Thực tập tốt nghiệp Tu Du Hospital

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 1
LẠI ĐÌNH BIÊN
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………...3
CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………………6
LỜI MỞ ÐẦU…………………………………………………………………………7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………..8
1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ………………….8
1.2.Tổng quan về các phương pháp…………………………………………………...11
1.2.1.Karyotype……………………………………………………………………….11
1.2.2.Sinh học phân tử………………………………………………………………...14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………………...22
2.1. Karyotype.………………………………………………………………………..22
2.1.1.Vật liệu………………………………………………………………………….22
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………………………..22
2.1.3.Hóa chất…………………………………………………………………………22
2.1.4.Quy trình………………………………………………………………………...22
2.2.Sinh học phân tử…………………………………………………………………29
2.2.1.QF-PCR………………………………………………………………………...29
2.2.2.FISH……………………………………………………………………………32
2.2.3.Real time PCR…………………………………………………………………35

LẠI ĐÌNH BIÊN
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN………………………………………38
3.1. Karyotype………………………………………………………………………...38
3.2.Sinh học phân tử…………………………………………………………………..40
3.2.1. QF PCR………………………………………………………………………...40
3.2.2. FISH……………………………………………………………………………43
3.2.3.Realtime PCR chẩn đoán HPV………………………………………………….44
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN…………………………………………………………...46
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………...47

LẠI ĐÌNH BIÊN
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Các giai đoạn của 1 phản ứng PCR……………………………………17
Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ
đường nền……………………………………………………………………………..20
Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner,
Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy
13)……………………………………………………………………………………..23
Hình 4. Lấy máu ngoại vi ở người lớn………………………………………….24
Hình 5. Lấy máu ngoại vi ở trẻ…………………………………………………24
Hình 6. Cấy máu………………………………………………………………...25
Hình 7. Dung dịch Demecolcine………………………………………………..26
Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phút………………………………………….26
Hình 9. Nhỏ KCl vào mẫu trong ống ly tâm………………………………….....26
Hình 10. Nhỏ axit acetic vào mẫu đã được ly tâm………………………………27
Hình 11. Sau khi cho dung dịch carnoy vào lần 2………………………………27
Hình 12. Dung dịch có màu trắng khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3…………….27
Hình 13. Nhỏ lame (kiểu nhỏ ngang)…………………………………………...28
Hình 14. Nhỏ lame cao (kiểu nhỏ cao)………………………………………….28
Hình 15. Nhuộm lame bằng Giemsa: buffer…………………………………….28
Hình 16. Quan sát NST dưới kính hiển vi………………………………………29
Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối…………….31

LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 18. Mẫu được lắc ủ 990C 800rpm trong 10 phút………………………….31
Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc………………………………….31
Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6………………………………….....31
Hình 21. Máy PCR………………………………………………………..…….32
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm…………………………………………...33
Hình 23. Cho vào máy lai PCR…………………………………………………35
Hình 24. Gỡ keo sau lai…………………………………………………………35
Hình 25. Đánh mã số cho mẫu…………………………………………………..36
Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2……………………….37
Hình 27. Máy trích ly DNA tự động…………………………………………….38
Hình 28. Nhỏ mẫu vào Plate………………………………………………….....38
Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW1…………………………………...38
Hình 30. Kết quả NST trên màn hình vi tính chưa sắp xếp…………………….39
Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp………………….39
Hình 32. Kết quả NST in trên giấy……………………………………………...40
Hình 33. Kết quả Trisomy XXX………………………………………………...41
Hình 34. Kết quả bị hội chứng Turner…………………………………………..41
Hình 35. Kết quả bị hội chứng Klinefelte……………………………………....41
Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)……………………....……….42
Hình 37. Kết quả Trisomy 13 (hội chứng Patau)……………………………....42
Hình 38. Kết quả Trisomy 18 (hội chứng Edward)…………………………....42

LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST 13 bình thường……………….………43
Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội chứng down….………………………….43
Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST 18 bình thường…….………………..43
Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST 18 bình thường………….…………..43
Hình 43. Kết quả âm tính………………………………………………….…….45
Hình 44. Kết quả dương tính…………………………………………................45

LẠI ĐÌNH BIÊN
CHỮ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT NỘI DUNG
NST Nhiễm sắc thể

LẠI ĐÌNH BIÊN
LỜI MỞ ÐẦU
Trong sự phát triển của mỗi quốc gia hiện nay, ngành Y nắm một vai trò vô cùng
quan trọng. Không những đóng góp to lớn cho nền kinh tế mà ngành Y còn góp phần
củng cố mặt đời sống nhân sinh cho quốc gia đó. Với một quốc gia khỏe mạnh về thể
chất người lao động, quốc gia đó mới có chỗ dựa vững chắc để phát triển mạnh mẽ nền
kinh tế của mình.
Cùng với sự tiến triển của khoa học, bệnh di truyền ngày càng được mọi người
chú ý. Theo thống kê của nhi khoa, gần 20 năm nay, tỉ lệ trẻ em chết vì bệnh di truyền
đã giảm mạnh, cò tỉ lệ trẻ phát bệnh và tỷ lệ tử vong do dị tật bẩm sinh và bệnh di
truyền dần dần tăng cao.
Trong quá trình phát triển tự nhiên của nhân loại, do ảnh hưởng của các nhân tố,
làm cho chất di truyền trong cơ thể biến đổi. Trong những biến đổi này có một loại
biến đổi về con số và kết cấu của nhiễm sắc thể nhân tế bào được gọi là dị dạng nhiễm
sắc thể, một loại khác là đột biến gen. Vì vậy tất cả bệnh do nhiễm sắc thể và gen trong
nhân tế bào biến dạng gây cản trở cho sự thay thế, gây ra sự thiếu hụt dung môi có liên
quan dẫn đến cơ thể di truyền sang đời sau, tạo nên sự hỗn hợp về sinh lý nhân thể, cơ
năng sinh hóa, gây cản trở quá trình thay thế, loại bệnh này uy hiếp sức khỏe của con
người. Vì thế việc xét nghiệm sớm trước sinh là việc rất quan trọng nhằm ngăn chặn
việc sinh con bị tật gây nên gánh nặng cho gia đình và xã hội.
Với nội dụng thực tập tốt nghiệp: “một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các
bệnh” tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM. Chúng em đã
hiểu rõ hơn các kỹ thuật xét nghiệm một số bệnh và quan trọng hơn là đã trải nghiệm
thực tế nâng cao tay nghề hơn biết được sự khác nhau giữa lý thuyết và thực tế.

LẠI ĐÌNH BIÊN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ
Bệnh viện Từ Dũ là bệnh viện đầu ngành về sản phụ khoa của cả nước, đồng thời
là trung tâm sản phụ khoa lớn nhất khu vực phía Nam tọa lạc tại 284 Cống Quỳnh,
phường Phạm Ngũ Lão, quận 1, Tp.HCM.
Trong đó khoa xét nghiệm di truyền y học tự hào là đơn vị đi đầu cả nước về di
truyền người và chẩn đoán trước sinh. Di truyền và sinh học phân tử là chuyên khoa
mũi nhọn của bệnh viện Từ Dũ, là lĩnh vực tiên phong trong xu hướng phát triển y học
của thế giới. Khoa có đội ngũ cán bộ y tế trẻ giỏi, có đầy đủ các thiết bị xét nghiệm
sàng lọc và chẩn đoán gen hiện đại. Khoa xét nghiệm di truyền y học được thành lập
ngày 8/10/2010 từ tiền thân là buồng di truyền thuộc khoa giải phẫu bệnh - tế bào - di
truyền, gồm 2 bộ phận chính:
-Xét nghiệm sàng lọc: sàng lọc trước sinh (double test và combined test, triple
test) và sàng lọc sơ sinh (thiếu G6PD, suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượng thận
bẩm sinh).
-Xét nghiệm gen và nhiễm sắc thể: karryotube, QF-PCR, FISH, đột biến gen
Thalassemia, loạn dưỡng cơ Duchenne, Digeorge, AZF, SRY, Hemophilia, nhận dạng
gen người, đột biến gen sẩy thai, HPV, Rubella PCR, CMV PCR, Toxoplasma PCR và
nhiều bệnh khác (nguồn: http://tudu.com.vn/vn/gioi-thieu/cac-chuyen-khoa/khoa-can-
lam-sang/khoa-xet-nghiem-di-truyen-y-hoc/)
Sơ đồ quy trình xét nghiệm của khoa
- Sơ đồ quy trình xét nghiệm karyotube
+Lấy mẫu: Tiếp nhận bệnh nhân, ghi thông tin, lấy mẫu hoặc nhận mẫu lừ
các nơi gửi đến, và ký nhận.
+Kiểm tra: Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm
không.

LẠI ĐÌNH BIÊN
+Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng
mẫu.
+Thực hiện xét nghiệm: Thực hiện xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật xét
nghiệm nhiễm sắc thể đồ máu gồm các bước nuôi cấy 72 giờ, thu hoạch và chuẩn
bị lam 2 ngày, đọc và phân tích.
+Ra kết quả xét nghiệm.
+Kiểm tra kết quả, nếu không đạt thì lấy mẫu lại.
Lấy mẫu
Kiểm tra
Nhập liệu
Thực hiện xét nghiệm
Trả về nơi giới thiệu hoặc điều
trị chuyên khoa
Tư vấn
Kiểm tra kết quả
Ra kết quả
Lưu hồ sơ
Kết thúc
Nhập kết quả
Không đạt
Đạt
Không đạt
Đạt

GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
10
LẠI ĐÌNH BIÊN
+Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc
thể đồ máu cho bệnh nhân.
+Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn.
+Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều trị
chuyên khoa phù hợp.
+Lưu hồ sơ.
-Sơ đồ quy trình xét nghiệm sinh học phân tử
+Nhận mẫu: Nhận mẫu dịch ối, mẫu máu, gai nhau từ các khoa khác tại
bệnh viện.
Trả kết quả bệnh nhân
Nhận mẫu
Kiểm tra thông tin
Nhập liệu
Ly trích DNA
PCR
Chạy điện di
Ra kết quả và phân tích

11
LẠI ĐÌNH BIÊN
+Kiểm tra thông tin: Thông tin trên ống chứa mẫu với thông tin trên giấy,
nếu không khớp thì báo lại.
+Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng
mẫu.
+Ly trích DNA: Dùng các bộ kit để thu được DNA.
+Chạy PCR: Cho DNA vào máy chạy PCR
+Điện di: Tùy xét nghiệm mà chạy điện di gel hoặc điện di mao quản từ sản
phẩm PCR
+Ra kết quả và phân tích: Nếu đạt yêu cầu in trả kết quả bệnh nhân, nếu kết
quả bị nghi ngờ là sai thì chạy mẫu lại.
1.2.Tổng quan về các phương pháp
1.2.1.Karyotype
Xét nghiệm karyotube hay Lập bộ nhiễm sắc thể là xét nghiệm khảo sát bộ nhiễm
sắc thể trong 1 tế bào. Xét nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào trong môi
trường đặc biệt. Sau thời gian thích hợp tế bào được thu hoạch và được nhuộm đặc
trưng. Kỹ thuật nhuộm hiện nay là GTG (Giemsa trypsin G-banding).
Người bình thường có 46 nhiễm sắc thể, chia thành 22 cặp thường và 1 cặp giới
tính. Mỗi cặp có kích thước, hình dạng và cấu trúc đặc trưng.
Sau khi nhuộm, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể được khảo sát
bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần và được phân tích, xếp thành bộ hoàn chỉnh
bằng phần mềm chuyên dụng.
Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn,
máu dây rốn.

12
LẠI ĐÌNH BIÊN
Karyotube được chỉ định xét nghiệm cho tất cả các đối tượng nghi ngờ bị rối
loạn di truyền, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần, vô sinh – hiếm muộn, sẩy
thai liên tiếp…
Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotube
Lúc đầu người ta chỉ căn cứ vào chiều dài của NST để căn cứ và đặt tên cho
chúng từ 1 đến 23 theo thứ tự từ dài đến ngắn (công ước Denver 1960), nhưng ngay
sau đó cũng năm 1960 Patau không đồng ý và đề xuất thêm tiêu chuẩn vị trí phần tâm,
sau này được quốc tế chính thức chấp nhận.
Phân loại nhiễm sắc thể
Ở người bộ NST 2n = 46 trong đó có 22 cặp NST thường (autochromosome) và 1
cặp NST giới tính (sex chromosome). Dựa vào đặc điểm hình thái như độ dài, vị trí
tâm động người ta sắp xếp các NST thành từng nhóm. 46 NST người được chia thành
7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G trên nguyên tắc dài trước ngắn sau, nếu các
NST bằng nhau thì tâm giữa đặt trước, tâm lệch đặt sau:
-Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 đến 3, cặp số 1
tâm giữa, cặp số 2 tâm lệch, cặp số 3 tâm giữa.
- Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và 5. Các NST này có kích thước lớn và đều có tâm
lệch.
-Nhóm C có 7 cặp từ số 6 đến 12 có chiều dài trung bình. NST X cũng được xếp
vào nhóm này. Tất cả đều tâm gần giữa và khó phân biệt.
-Nhóm D có 3 cặp từ số 13 đến 15 gồm các NST có nhánh ngắn rất ngắn, gần
như không đáng kể gọi là các NST tâm đầu (acrocentric). Tất cả 3 cặp NST này đều có
vệ tinh ở nhánh ngắn.
-Nhóm E có 3 cặp 16, 17,18 tương đối ngắn. NST số 16 tâm giữa, 17 và 18 tâm
lệch.

13
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Nhóm F có 2 cặp NST 19 và 20, ngắn và có tâm giữa.
-Nhóm G có 2 cặp 21 và 22, kích thước ngắn và tâm đầu, có vệ tinh. NST Y cũng
được xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh.
Các rối loạn về bộ nhiễm sắc thể người
Rối loạn số lượng
-Đa bội thể: là hiện tượng tăng chẵn hoặc tăng lẻ cả bộ NST. Ví dụ: ở người 3n =
69 NST là thể tam bội (3n) thuộc dạng thể đa bội lẻ, 4n = 96 NST = thể tứ bội (4n)
thuộc dạng thể đa bội chẵn. Ở người, các trường hợp đa bội phần lớn phôi thai chết ở
giai đoạn trước sinh, một vài trường hợp sống đến khi sinh hoặc sau sinh nhưng hầu
hết là các sơ sinh bị dị tật.
-Lệch bội: là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc
vài NST so với bộ NST lưỡng bội.
Rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể
-Mất đoạn (deletion): là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn
bị đứt rời ra không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác, phần còn lại mang
tâm trở lên ngắn hơn bình thường. Mất đoạn gồm các dạng: mất đoạn cuối đơn, mất
đoạn cuối kép, mất đoạn giữa.
-Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là hiện tượng trao đổi các đoạn của
NST. Chuyển đoạn NST đã được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của
NST [63]. Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation)
và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation).
-Lặp đoạn (duplication) là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi
lên. Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng
trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2
đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng. Trong trường hợp này có 2 NST bị
thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào.

14
LẠI ĐÌNH BIÊN
Khi các NST trong cặp tương đồng này phân ly nhau trong giảm phân sẽ tạo ra hợp tử
mang NST lặp đoạn (trisomi từng phần) hoặc NST thiếu một đoạn có liên quan
(monosomi từng phần)…
-Đảo đoạn (invertion) là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn
giữa hai điểm đứt quay ngược 1800 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ tự
so với đoạn ban đầu. Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm
đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng.
+Đảo đoạn ngoài tâm: hai chỗ đứt ở cùng một nhánh của NST và đoạn đảo
không chứa tâm, NST không thay đổi hình thái.
+Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh và cách đều tâm, NST
không thay đổi hình thái.
+ Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách
tâm không đều nhau, NST có cấu trúc lại và thay đổi hình thái.
1.2.2.Sinh học phân tử
1.2.2.1.QF-PCR
QF-PCR là PCR huỳnh quang định lượng (Quantitative Fluorescence PCR). Đây
là một kỹ thuật PCR dùng để khuếch đại các đoạn DNA ngắn lặp lại đặc hiệu (STR),
đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng bằng điện di mao quản.
QF-PCR được dùng để kiểm tra liều gen, ví dụ: số lượng bản sao của gen trong 1
mẫu khảo sát, số lượng của các đoạn nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể thường được
khảo sát bằng QF-PCR là nhiễm sắc thể (NST) 13, 18, 21, X, Y.
Mỗi NST sẽ được khảo sát tại nhiều đoạn STR khác nhau. Do các locus STR
thường được chọn có đặc tính đa hình cao nên ít khi xảy ra trường hợp trisomy cho kết
quả dạng đồng hợp tử ở tất cả các đoạn STR không thể kết luận được. Prenatal Lab sử
dụng QF-PCR khảo sát 32 đoạn STR khác nhau trên các NST 13, 18, 21, X và Y.

15
LẠI ĐÌNH BIÊN
Hiện nay QF-PCR thường được chỉ định trong chẩn đoán nhanh trước sinh rối
loạn nhiễm sắc thể cho các trường hợp thai nguy cơ cao bị Hội chứng Down, Hội
chứng Edwards, Hội chứng Turner, Hội chứng Klinefelter…
Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn,
máu dây rốn, mô thai sảy…
-Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình
thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của 1 trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn
DNA nằm giữa 2 mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại 1 trình tự DNA xác định, ta
phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các
mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer).
-Thực nghiệm:
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự
sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là
94-950C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính.
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt
cặp với khuôn. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3’ định hướng đoạn trình tự cần
nhân nên quá trình tổng hợp ADN sẽ diễn ra trên cả hai mạch, qua suốt vùng trình tự
đó; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C – 700C, tuỳ thuộc
Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai.
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase sử dụng
vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. ADN polymerase gắn vào

16
LẠI ĐÌNH BIÊN
đầu 3’ tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng hợp các mạch mới theo chiều 5’ – 3’.
Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài.
Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại tăng
gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là kỹ thuật khuếch đại theo cấp số nhân; theo
tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu
(Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục).
-Các điều kiện của phản ứng PCR
Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau: ADN khuôn, mồi,
DNA polymerase, các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP), dung dịch đệm (buffer).
-Điện di mao quản:
+Nguyên tắc của sự tách
Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản
(ɸ:25-100mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp,
dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế
cao một chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là kỹ thuật tách
được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các
Hình 1. Các giai đoạn của 1phản ứng PCR (Nguồn:
http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=9925

17
LẠI ĐÌNH BIÊN
chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác
phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu
quả cao.
+Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF)
và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh
động của chúng khác nhau.
1.2.2.2.Real time PCR (xét nghiệm HPV)
Siêu vi sinh dục papilom ở người (Human Papillomavirus) còn gọi là siêu vi
HPV, là siêu vi thông thường gây nhiễm trùng tế bào da. Thông thường, cơ thể sẽ tự
chống lại siêu vi HPV trước khi chúng có thể gây ra những vấn đề sức khỏe. Vì lý do
này, hầu hết những người bị nhiễm siêu vi HPV không có triệu chứng và không biết
mình đã bị nhiễm bệnh. Nhưng đôi khi cơ thể không tự chống lại siêu vi HPV. Trong
những trường hợp này, siêu vi HPV có thể gây ra các vấn đề cho sức khỏe, như: Mụn
cóc sinh dục ở đàn ông và phụ nữ; ung thư cổ tử cung ở phụ nữ; những loại ung thư ít
phổ biến khác ở đàn ông và phụ nữ, như ung thư hậu môn.
Siêu vi HPV làm cho những tế bào bình thường trong cơ thể trở nên bất thường.
Người ta không thể nhìn thấy hay cảm thấy những tế bào bất thường này. Hầu hết các
trường hợp, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV và các tế bào sẽ trở lại bình thường.
Nhưng nếu không thì siêu vi HPV có thể biến tế bào thành ung thư theo thời gian. Sau
nhiều năm thì ung thư mới phát triển ở một người bị nhiễm siêu vi HPV. (Nguồn:
Marina D.M Limaa, b, Paulo Henrique Braz-Silvaa, c, Sônia M. Pereirad, Catalina
Rierae, Ariane C. Coelhof, Marina Gallottinia 2014, “Oral and cervical HPV infection
in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual health clinic in São
Paulo, Brazil”)
Giới thiệu chung

18
LẠI ĐÌNH BIÊN
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích
đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng
kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản
phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh
quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu
huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm
liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer
đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt
chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang
để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo
được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR
có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy
khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học
lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của
trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn
được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện
di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình
được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong
một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết
của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ.
Phân tích tổng quát một phản ứng Real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong
khuếch đại mẫu. Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu
huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại
trong tube, được trình bày trong trục y.
Đường cong khuếch đại có 2 pha, 1 pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn
định. Trong suốt pha hàm mũ, số lượng PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy
nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một

19
LẠI ĐÌNH BIÊN
hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm nàu phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn
định (các chu kỳ 28-29).
Đầu tiên tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh
quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo
hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép
phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu
kỳ ngưỡng (CT). Do đó giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản
ứng không bị hạn chế, nên real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác
và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng.
CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu
phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch
đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy,
phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu
phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng
trên background. Vì vậy phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là
cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR.
Một số ứng dụng chính của real-time PCR
Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền

20
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ
biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR
-Chuẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chuẩn
đoán các bệnh viêm nhiếm.
-Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để
xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp
tử: có cả 2 allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn.
1.2.2.3.Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH):
FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế
bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh
quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc
thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc
phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của
các loại chuyển đoạn đặc biệt.
Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn
đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể
thường gặp (13,18,21,X,Y)
Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: Chẩn đoán trước sinh các
bất thường số lượng NST ở thai nhi, phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di
truyền, xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc, phát hiện các bất thường
nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.
Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh:
Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội
chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy
13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng
Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm:

21
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn
thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định
đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH
-Độ chính xác cao
-Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối.
-Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai nhau.
Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner,
Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy
13)

22
LẠI ĐÌNH BIÊN
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Karyotype:
2.1.1.Vật liệu: Mẫu máu từ các cặp vợ chồng, đứa trẻ có nghi ngờ đột biến
nhiễm sắc thể, dịch ối từ các bà mẹ mang thai.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị:
Kính hiển vi, lam kính, máy ly tâm, ống chứa máu chân không, kim tiêm, bể cách
thủy có lắc, tủ lạnh, Pipetman, đầu côn, cồn tuyệt đối, máy sấy lam, tủ ấm, máy in, tủ
cấy an toàn sinh học cấp 2.
2.1.3.Hóa chất:
Trypsin, PBS, Buffer, Giemsa, KCl 7,5%, Demecolcine, Acid acetic 5%,
Methanol, Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic nguyên chất), dầu soi kính.
2.1.4.Quy trình:
- Bước 1: Lấy mẫu
Tiếp nhận bệnh nhân, ghi thông tin, lấy mẫu hoặc nhận mẫu lừ các nơi gửi
đến, và ký nhận.

23
LẠI ĐÌNH BIÊN
Xác định chổ cần lấy máu, dùng kim tiêm đâm vào mạch máu ở tay lấy máu
ngoại vi, lấy gần 2/3 ống máu, lắc đều. Tốt nhất lấy máu và cấy máu trong ngày.
Trong trường hợp ở xa máu khi đã tách lớp phải được bảo quản lạnh ở 40C có
chất chống đông heparin.
-Bước 2: Kiểm tra
Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm không.
-Bước 3: Nhập liệu
Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu
-Bước 4: Thực hiện xét nghiệm:
Cấy mẫu -> Thu hoạch -> Nhỏ lam -> Nướng lam -> Nhuộm lam -> đọc
lam, phân tích kết quả.
+Cấy mẫu:
Hút 0,5 -1 ml máu (hút lấy phần trắng ở giữa các tế bào máu và huyết tương khi
máu đã tách lớp) cho vào 8ml môi trường nuôi cấy sau đó đậy kín để tủ ấm 370C trong
3 ngày.
Hình 4. Lấy máu người lớn Hình 5. Lấy máu em bé

24
LẠI ĐÌNH BIÊN
+Thu hoạch:
Nhỏ 100μl dung dịch demecolcine vào mỗi ống máu, ủ ở 370C/ 30 phút (trong
máy lắc ổn nhiệt đảm bảo demecolcine hòa tan hết trong máu), lấy ra ly tâm 1800 rpm
trong 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi.
Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phútHình 7. Dung dịch Demecolcine
Hình 6. Cấy mẫu

25
LẠI ĐÌNH BIÊN
Cho tiếp 8 – 10 ml KCl 7,5%, ủ 370C trong 30 phút, ly tâm 1800 vòng/phút
trong 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi.
Nhỏ thêm 5ml axit acetic 5%: vừa lắc vừa nhỏ từng giọt, ly tâm 1800 vòng/phút
trong 8 phút tiếp tục hút bỏ dịch nổi.
Hình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâm

26
LẠI ĐÌNH BIÊN
Cho vào ống dung dịch canoy, ủ ở ngăn đá 20 phút, ly tâm 1800 vòng/ 8 phút,
hút bỏ dịch nổi. Nếu dung dịch chưa có màu trắng thì lặp lại cho dung dịch carnoy
thêm 1 đến 2 lần nữa rồi đem đi ly tâm liền ở 1800 vòng/ 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi.
+Nhỏ lam:
Có 2 cách nhỏ lam: Nhỏ cao (nhỏ từ trên cao xuống) và nhỏ ngang ( nhỏ chạm
trên mép lam kính  đập).
Hình 11. Sau khi chi dung dịch
carnoy vào lần 2
Hình 12. Dung dịch có màu trắng
Khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3

27
LẠI ĐÌNH BIÊN
Đầu tiên lấy lam kính từ trong cồn tuyệt đối để lạnh rửa lần lượt qua 2 hủ đá có
nước rồi sau đó lấy pipet hút mẫu nhỏ lên lam kính nếu nhỏ cao thì khi nhỏ xong để
lên máy sấy lam khoảng 550C, nếu nhỏ ngang thì khi nhỏ xong phải đập lam kính rồi
để trên máy sấy lam 550C. Khi lam kính khô lấy ra để ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày
rưỡi 3 ngày.
+Nướng lam: Để lam kính vào trong tủ ấm ở 800C trong 30 phút.
+Nhuộm lam:
Lam kính được nhúng trong trypsine để trong bể 370C trong vòng khoảng 14, 16,
18, 20, 22 giây để test lam xem thử ở thời gian nào sẽ quan sát được NST đẹp nhất,
chọn ra để làm cho tất cả mẫu trong ngày. Sau đó nhúng vào 2 hủ PBS lạnh sau đó để
ráo.
Pha dung dịch buffer: Giemsa với tỷ lệ 9 buffer : 1 giemsa. Hút dung dịch này
nhỏ đầy lên lam kính đợi 10 – 15 phút. Rửa nước, để khô.
Hình 14. Nhỏ caoHình 13. Nhỏ ngang

28
LẠI ĐÌNH BIÊN
+Phân tích, đọc kết quả:
Đem lên kính hiển vi quan sát ở thấu kính 10 để xác định NST sau đó chỉnh sang
thấu kính 100 để phân tích.
-Bước 5: Ra kết quả
Hình 16. Quan sát dưới kính hiển vi

29
LẠI ĐÌNH BIÊN
Một bệnh nhân lấy 25 mẫu NST lựa chon 10 bộ đẹp nhất đem đi phân tích ra
kết quả
-Bước 6: Kiểm tra kết quả
Kiểm tra các bộ NST có đủ 22 cặp không. Nếu không đạt thì lấy mẫu lại.
-Bước 7: Nhập kết quả
Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc
thể đồ máu cho bệnh nhân.
-Bước 8: Tư vấn
Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn.
-Bước 9: Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều
trị chuyên khoa phù hợp
-Bước 10: Lưu hồ sơ.
2.2.Sinh học phân tử
2.2.1.QF-PCR
2.2.1.1.Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ có nguy cơ cao về rối loạn NST
được tư vấn và đồng ý tham gia chọc ối tại bệnh viện Từ Dũ.
2.2.1.2.Dụng cụ và thiết bị:
Tube vô trùng các loại 200μl, 500μl và 1,5ml; Pipette: 0,5 – 10μl, 2 – 20μl,
10 – 100μl, 100 – 1000μl (Eppendorf) và đầu côn tương ứng; Lam kính; Máy
vortex; Máy ly tâm (Eppendorf); tủ mát 4 – 80C; Máy định lượng DNA
Biophotometer Plus (Eppendorf); Máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf); Hệ
thống điện di mao quản ABI 3500/ABI 3130 (Applied Biosystems); Máy vi tính,
máy in, phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics).

30
LẠI ĐÌNH BIÊN
2.2.1.3.Hóa chất: Proteinase K, Buffer lysis type 10, Elution buffer type 5,
lysis buffer type 6, Instagene matrix, Hi-di-Fomamide, 560 sizer orange.
2.2.1.4. Cách tiến hành:
-Ly trích DNA:
+Đối với kit Instagene Matrix:
Dịch ối được ly tâm 1500 rpm/ 5 phút.
Chuẩn bị ống tube 1,5 ml đánh mã số cho khớp với ống chứa dịch ối.
Hút 200µl dịch ối chứa cặn vào tube đem ly tâm 14000 rpm trong 1 phút,
hút bỏ nước lấy cặn. Bổ sung khoảng 100-150 µl Instagene Matrix. Đem lắc 1300
rpm trong 3 phút, spin rồi lắc ủ 990C/ 800rpm/ 10 phút. Tiếp đó lắc 800 vòng/ 3
phút, ly tâm 12000rpm/ 2 phút. Thu được DNA trong dung dịch.
+Đối với Kit GE:
Ly tâm dịch ối 1500 rpm/ 5 phút.
Hút 20 µl Proteinase K vào ống tube 1.5. Hút 200 µl cặn dịch ối, đối với
máu thì hút phần ở giữa phần tách lớp các tế bào màu và huyết tương, thêm 400
Hình 18. Mẫu được lắc ủ 990C
800rpm trong 10 phút
Hình 17. Ống type được đánh số theo
mã số của ống chứa dịch ối

31
LẠI ĐÌNH BIÊN
µl lysis byuffer tube 10  vortex kỹ, lắc 1500 rpm/10 phút, ủ ở nhiệt độ phòng/
10 phút.
Chuẩn bị hút 200 µl dung dịch elution buffer type 5 vào ống tube mới ủ ở
700C.
Chuyển toàn bộ mẫu ủ qua ống tube khác có màng lọc, ly tâm 14000rpm/1
phút  loại bỏ nước. Bổ sung 500 µl lysis buffer type 10, ly tâm 14000 rpm/1
phút  bỏ nước, tiếp tục cho 500 µl wash buffer type 6, ly tâm 14000 rpm/ 1
phút, rồi tiếp tục ly tâm 14000 rpm/3 phút.
Chuyển màng lọc qua ống tube mới, cho vào đó 200 µl elution buffer tube 5
700C đã chuẩn bị truước đó, ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút, đem ly tâm 14000
rpm trong 1 phút, lấy nước bỏ màng lọc. Thu được DNA trong dung dịch.
-Chạy PCR
Chuẩn bị 2 loại tube có chứa 2 loại mastermix một loại chứa NST 13, 18,
21, một loại chứa cho NST giới tính X, Y, 13, 18, 21 đem rả đông. Hút 1,5-2 µl
dịch trong của mẫu cho vào lần lượt 2 tube chứa 2 mastermix. Đưa mẫu vào máy
chạy
QF-PCR Mỗi mẫu sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ
Devyser Complete, chạy xong lấy mẫu ra.
Hình 21. Máy PCR
Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6

32
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Điện di:
Chuẩn bị ống tube, hút 600 µl Hi-Di-Formamide cộng với 12 µl 560 sizer
orange. Hút 12 µl hỗn hợp vào mỗi giếng và thêm 0,9 µl mẫu và đưa vào máy
chạy điện di mao quản theo chu trình điện di của phân tích đoạn với: Điện thế
bơm mẫu: 2,5V; Thời gian bơm mẫu: 20 giây, điện thế điện di: 15V; thời gian
điện di: 30 phút
Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tin .fsa và được
phân tích kết quả trisomy bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả các tiêu
chuẩn phân tích, đánh giá được căn cứ theo Hướng dẫn thực hành chẩn đoán
lệch bội
bằng QF-PCR (2007) của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh, ra
kết quả và trả cho bệnh nhân.
2.2.2.FISH
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm
PCR

33
LẠI ĐÌNH BIÊN
Khi xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR không cho kết quả hoặc kết quả không rõ
ràng thì tiến hành thêm kỹ thuật FISH.
Nguyên tắc: Sử dụng các đoạn dò được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp
chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu. Dưới kính hiển vi huỳnh quang, các vị trí
đoạn dò huỳnh quang gắn với NST sẽ được phát hiện. Dựa vào số lượng tín hiệu màu
huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào bất
thường cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu.
2.2.2.1.Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ.
2.2.2.2.Dụng cụ và thiết bị: Kính hiển vi, lam kính, Lamelle, máy ủ nhiệt, máy
ly tâm, máy ổn nhiệt có lắc, pipetman, đầu côn, máy sấy lame, máy lai FISH.
2.2.2.3.Hóa chất: Trypsin-EDTA 1X (GIBCO), Dung dịch KCl 0,075M, Dung
dịch carnoy, Sử dụng bộ kit FISH thương mại VYSIS (Mỹ), DAPI, NP40 0,3%, NP40
0,1%, SSC 2X, Pepsine, PBS, FA, Ethanol, prenatal X, Y and 18 enumeration Probe
và prenatal 13 and 21 enumeration Probe, Keo, Antifate.
2.3.2.2.Cách tiếnhành:
-Ly tâm dịch ối 1800 rpm trong 8 phút.
-Thu hoạch gồm các bước:
Hút bỏ dịch, lấy cặn, nhỏ 2ml trypsine ủ ở 370C trong 10 phút, ly tâm 1800
vòng/12 phút  hút bỏ dịch nổi lấy cặn, bổ sung thêm 8-10ml KCl 7,5%, ủ
370C/40 phút  ly tâm hút bỏ dịch nổi ở những bước sau cũng làm tương tự như
cách thu hoạch máu ở kyraotube nhưng khác là ủ ở 370C trong 40 phút và ly tâm
1800 rpm trong 12 phút.
-Nhỏ lam: Hút mẫu nhỏ lên lam kính đã kẻ vòng tròn để sẵn trên máy sấy
lam 550C, để khô.
-Chuẩn bị lai:

34
LẠI ĐÌNH BIÊN
Nhúng lam vào dung dịch SSC 2X ở 370C/ 60 phút  nhúng qua pepsine
370C/ 11 phút  cho qua dung dịch PBS ở nhiệt độ phòng 4 phút  nhúng vào
dung dịch FA 0,95% ở nhiệt độ phòng/5 phút  cho vào PBS nhiệt độ phòng 4
phút đem phơi khô  nhúng qua cồn 700/ 2 phút  cho vào cồn 1000/2 phút 
phơi khô.
-Lai: Tiến hành nhỏ probe NST 13, 18, 21, X, Y vào lai, đậy lamelle tránh
bọt khí  hàn lamelle bằng parafin  cho vào máy lai tự động được cài đặt sẳn
chương trình 750C/2 phút, 370C trong 24 giờ.
-Xử lý mẫu sau lai: Gỡ bỏ keo bằng cách rửa với SSC 2X ở nhiệt độ phòng
tiếp đến ngâm ngâm trong NP40 0,3% trong 730C/ 2 phút rồi ngâm trong NP40
0,1% /1 phút ở nhiệt độ phòng.
Vớt lam kính, nhỏ DAPI lên lam kính, sau đó nhỏ antifate để bảo vệ tế bào
khỏi tia huỳnh quang, đậy lamelle đem đọc phân tích dưới kính hiển vi.
Hình 23. Cho vào máy lai PCR Hình 24.Gỡ keo sau lai

35
LẠI ĐÌNH BIÊN
2.2.3.Real time PCR
2.2.3.1.Vật liệu: Phết cổ tử cung từ bệnh nhân.
2.2.3.2.Dụng cụ và thiết bị: Plate, máy ly trích tự động DNA, pipetman,
đầu côn, tube, Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf), máy ly
tâm, tủ cấy an toàn sinh học cấp 2.
2.2.3.3.Hóa chất: Buffer AW1, Buffer AW2, Buffer AE, Proteinase K,
Buffer AL, Isopropanol, mag attract suspension.
2.2.3.4.Cách tiến hành:
Quy trình thực hiện:
Thu nhận dịch nhày cổ tử cung và
nhập thông tin bệnh nhân
Ly trích DNA sử dụng bộ kít real
time PCR của hãng SACACE
BIOTECHOLOGIES và sử dụng
máy ly trích DNA tự động
Chạy real time PCR sử dụng máy của
hãng Bioroad
Phân tích Kết quả và trả kết quả

36
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Thu nhận dịch nhầy cổ tử cung và nhập thông tin bệnh nhân.
Bước này ta chủ yếu nhận dịch phết của bệnh nhân từ phòng soi cổ tử cung các
khoa khám phụ khoa. Sau khi nhận ta đánh mã số cho từng mẫu, sau đó ta sẽ đánh
máy lưu thong tin bệnh nhân.
-Đưa mẫu vào tủ cấy cấp 2, bật tia uv trong 15 phút.
Hình 25. Đánh mã số cho mẫu
Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp
2

37
LẠI ĐÌNH BIÊN
- Sau khi xong 30 phút ta tiến hành thu dịch phết cổ tử cung bằng cách đổ lọ sinh
thiết ra tube 1.5ml (nếu dịch nhầy khô ta tiến hành đổ nước muối sinh lý vô trùng vào
lắc đều và thu dịch).
-Sau khi thu dịch xong ta tiến hành đi ly tâm mẫu 14000v/p trong vòng 1 phút để
dịch nhầy lắng xuống đáy tube.
-Trong khi ly tâm ta chuẩn bị pha dung dịch mastermix gồm có: buffer Al,
Isopropanol, Magaffract susperision.
-Tiến hành cho hóa chất và mẫu vào giếng gồm có 12 cột 1  12, 8 hàng A  H.
+ Hàng A cho vào mỗi giếng là 65µl lysate bao gồm 2µl protease K + 20µl mẫu
+ 43µl mastermix.
+ Hàng B và C cho vào các mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW1.
+ Hàng D và E, mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW2
+Hàng F 30µl dung dịch AE.
Sau đó ta sẽ bỏ vào máy ly trích DNA tự động. máy sẽ tự tách DNA làm theo chu
trình cài đặt sẵn. Thu được DNA ở những giếng của hàng F.
Hình 27. Máy trích ly DNA tự động

38
LẠI ĐÌNH BIÊN
-Sau khi ly trích DNA ta lấy 5µl mấu DNA đã tách đem bỏ vào tube thể tích
0.2ml đã có sẵn các đoạn mồi, dung dịch đệm các mẫu dò cho trưng type hpv sau đó
dem chạy trên máy real time PCR BIO-RAD có gắn hệ thống máy tính có gắn sẵn
phần mềm phân tích kết quả. Mỗi lần phóng đại xong ta sẽ có tín hiệu xuất hiện trên
máy, dựa vào đó ta kết luận và gửi trả kết quả cho bệnh nhân .
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Karyotype
Hình 28. Bỏ mẫu vào Plate Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW1

39
LẠI ĐÌNH BIÊN
Ta thấy có đủ 23 cặp NST trong đó có 22 cặp NST và 1 cặp NST XY phù hợp
với NST của người bình thường. Kết luận bình thường, giới tính nam.
Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp

40
LẠI ĐÌNH BIÊN
Nhìn hình 5 ta thấy có 22 cặp NST và 1 cặp NST giới tính XX phù hợp với NST
bình thường của con người. Kết luận bình thường, giới tính nữ.
3.2.Sinh học phân tử:
3.2.1. QF PCR
-Kết quả liên quan đến NST giới tính.
Nhìn hình 33 ta thấy locus SRY không có NST Y => không phải con trai. Và
locus Amelogenin hiện diện 1 NST X. Tuy nhiên, sẽ có một số trường hợp đồng hợp
tử các alen trên NST X dẫn đến không thể kết luận được. Lúc này kit Devyser còn có
thêm những marker có thể hiện NST giới tính X khác như X1, X2, X3, X9. Trong hình
ta thấy tại những vị trí X1, X2, đều có 3 NST X tỉ lệ (1:1:1), còn ở X3, X9 thì có 2
NST nhưng tỉ lệ là (1:2) và (2:1). Từ đó suy ra người này dư 1NST giới tính X hay còn
gọi là bệnh siêu nữ.

41
LẠI ĐÌNH BIÊN
Một số loại bệnh liên quan đến NST giới tính:
-Kết quả liên quan đến NST 13, 18, 21.
Hình 33. Kết quả Trisomy XXX
Hình 34. Kết quả bị hội chứng Turner Hình 35. Kết quả bị hội chứng Klinefelter

42
LẠI ĐÌNH BIÊN
Trong hình 36, ta thấy các NST 13 và 18 đều có 1 hoặc 2 alleles. Riêng NST
21A, 21B, 21C, 21D, 21H có 3 alleles tỉ lệ lần lược là (1:2) (2:1) (1:2) (1:2) (1:2). Từ
đó ta biết được người này bị hội chứng dư 1 NST số 21 (hội chứng down).
Một số loại bệnh liên quan đến NST số 13 và 18:
Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)
Hình 37. Kết quả Trisomy
13 (hội chứng Patau)
Hình 38. Kết quả Trisomy
18 (hội chứng Edward)

43
LẠI ĐÌNH BIÊN
3.2.2. FISH
Dựa vào hình 39 và 40, ta thấy dưới tia huỳnh quang NST 21 bắt màu đỏ. NST
13 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe NST 13, 21). Hình 39 có 2 NST
21 và 2 NST 13 phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường.
Hình 40 có 2 NST 13 và 3 NST 21 không phù hợp với NST người bình thường.
Kết luận bị hội chứng down.
Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST
13 bình thường
Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội
chứng down
Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST
18 bình thường
Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST
18 bình thường

44
LẠI ĐÌNH BIÊN
Dựa vào hình 41 và 42, dưới tác dụng của tia huỳnh quang NST X bắt màu xanh
lục, NST Y bắt màu đỏ, NST 18 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe
NST X, Y, 18) . Hình 41 có 2 NST X, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình
thường. Kết luận bình thường, giới tính nữ.
Hình 42 ta thấy có cặp NST XY, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình
thường. Kết luận bình thường, giới tính nam.
3.2.3.Realtime PCR chẩn đoán HPV
Ở đây ta xét nghiệm các tube HPV băng phương pháp real time pcr các típ xét
nghiệm là :
-Tube HPV A9 gồm các nhóm 16, 31, 33, 35, 52 và 58 kí hiệu bắt màu xanh.
-Tube HPV A5-A6 gồm các nhóm 51, 59 kí hiệu màu đỏ.
-Tube HPV A7 gồm các nhóm 18, 39, 45, 59. Và được kí hiệu màu cam.
-Mẫu chứng nội tại ( của bệnh nhân ) thì màu xanh dương.
Điều kiện để mẫu cho kết quả là dương tính thì nó phải có đường cong cao hơn
chứng nội tại ( trừ tube A5-A6 thấp hơn chứng nội tại ) và xuất hiện ở chu kì sớm ( tối
đa không quá 25 chu kì ).

45
LẠI ĐÌNH BIÊN
Ở đây ta thấy ở hình âm tính ta chỉ thấy đường cong của chứng nội tại của bệnh
nhân nên ta thấy bệnh nhân không bị bệnh. Và xuất hiện sớm ở chu kì 20 của quá trình
PCR.
Ở kết quả dương tính ta thấy mẫu này bị nhiễm tất cả các loại tube HPV. Các
tube này xuất hiện sớm trong chu ki thứ 14 15 và cao hơn chứng nội tại ở tube A7, A9
và thấp hơn chứng nội tại ở tube A5-A6.
Hình 44. Kết quả dương tínhHình 43. Kết quả âm tính

46
LẠI ĐÌNH BIÊN
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Sau một thời gian thực tập tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ
TpHCM, chúng em đã được mở rộng hiểu biết thêm về tầm quan trọng cũng như các
kinh nghiệm quý báu trong quy trình xét nghiệm phát hiện bệnh, thao tác phải tỉ mĩ,
gọn gàng, quan trọng nhất là không để nhầm mẫu.
Với cách tổ chức, quản lý chặt chẽ, trang thiết bị cơ sở vật chất đảm bảo, các bác
sĩ cùng thạc sĩ, cử nhân sinh học, xét nghiệm tài giỏi và y đức đáp ứng nhu cầu ngày
cao của nhân dân.
Qua quá trình thực tập tại khoa, chúng em đã được tạo đầy đủ điều kiện học tập
với đúng nội dung đã đăng ký đồng thời giúp em củng cố kiến thức đã học cũng như
nắm được cách vận dụng lý thuyết vào thực tế. Qua đây chúng em cũng hiểu thêm
trách nhiệm của người bác sĩ phải làm trong công tác chăm sóc sức khỏe cho nhân
dân.Được sự giúp đỡ của các cán bộ bác sĩ, thạc sĩ, cử nhân sinh học và xét nghiệm tại
khoa xét nghiệm di truyền y học và quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học và kỹ thuật
môi trường, chngs em đã hoàn thành bài báo cáo thực tập tại khoa xét nghiệm di
truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM.

47
LẠI ĐÌNH BIÊN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
[2] Trần Thị Thanh Hương, Hoàng Thu Lan Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn,Thị
Quỳnh Thơ, Nguyễn Danh Cường (2007), Chẩn đoán trước khi sinh hội chứng down,
hội chứng turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc
thể của tế bào ối, Bộ môn Y Sinh học – Di truyền - Trường Đại học Y Hà Nội ,Bệnh
viện Phụ sản Trung Ương.
[3] Nguyễn Anh Trí, Trần Công Hoàng, Kỹ thuật FISH và ứng dụng của kỹ thuật
FISH trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh huyết học.
Tài liệu tiếng anh
[1] Haissam Rahil1, Je´rome Solassol, Christophe Philippe, et al. Rapid
detection of common autosomal aneuploidies by quantitative fluorescent PCR on
uncultured amniocytes. Eur J Hum Genet. 2002, Aug,10 (8), pp.46246-6. PMID:
12111640 [PubMed - indexed for MEDLINE]
[2] Marina D.M Limaa, b, Paulo Henrique Braz-Silvaa, c, Sônia M.
Pereirad, Catalina Rierae, Ariane C. Coelhof, Marina Gallottinia 2014, “Oral and
cervical HPV infection in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual
health clinic in São Paulo, Brazil”)
[3] Winfried Schmidt, Jutta Jenderny, Kurt Hecher, et al. Rapid prenatal
diagnosis of aneuploidy for chromosomes 21, 18, 13, and X by quantitative

48
LẠI ĐÌNH BIÊN
fluorescence polymerase chain reaction. Fetal Diagn Ther. 2006, 21 (4), pp.326-
31. PMID: 16757905 [PubMed - indexed for MEDLINE].

Thực tập tốt nghiệp Tu Du Hospital

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (19)

Viewers also liked

Viewers also liked (7)

Similar to Thực tập tốt nghiệp Tu Du Hospital

Similar to Thực tập tốt nghiệp Tu Du Hospital (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (19)

Thực tập tốt nghiệp Tu Du Hospital