Praktikum 1 kuljar

Praktikum 1: Pengenalan Peraltan Tanam dan Peralatan Pembuatan Media Tanam serta Teknik Sterilisasinya

PRAKTIKUM 1
PENGENALAN PERALATAN TANAM DAN PERALATAN PEMBUATAN MEDIA TANAM
SERTA TEKNIK STERILISASINYA

I. PENDAHULUAN

Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan vegetatif non
konvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik perbanyakan vegetatif
konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang berbeda. Penerapan teknik
kultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di dalam ruangan (laboratorium) dan sifatnya
aseptik (steril dari patogen).
Bermuara dalam kondisi yang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas
yang berkaitan dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik. Kondisi ini dimulai dari cara:
1. Penyiapan peralatan (alat tanam berbahan logam ataupun gelas).
2. Pembuatan media penanaman.
3. Penanaman (inisiasi dan pemilihan: a. perbanyakan; b.perakaran).
Secara alamiah dalam kondisi ex vitro/non steril, media tanamberupa tanah
merupakan tempat dimana tanaman tumbuh dan memfungsikan akarnya untuk menopang
pertumbuhan vertical ataupun horizontal serta mengambil nutrisi di dalamnya untuk
melangsungkan kehidupan tanaman itu sendiri. Hal tersebut juga berlaku sama fungsinya
dengan media buatan dalam kondisi in vitro/steril, dimana di dalam media buatan fungsi
tanah digantikan oleh agar-agar yang berfungsi memadatkan media. Selain itu media buatan
tersebut juga diperkaya dengan nutrisi berupa unsure-unsur makro, mikro, vitamin, gula dan
zat pengatur tumbuh yang disesuaikan dengan tujuan pertumbuhan yang diinginkan.
Sterilisasi mediatanaman buatan mutlak dilakukan untuk membebaskan pengaruh
merugikan dari kontaminan seperti bakteri, jamur dan virus, bahkan serangga mikro seperti
mites (tungau) dan thrips. Pengaruh merugikan ini dalam bentuk menghambat pertumbuhan
tanaman dengan cara: (1) kompetisi nutrisi ekstra seluler, (2) kompetisi nutrisi intra
seluler/parasit, (3) mengeluarkan eksudat berupa toksin/racun, (4) bila berupa serangga
mikro menjadi vector pembawa jamur dan bakteri ke dalam media.
Teknik sterilisasi mesia tidak sekedar bertujuan: (1) membebaskan media dari
kontaminan, tetapi juga menjaga agar media dapat dipergunakan oleh tanaman untuk
pertumbuhan normal, dengan kata lain (2) komposisi media tidak mengalami perubahan
selam dilakukan proses sterilisasi. Umumnya teknik sterilisasi media mempergunakan teknik
sterilisasi basah (uap panas dan bertekanan) dengan menggunakan alat yang disebut
autoclave. Suhu dan lama sterilisasi juga berpengaruh terhadap hasil sterilisasi, suhu dan

Prodi Biologi FST UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2010 1


lama yang disarankan ditetapkan 121°C selama 20 menit. Suhu sterilisasi 121°C merupakan
suhu kritis, dimana seluruh bentuk kontaminan tidak dapat bertahan hidup/mati. Khusus
untuk lama sterilisasisifatnya disesuaikan dengan volume media yang disterilisasi, semakin
banyak volume media maka semakin lama masa sterilisasinya. Biasanya untuk lama
sterilisasi 20 menit, volume media yang digunakan berkisar 20-30 ml/botol atau 70-100
ml/cup plastik atau 1 liter botol Schoolt atau 4 liter botol Erlenmeyer.
Peralatan tanam dan tempat penanaman di dalam kultur jaringan tanaman adalah
sebagai berikut:
A. Peralatan Tanam:
1. Pinset (forceps) lurus (straight):
- Mengambil dan memegang obyek tanaman
2. Pinset (forceps) bengkok (curved):
- Membuka, menutup dan meletakkan penutup botol
3. Scalpel (gagang dan mata pisau):
- Memotong obyek tanaman secara horizontal
4. Gunting:
- Memotong obyek tanaman secara vertikal
5. Spatula (sendok):
- Mengambil dan meletakkan obyek tanaman asal biji/PLB
6. Api Bunsen:
- Sterilisasi peralatan tanam sebelum penanaman, bahan baker api bunsen berasal
dari spirtus.
7. Alkohol 96%:
- Sterilisasi peralatan tanam pra api Bunsen (hanya untuk perendaman alat).
8. Alkohol 70%:
- Sterilsasi tangan, tempat penanaman dan segala peralatan/bahan yang masuk ke
dalam tempat penanaman.
9. Petridish:
- Tempat untuk melakukan aktifitas pemotongan dan pemilihan obyek tanam untuk
tujuan tertentu.
10. Kertas kue/kertas bekas (alternative pengganti petridish):
- Tempat untuk melakukan aktifitas pemotongan dan pemilihan obyek tanam untuk
tujuan tertentu.
11. Aluminium Foil:
a. Penutup botol media penanaman
b. Membungkus kertas bahan untuk aktifitas



B. Tempat Penanaman (transfer)
Tempat untuk aktifitas penanaman (inisiasi dan pemilihan) dalam kondisi steril dari
patogen. Lebih dikenal dengan sebutan Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) = Kabin dengan
Udara Mengalir. Udara yang mengalir ini adalah udara yang steril dari patogen, karena
melalui beberapa filter/penyaring udara:
1. Pre Filter
- Menyaring udara dan partikel sampai berukuran 0,5 mikro meter.
2. HEPA (High Efficiency Particulate Air)
- Menyaring udara dan partikel sampai berukuran 0,2 mikro meter.
Prinsip kerja LAFC/Enkas adalah melalukan udara melalui pre filter dengan cara
menghisap udaradengan bantuan alat yang berfugsi sebagai blower dan
menghembuskan/meneruskan udara yang bertekanan ke HEPA. Selanjutnya dari HEPA
akan keluar udara yang steril yang bertekanan (untuk melawan arus udara dari luar masuk
ke dalam LAFC).
Komponen-komponen pendukung lain yang ada di dalam LAFC:
1. Lampu TL/TLD
- Penerangan pada saat aktifitas penanaman
2. Lampu UV (Ultra Violet)
- Sterilisasi lingkungan di dalam LAFC, minimal penggunaannya 30 menit sebelum
aktifitas penanaman.
Perhatian!!! Matikan UV sebelum aktifitas penanaman dimulai, pemaparan UV dalam
jangka waktu yang lama dapat merusak fungsi mata, iritasi kulit
Cara kerja penggunaan LAFC:
a. Persiapan I:
1. Hanya menyalakan lampu UV minimal 30 menit sebelum tanam.
b. Persiapan II:
1. Mematikan lampu UV dan menyalakan lampu TL/TLD pada panel.
2. Menghidupkan blower pada panel.
3. Melakukan sterilisasi di dalam LAFC (meja kerja dan dinding LAFC) dengan
menggunakan kertas tissue + alkohol 70%.
4. LAFC siap untuk digunakan.
c. Akhir Kerja:
1. Membersihkan meja kerja di dalam LAFC dengan kertas tissue + alkohol 70%.
2. Mematikan blower dan lampu TL/TDL pada panel.
3. Lampu UV tidak mutlak dinyalakan semalam.



C. Peralatan pembuatan media tanam dan sterilisasi:

1. Peralatan Pembuatan Media Tanam:
a. Peralatan Ukur
(1) Timbangan Analitis Digital (00,0000 mg)
- Menimbang bahan dengan kebutuhan < 0,000 mg.
(2) Timbangan Presisi Digital (0000,00 mg)
- Menimbang bahan dengan kebutuhan > 0,00 mg.
(3) pH Meter Digital
- Mengukur derajat keasaman media yang disarankan.
(4) Hot Plate dan Magnetic Stirrer Digital
 Hot Plate – Homogenasi media (melarutkan agar-agar di dalam media).
 Magnetic Stirrer – Mengaduk dan melarutkan bahan-bahan pembuat
media non agar-agar.
b. Peralatan Gelas dan Distribusi
(1) Botol Erlenmeyer 2-4 liter
- Wadah untuk menampung campuran bahan pembuat media dan pada saat
homogenasi media.
(2) Beaker Plastik 1 liter dan 100 ml
- Wadah untuk distribusi media ke dalam masing-masing gelas kultur.
c. Bahan-bahan Pendukung
(1) Aluminium Foil
- Bahan untuk menutup botol kultur saat sterilisasi dan botol
erlenmeyer pada saat homogenasi.
(2) Plastik Tahan Autoclave (alternative pengganti aluminium foil)

2. Peralatan Sterilisasi
Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi
dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat
digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital
(terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang
ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api
Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah
panas dari api.
Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara
manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan:
sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan



problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf
listrik yang seukuran dan setaraf.
Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya
dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik.
Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah
bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan
kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga
berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.
Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan
sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam
waktu sterilisasi, serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai,
temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20
menit. Pada autoklaf yang programmable, panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada
autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air.
Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi
(pound per square inci) atau 1 atm.
Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan
selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang
disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari
pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada
laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.
Komponen-komponen utama autoklaf:
(1) Pressure Gauge (Pengukur Tekanan Gas/Uap)
- Tekanan yang disarankan 1.05-1.2 kg/cm2.
(2) Thermometer (Pengukur Suhu)
- Suhu yang disarankan 121°-125°C.
(3) Exhaust Valve
a) Saat sterilisasi dimulai, valve dibuka sampai ada uap air yang keluar dan menetes
kemudian valve ditutup, tujuannya untuk kesempurnaan sterilisasi (pada saat
valve dibuka gas/udara yang tidak steril keluar).



(b) Setelah sterilisasi selesai (tekanan menunjukkan angka 0), valve dibuka kembali
untuk mengeluarkan gas/uap yang tersisa.
(4) Automatic Pressure Regulating Valve (Safety Valve)
- Menjaga tekanan uap/gas tetap pada tekanan yang disarankan.
Perhatian!!! Sebelum mengoperasikan autoclave, terlebih dahulu melihat kondisi air di
dalam autoclave. Bila air masih tersedia dan pada posisi di bawah plat maka autoclave
dapat dioperasikan, tetapi bila air berkurang segera ditambahkan air sampai di bawah
plat. Bila posis air kurang dan proses sterilisasi berjalan lama maka kemungkinan yang
terjadi elemen akan bocor dan rusak bahkan media akan akan rusak.
3. Teknik Sterilisasi
Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam
wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih
efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada
tekanan 15 psi. atau 1 atm.
Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi
dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan
waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml
media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada
tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu
yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4
liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi
aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak
boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan
didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).
Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan
dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter
filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk
volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang
heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.

a. Sterilisasi Peralatan Kultur

1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau
aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil). Untuk botol-botol
yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena
selama pemanasan terjadi pemuaian.



2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,
gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.
3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam
baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan
dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus,
karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset,
gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam
bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.
4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.
5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang
akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121o C pada tekanan 15 psi
(pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu
sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.
Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam
dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga
disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk
skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade)
dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata
pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

b. Sterilisasi menggunakan Oven

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya
disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan
dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat langsung
digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut
botol harus ditutup dengan alumunium foil.

II. CARA KERJA
1. Amati peralatan yang digunakan dalam praktikum kultur jaringan!
2. Sterilisasi alat-alat yang digunakan dengan teknik yang telah dipelajari!
3. Untuk laporan, gambar (foto) alat sertakan dengan fungsinya! Untuk peralatan listrik
sertakan pula cara kerja alat atersebut!



III. TUGAS LAPORAN PRAKTIKUM
1. Sebutkan alat tanam yang dipergunakan di dalam kultur jaringan tanaman!
2. Jelaskan fungsi penggunaan: a. Scalpel; b. Gunting; c. Spatula!
3. Bagaimana prinsip kerja LAFC!
4. Bagaimana cara kerja mempersiapkan LAFC untuk penanaman?
5. Jelaskan perbedaan lampu TL/TLD dan UV!

6. Sebutkan alat-alat yang digunakan untuk membuat media!
7. Jelaskan suhu dan tekanan yang disarankan untuk sterilisasi dan alasan
menggunakan suhu tersebut.
8. Jelaskan metode sterilisasi yang digunakan untuk media.
9. Bagaimana cara kerja mempersiapkan autoclave sebelum dioperasikan?
10. Jelaskan komponen-komponen utama autoclave!


Praktikum 1 kuljar

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (6)

Similar to Praktikum 1 kuljar

Similar to Praktikum 1 kuljar (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Praktikum 1 kuljar