1. SEMINARIO: FUNDAMENTO Y
PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE
WESTERN BLOT
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
CÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS II
INTEGRANTES:

2. INTRODUCCI
ÓN
EXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA

3. WESTERN BLOT
 El Western blot, o
inmunoblot, es una
técnica analítica usada
para detectar proteínas
específicas en una
muestra determinada.
Mediante una
electroforesis en gel se
separan las proteínas.
 Las proteínas son
transferidas desde el gel a
la membrana
electroforéticamente.

5. WESTERN
BLOT-
METODOS

6. Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa
Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia
Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la
membrana de nitrocelulosa
Incubacion con el anticuerpo especifico primario
Lavados del anticuerpo no unido
Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a
perroxidasa de rabano picante (HRP)
Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas
radiograficas

7. Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de las muestras de proteínas:
-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como
beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S-
-El SDS aporta cargas negativas
-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel
de acuerdo a su peso molecular
Proteínas ya corriendo
en el gel
Fuente de poder
Muestra de proteínas
para cargar en el gel

8. Transferencia de las proteinas a
las membranas
 Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de tal
forma que pueden servir como soporte para inmunoensayos,
tinciones y otros análisis en fase sólida. Las proteínas unidas a
dichas membranas mantienen su antigenicidad y son accesibles a
sondas.
 En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel de
acrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel, dichas proteínas
son electrotransferidas desde el gel hasta una membrana
adyacente de nitrocelulosa o PVDF, aplicando un campo eléctrico.
 La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de aparatos y
por tanto de dos formas diferentes: transferencia húmeda, en
aparatos que poseen cámaras que se llenan de tampón y
transferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámaras
y por tanto no necesitan tal cantidad de tampón.

9. Transferencia de las proteinas a
las membranas

10. Secuencia del Western blot
Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas
Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Se quitan las burbujas para asegurar
la correcta transferencia
Se detiene la corrida electroforetica
Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar
el gel con las proteinas separadas por masa

11. Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios no ocupados en la
membrana con proteína inerte (ej.
Albúmina)
Incubar con anticuerpo primario
Incubar con anticuerpo secundario
marcado con HRP
Incubar con sustrato especifico
Proteína de interes se ve como una banda
oscura
Revelado quimioluminiscente
Paso 4
Revelado y análisis:

12. Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato enzima H2O2 producto
coloreado
quimioLum Obs
luminol HRP si no si muy sensible
3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxico
DAB+niquel HRP si negro no toxico, mas
sensible que
DAB
3,3´,5, 5´
tetrametilbencidina
HRP si azul no producto
semisoluble
4 cloro naftol HRP si azul-negro no poco
sensible
Bromocloroindolil
fostato +NBT
FAL no azul no reaccion
lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato
+ Fast red
FAL no rojo no poco
sensible
AP/misty purple FAL no purpura no muy estable
HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina

13. WESTERN
BLOT-
FUNDAMENT
OS

14. ELECTROFORESIS
 Para entender la técnica del Western Blot es
necesario comprender que es una electroforesis y en
que se basa.
 Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si
se aplica un campo eléctrico a una solución que
contenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a
una velocidad que dependerá de su carga neta, forma
y peso molecular. Esta técnica es conocida como
electroforesis.
 Las separaciones electroforéticas se realizan casi
siempre en soportes sólidos, generalmente para
separar una mezcla de proteínas, el soporte de
elección son los geles de poliacrilamida.

16. Western Blot
 La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o
Western blot) es un sistema rápido y muy sensible
para la detección y caracterización de proteínas que
se basa en la especificidad de reconocimiento entre
antígeno y anticuerpo. Implica la separación por
electroforesis en geles de poliacrilamida y una
transferencia cuantitativa e irreversible a una
membrana, de las proteínas de una mezcla compleja
(lisado total celular). Los antígenos que se han
transferido a la membrana son reconocidos por
anticuerpos monoclonales policlonales específicos
de ellos.

17. TIPOS
• Se puede hablar de tipos de western blot
según el tipo de detección de las proteínas.
Directo:
• El anticuerpo primario marcado se une al
antígeno de la membrana y reacciona con el
sustrato originando una señal detectable. En
el método directo de detección, el anticuerpo
primario que se utiliza para detectar el
antígeno sobre la superficie de la membrana,
debe ir marcado con una enzima

18. MÉTODO DIRECTO

19. Indirecto
• El anticuerpo primario sin marcar reacciona
con el antígeno. Luego, un anticuerpo
secundario marcado se une al primario y
reacciona con el sustrato. En el método
indirecto, se añade primero un anticuerpo
primario sin marcar contra el antígeno de la
superficie de la membrana; posteriormente se
añade un anticuerpo secundario marcado
contra el anticuerpo primario.

20. MÉTODO INDIRECTO

21. PROCEDIMIENTO

22. El procedimiento de 'blotting'
consta de 5 etapas:
1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente
mediante
electrotransferencia.
Se construye lo que se conoce
como sándwich, donde se
apilan sucesivamente una
esponja plana, papel
absorbente, el gel, la
membrana sintética, más
papel y finalmente otra
esponja plana.

23. 2- Saturación de todos los lugares de unión de
proteínas de la membrana no ocupados para evitar la
unión no específica de anticuerpos.
 “Bloqueo de la membrana”, para prevenir la unión inespecífica de
los anticuerpos a otras proteinasla membrana, con el riesgo
asociado de tener un elevado “background” o falsos positivos.
3- Incubación del 'blot' con anticuerpos primarios
contra la/s proteína/s de interés.
Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blot
dependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos
disponibles para ese antígeno en concreto.

24. 4- Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o
reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario
unido a enzimas u otros marcadores.
 Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que
reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario).
5-Sistema de revelado de las bandas de proteínas
marcadas con el complejo de anticuerpos.

25. Lavado de la membrana.
 Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie
de pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones de
bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos
lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no
unidos

26. APLICACIONE
S
EXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁN
SOLANO

27. diagnóstico
 Se usa principalmente para determinar la
presencia o ausencia de una proteína
concreta en una muestra. También nos
puede ser útil para determinar los niveles
de dicha proteína en esa muestra, o el
tamaño de esta proteína, ya que en
determinadas enfermedades el problema
no es la ausencia total de una molécula
sino su reducción o la expresión de una
forma truncada de dicha proteína.

28. - Enfermedades Inflamatorias
- Enfermedades Infecto-Contagiosas
- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
- Factores de Crecimiento
- Proteínas de Secreción
- Enfermedades Infecto-Contagiosas
- Enfermedades Inflamatorias
- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
- Factores de Crecimiento
- Proteínas de Secreción
diagnóstico

29.  Prueba de VIH
 Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA,
el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el
ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de
riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es
muy baja.
 Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH
en una muestra de suero humano. Se transfieren a una
membrana las proteínas de células que, se sabe, están
infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay
que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a
la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos
anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel de
anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no
unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo
secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La
aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra
las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es
decir, el paciente es seropositivo.
diagnóstico

30.  Se emplea como prueba definitiva de
la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las
vacas locas".
 Algunas clases de la prueba para
la enfermedad de Lyme usan el Western
blot.
 En veterinaria, ocasionalmente se emplea
el Western blot para confirmar la
presencia del FIV en gatos.
diagnóstico

31. Actualmente, el Western Blot es una de las
técnicas más usadas en el estudio de la biología
molecular.
INVESTIGACIÓN

32. investigación
 Con ella se pueden determinar los niveles de
una proteína antes y después de un
tratamiento, su nivel de fosforilación u otras
modificaciones post-traduccionales, etc.

33. Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western,
eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y reducir los tiempos
de incubación con los anticuerpos
Fast Western Blot

34. técnicas relacionadas
 La principal razón para transferir y
adsorber las proteínas a una membrana
para su posterior detección con un
anticuerpo es que las proteínas en la
membrana se encuentran en la superficie
y, por lo tanto, más accesibles a los
anticuerpos que si estuvieran imbuidas en
un gel de poliacrilamida.
 No obstante, en los últimos años se ha
desarrollado la posibilidad de realizar la
detección de las proteínas dentro del
propio gel sin perdida de sensibilidad; esta
técnica conocida como “UnBlot® In-Gel
Detection” elimina la necesidad de realizar
los pasos de transferencia y bloqueo y,
además, permite la detección de proteínas
que no se transfieren con eficiencia desde
el gel a la membrana y evita las perdidas
de proteínas durante el propio paso de
transferencia.
 Una modificación de la técnica de Western
Blot es su utilización para la búsqueda de
interacciones entre proteínas.
 La técnica “Far-Western Blot” utiliza una
proteína marcada en lugar de un
anticuerpo como sonda en la membrana,
la cual reconoce y se une a las proteínas
de la membrana a través de interacciones
proteína–proteína, por lo que si se genera
señal en la membrana, indica la presencia
de una proteína que interacciona con la
proteína-sonda y, además, que dicha
proteína posee el peso molecular
correspondiente a la banda donde se
observa la señal.
 Este método se suele utilizar para buscar
interacciones desconocidas entre
proteínas o para confirmar posibles
interacciones
Detección en el propio gel
(“UnBlot® In-Gel Detection”)
Far-Western Blot Detection

35. Far-Western Blot Detection
técnicas relacionadas