1. TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE
GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
SECRETARIA DO ESTADO DA EDUCAÇÃO, DA CULTURA E DOS DESPORTOS - SECD
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE - UERN
FACULDADE DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – FANAT
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – DECB
DISCIPLINA: GENÉTICA BÁSICA
2. CONCEITOS BÁSICOS
• Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da
década de 70 quando foram descobertas as
endonucleases de restrição ou enzimas de
restrição.
• Conjunto de técnicas que permitem a
manipulação de moléculas de DNA,
considerando seqüências específicas, com a
perpetuação de tal seqüência in vivo.
4. CONCEITO DE CLONAGEM
MOLECULAR
• A origem do termo clonagem vem da Genética
Bacteriana.
• A técnica central do DNA recombinante é a
clonagem molecular
• Consiste no isolamento e propagação de
moléculas de DNA idênticas.
5. • Estágios da Clonagem molecular
Vetorr
DNA
recombinante
Transformação
transformante ou
célula
transformada
Inserto
6.
7. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Enzimas Especializadas em degradar DNA
exógeno em bactérias.
• Função: reconhecer e clivar um DNA estranho.
• Sistema de restrição e modificação.
8. Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e
propagar o DNA recombinante:
• Endonucleases de restrição.
• DNA ligases
9.
10. • Existem três tipos de endonucleases de
restrição: I, II e III;
• I e II geralmente grandes complexos com
múltiplas subunidades contendo tanto a
atividade endonucleásica como metilase; sua
clivagem é aleatória;
• III cliva o DNA a cerca de 25pb da seqüência
de reconhecimento.
11. Há 2 tipos distintos de clivagens:
• Extremidades abruptas: os dois cortes
ocorrem no eixo de simetria da seqüência
específica.
• Extremidades coesivas: os cortes são feitos
simetricamente, porém, fora do eixo de
simetria.
12. • EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que
carrega um fator de transferência de
resistência RI.
• Hind III é isolada da Haemophilus influenzae,
linhagem d III.
16. DNA LIGASE
• Promove a ligação dos fragmentos de DNA em
vetores previamente clivados por
endonucleases de restrição.
17. Junção de duas fitas de DNA
A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de
DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia
18. CONSTRUÇÃO DO DNA
RECOMBINANTE
Ela atua na clonagem molecular unindo o
fragmento de interesse ao vetor utilizado,
formando um híbrido vetor/fragmento.
A função das ligases na célula é
reparar quebras em fitas individuais,
que surgem em moléculas de DNA de
fita dupla durante a replicação do DNA
19. Fragmentos de DNA
• Fragmentos com extremidades coesivas;
• Fragmentos com extremidades não coesivas;
20. A. Adição de polidesoxiadenina na extremidade
3’ de um fragmento de DNA, e
polidesoxitimina na extremidade 3’ de um
outro fragmento de DNA;
B. Adição de adaptadores às extremidades não
coesivas.
21. CLONAGEM
Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser
transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).
22. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser
transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior
tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.
24. CLONAGEM
- As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de
cálcio seguido de um choque térmico de curta duração.
- Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da
membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela
membrana no momento do choque térmico.
25.
26. Vetor - Conceito
• Um vetor pode definir-se como um agente
capaz de promover uma ou mais etapas no
processo global de transferência de material
genético.
• Plasmídeos
• Bacteriófago λ
• BACs
27.
28.
29.
30.
31. VETORES UTILIZADOS EM ANIMAIS
Lipossomos
Retrovírus ( integram seu DNA ao do
hospedeiro)
Adenovírus
Microinjeção pronuclear
Transferência de genes por bombardeamento
de partículas (biobalística)
33. VETORES RETROVIRAIS
• Transcriptase reversa
(RNA – DNA) e integrase;
• Retrovírus: seqüências
LTR e ψ e gene
exógeno;
• Vírus assistentes
Genes gag,pol e env(
sem ψ – requerida para
o empacotamento )
