 Thu nhận ñoạn DNA, gene
173

Pipetman
Hút chính xác vi dung tích (µl)
174

Eppendorf
 Chứa mẫu với dung tích nhỏ (0,5µ l –2ml)
 Ống ly tâm
 Ống thực hiện phản ứng PCR
175

Phương pháp ly tâm
 Phân tách các thành phần rắn trong huyền phù dựa vào
trong lượng phân tử dưới tác dụng của lực ly tâm
F = mω2r
RCF = (1.119 x 10-5)(rpm)2(r)
176

ðiện di DNA
 Phân tách các ñoạn DNA
có kích thước phân tử
khác nhau dưới tác dụng
của ñiện trường
 Mẫu di chuyển từ cực âm
sang cực dương
 Bộ nguồn: cung cấp
dòng ñiện
 Bồn ñiện di: nơi chứa dung dịch ñiện di, giá thể ñiện di
(agarose gel), nơi xảy ra quá trình di chuyển của
các ñoạn DNA
177

ðiện di DNA
Cách tiến hành:
 Chuẩn bị giá thể ñiện di (agarose gel): ñun chảy agarose
gel, chờ nguội, ñổ vào khuôn ñã gắn lược tạo giếng, chờ
agarose gel ñông
 Tháo lược ra khỏi agarose gel, lắp vào bồn ñiện di,
thêm dung dịch diện di vượt qua mặt gel
178

ðiện di DNA
Cách tiến hành:
 Chuẩn bị mẫu ñiện di: mẫu DNA
ñược trộn với dung dịch nạp mẫu
 Chứa glycerol hoặc succrose: ngăn
không cho mẫu DNA thoát ra khỏi giếng
 Chứa phẩm màu: nhận biết mẫu ñiện di
ñã di chuyển tới ñâu trong giá thể ñiện di
 Mỗi mẫu DNA ñược nạp ở mỗi
179
giếng khác nhau
 Giếng ñầu tiên ñược nạp với
thang DNA
 Chứa các ñoạn DNA ñã biết
trước kích thước
 ðậy nắp bồn ñiện di, bật nguồn ñể cung cấp dòng ñiện,
quan sát sự di chuyển của vạch màu, tắt nguồn khi vạch
màu di chuyển tới một vị trí thích hợp

ðiện di DNA
1.0 kb
Cách tiến hành:
 Ngâm gel vào dung dịch chứa ethidium bromide
 Ethidium bromide có ái lực mạnh với nucleic acid và xen giữa hai
base nitơ, phát sáng khi kích thích bằng tia UV, vì vậy trên gel
agarose nơi có DNA thì ethidium bromide sẽ gắn vào vàphát
ra vạch sáng
 Xem kết quả trên hộp ñèn UV, chụp hình
1 2 3 4 5
1176 bp
0.5 kb
2148 bp
3.5 kb
3.0 kb
2.5 kb
180

181
Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG
iV
c.TS
a.V
co
iõM
dinhTrí
 Xác ñịnh nồng ñộ của dung dịch nucleic acid:
 Dựa vào sự hấp thu của nucleic acid ở bước sóng 260nm
 ðối với dung dịch DNA mạch ñôi: 1 ñơn vịOD260nm
tương ứng 50µg/ml
 ðối với dung dịch DNA mạch ñơn hoặc RNA: 1 ñơnvị
OD260nm tương ứng 40µg/ml
 Xác ñịnh ñộ sạch của mẫu nucleic acid:
 Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm
 OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 => mẫu nucleic acid sạch
protein

Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG
iV
c.TS
a.V
co
iõM
dinhTrí
182

Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
 PCR (Polymerase Chain Reaction): là phản ứng nhân bản
in vitro DNA dưới xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt
 Gồm 3 bước:
Biến tính DNA: phản ứng PCR
ñược nâng nhiệt ñộ tới khoảng
95oC ñể hai mạch của phân tử
DNA tách rời nhau ra. Hai
mạch này ñược sử dụng làm
khuôn
 Bắt cặp: Phản ứng PCR
ñược hạ nhiệt ñộ xuống
trong khoảng 50-65oC ñể
mạch khuôn và mồi bắt cặp
với nhau. Nhiệt ñộ bắt cặp
tùy thuộc vào ñặc tính của
mồi
183

Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
 Kéo dài: Phản ứng PCR
ñược nâng lên nhiệt ñộ thích
hợp
cho DNA polymerase chịu nhiệt
hoạt ñộng khoảng 72oC ñể kéo
dài mồi theo chiều 5’=> 3’bằng
cách thêm nucleotide vào ñầu
3’OH và dựa vào mạch bổ sung
 Ba bước này tạo thành một
chu kỳ trong phản ứng PCR.
Mỗi phản ứng PCR thường
lặp lại khoảng 30 – 35 chu kỳ
 Khuếch ñại số lượng bản sao ñoạn DNA lên 106 lần
184

Biến tính DNA
 Liên kết hydrogen giữa hai mạch
bổ sung có thể bị cắt ñứt khi xử lý
với tác nhân hóa học-vật lý, giúp
hai mạch tách rời nhau
 Tm: nhiệt ñộ cần thiết ñể mạch
ñôi của phân tử DNA tách thành
mạch ñơn
 Hai mạch DNA ñã tách có thể
tái bắt cặp bổ sung ñể trở về
dạng ban ñầu (phân tử DNA
mạch ñôi) khi dung dịch ñược
hạ nhiệt ñộ từ từ
185

Lai DNA (DNAhybridization)
 Phương pháp lai Southern
 Giúp phát hiện trình tự
chuyên biệt trên một
ñoạn DNA
 Dựa vào sự bắt cặp bổ
sung giữa trình tự cần xác
ñịnh và mẫu dò (probe)
 Probe: oligonucleotide
với trình tự ñã biết và
ñược ñánh dấu bằng ñồng
vị phóng xa, chất phát
huỳnh quang, một chất
có khả năng tạo màu
186

Lai DNA (DNAhybridization)
187

188
Giải trình tự DNA
Dùng phương pháp
Sanger với
dideoxyribonucleotide
(ddNTP) ñánh dấu
 Trình tự DNA ñược
ñọc dựa trên tổng hợp
các sợi bổ sung bằng
DNA polymerase bị
gián ñoạn bởi một
ddNTP nhất ñịnh ñược
ñánh dấu
 Tách các ñoạn DNA
bằng ñiện di trên
polyacrylamide gel
 ðọc trìnhtự

Giải trình tự DNA
189

Thu nhận DNA bộ gene và plasmid
 Tách chiết DNA bộ gene, plasmid từ tế bào
 Phân tích bằng ñiện di
 Kiểm tra ñộ sạch, nồng ñộ
190

Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (14)

Similar to Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí

Similar to Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí (20)

More from Tài liệu sinh học

More from Tài liệu sinh học (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí