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SEMINARIO: FUNDAMENTO Y
PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE
WESTERN BLOT
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
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INTRODUCCI
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EXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA
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 El Western blot, o
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METODOS
Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana...
Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
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-Las proteínas se desnaturalizan c...
Transferencia de las proteinas a
las membranas
 Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de tal
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las membranas
Secuencia del Western blot
Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2
-Las proteínas separadas por tamaño se tr...
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Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios no ocupados en ...
Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato enzima H2O2 producto
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FUNDAMENT
OS
ELECTROFORESIS
 Para entender la técnica del Western Blot es
necesario comprender que es una electroforesis y en
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Western Blot
 La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o
Western blot) es un sistema rápido y muy sensible
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TIPOS
• Se puede hablar de tipos de western blot
según el tipo de detección de las proteínas.
Directo:
• El anticuerpo pri...
MÉTODO DIRECTO
Indirecto
• El anticuerpo primario sin marcar reacciona
con el antígeno. Luego, un anticuerpo
secundario marcado se une al...
MÉTODO INDIRECTO
PROCEDIMIENTO
El procedimiento de 'blotting'
consta de 5 etapas:
1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente
mediante...
2- Saturación de todos los lugares de unión de
proteínas de la membrana no ocupados para evitar la
unión no específica de ...
4- Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o
reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario
unido ...
Lavado de la membrana.
 Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie
de pasos de incubación con difere...
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EXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁN
SOLANO
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 Se usa principalmente para determinar la
presencia o ausencia de una proteína
concreta en una muestra. Tambi...
- Enfermedades Inflamatorias
- Enfermedades Infecto-Contagiosas
- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
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 Prueba de VIH
 Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA,
el Western Blot se usa como prueba confirmator...
 Se emplea como prueba definitiva de
la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las
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Actualmente, el Western Blot es una de las
técnicas más usadas en el estudio de la biología
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INVESTIGACIÓN
investigación
 Con ella se pueden determinar los niveles de
una proteína antes y después de un
tratamiento, su nivel de f...
Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western,
eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y...
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 La principal razón para transferir y
adsorber las proteínas a una membrana
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FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT

  1. 1. SEMINARIO: FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA CÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS II INTEGRANTES:
  2. 2. INTRODUCCI ÓN EXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA
  3. 3. WESTERN BLOT  El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas.  Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente.
  4. 4. WESTERN BLOT- METODOS
  5. 5. Secuencia del Western blot Electroforesis de la muestra con las proteinas Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosa Incubacion con el anticuerpo especifico primario Lavados del anticuerpo no unido Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP) Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas
  6. 6. Secuencia del Western blot – Paso 1 Paso 1 Electroforesis de las muestras de proteínas: -Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S- -El SDS aporta cargas negativas -Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular Proteínas ya corriendo en el gel Fuente de poder Muestra de proteínas para cargar en el gel
  7. 7. Transferencia de las proteinas a las membranas  Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de tal forma que pueden servir como soporte para inmunoensayos, tinciones y otros análisis en fase sólida. Las proteínas unidas a dichas membranas mantienen su antigenicidad y son accesibles a sondas.  En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel de acrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel, dichas proteínas son electrotransferidas desde el gel hasta una membrana adyacente de nitrocelulosa o PVDF, aplicando un campo eléctrico.  La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de aparatos y por tanto de dos formas diferentes: transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras que se llenan de tampón y transferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámaras y por tanto no necesitan tal cantidad de tampón.
  8. 8. Transferencia de las proteinas a las membranas
  9. 9. Secuencia del Western blot Transferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2 -Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa -Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia Se quitan las burbujas para asegurar la correcta transferencia Se detiene la corrida electroforetica Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar el gel con las proteinas separadas por masa
  10. 10. Paso 3 Incubación con anticuerpos específicos y revelado: Proteína sobre la membrana Bloqueo de los sitios no ocupados en la membrana con proteína inerte (ej. Albúmina) Incubar con anticuerpo primario Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP Incubar con sustrato especifico Proteína de interes se ve como una banda oscura Revelado quimioluminiscente Paso 4 Revelado y análisis:
  11. 11. Existen otras tecnicas de revelado de WB sustrato enzima H2O2 producto coloreado quimioLum Obs luminol HRP si no si muy sensible 3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxico DAB+niquel HRP si negro no toxico, mas sensible que DAB 3,3´,5, 5´ tetrametilbencidina HRP si azul no producto semisoluble 4 cloro naftol HRP si azul-negro no poco sensible Bromocloroindolil fostato +NBT FAL no azul no reaccion lenta y progresiva Naftol-AS-MX fosfato + Fast red FAL no rojo no poco sensible AP/misty purple FAL no purpura no muy estable HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina
  12. 12. WESTERN BLOT- FUNDAMENT OS
  13. 13. ELECTROFORESIS  Para entender la técnica del Western Blot es necesario comprender que es una electroforesis y en que se basa.  Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo eléctrico a una solución que contenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que dependerá de su carga neta, forma y peso molecular. Esta técnica es conocida como electroforesis.  Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre en soportes sólidos, generalmente para separar una mezcla de proteínas, el soporte de elección son los geles de poliacrilamida.
  14. 14. Western Blot  La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o Western blot) es un sistema rápido y muy sensible para la detección y caracterización de proteínas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana, de las proteínas de una mezcla compleja (lisado total celular). Los antígenos que se han transferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales policlonales específicos de ellos.
  15. 15. TIPOS • Se puede hablar de tipos de western blot según el tipo de detección de las proteínas. Directo: • El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable. En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima
  16. 16. MÉTODO DIRECTO
  17. 17. Indirecto • El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el método indirecto, se añade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.
  18. 18. MÉTODO INDIRECTO
  19. 19. PROCEDIMIENTO
  20. 20. El procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas: 1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente mediante electrotransferencia. Se construye lo que se conoce como sándwich, donde se apilan sucesivamente una esponja plana, papel absorbente, el gel, la membrana sintética, más papel y finalmente otra esponja plana.
  21. 21. 2- Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos.  “Bloqueo de la membrana”, para prevenir la unión inespecífica de los anticuerpos a otras proteinasla membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado “background” o falsos positivos. 3- Incubación del 'blot' con anticuerpos primarios contra la/s proteína/s de interés. Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blot dependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antígeno en concreto.
  22. 22. 4- Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores.  Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario). 5-Sistema de revelado de las bandas de proteínas marcadas con el complejo de anticuerpos.
  23. 23. Lavado de la membrana.  Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie de pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones de bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos
  24. 24. APLICACIONE S EXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁN SOLANO
  25. 25. diagnóstico  Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra. También nos puede ser útil para determinar los niveles de dicha proteína en esa muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en determinadas enfermedades el problema no es la ausencia total de una molécula sino su reducción o la expresión de una forma truncada de dicha proteína.
  26. 26. - Enfermedades Inflamatorias - Enfermedades Infecto-Contagiosas - Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales - Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción - Enfermedades Infecto-Contagiosas - Enfermedades Inflamatorias - Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales - Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción diagnóstico
  27. 27.  Prueba de VIH  Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja.  Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. diagnóstico
  28. 28.  Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".  Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.  En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos. diagnóstico
  29. 29. Actualmente, el Western Blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular. INVESTIGACIÓN
  30. 30. investigación  Con ella se pueden determinar los niveles de una proteína antes y después de un tratamiento, su nivel de fosforilación u otras modificaciones post-traduccionales, etc.
  31. 31. Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western, eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y reducir los tiempos de incubación con los anticuerpos Fast Western Blot
  32. 32. técnicas relacionadas  La principal razón para transferir y adsorber las proteínas a una membrana para su posterior detección con un anticuerpo es que las proteínas en la membrana se encuentran en la superficie y, por lo tanto, más accesibles a los anticuerpos que si estuvieran imbuidas en un gel de poliacrilamida.  No obstante, en los últimos años se ha desarrollado la posibilidad de realizar la detección de las proteínas dentro del propio gel sin perdida de sensibilidad; esta técnica conocida como “UnBlot® In-Gel Detection” elimina la necesidad de realizar los pasos de transferencia y bloqueo y, además, permite la detección de proteínas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana y evita las perdidas de proteínas durante el propio paso de transferencia.  Una modificación de la técnica de Western Blot es su utilización para la búsqueda de interacciones entre proteínas.  La técnica “Far-Western Blot” utiliza una proteína marcada en lugar de un anticuerpo como sonda en la membrana, la cual reconoce y se une a las proteínas de la membrana a través de interacciones proteína–proteína, por lo que si se genera señal en la membrana, indica la presencia de una proteína que interacciona con la proteína-sonda y, además, que dicha proteína posee el peso molecular correspondiente a la banda donde se observa la señal.  Este método se suele utilizar para buscar interacciones desconocidas entre proteínas o para confirmar posibles interacciones Detección en el propio gel (“UnBlot® In-Gel Detection”) Far-Western Blot Detection
  33. 33. Far-Western Blot Detection técnicas relacionadas
  • AlexisFlores112

    Apr. 22, 2020
  • sheindri99

    Aug. 1, 2019
  • fevicgr

    May. 2, 2019
  • Marinoquispe

    Nov. 21, 2018
  • KarlaOrtiz75

    Sep. 9, 2018
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    Jan. 21, 2018
  • DannSandoval

    Jan. 21, 2018
  • DannSandoval

    Jan. 21, 2018
  • DannSandoval

    Jan. 21, 2018
  • DannSandoval

    Jan. 21, 2018
  • KarlitaNolascoMachicao

    Jan. 15, 2018
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    Sep. 29, 2017
  • AzucenaBrenes

    Aug. 14, 2017
  • pilarcredondo9

    Aug. 1, 2017
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    Jul. 5, 2017
  • punisher818

    May. 29, 2017
  • ThelmaFonseca

    May. 17, 2017
  • leiro2434

    Apr. 7, 2017
  • AnielkaBlanchardTorres

    Jul. 16, 2016
  • DanielAcevedoRivera

    Jun. 14, 2016

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