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DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE
      LA TUBERCULOSIS


    BACILOSCOPIA
     LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN

     Blgo. DANIEL FERNANDO ESTRELLA TORERO
• La baciloscopia es la técnica de elección para
  el diagnóstico rápido y el control del
  tratamiento de la tuberculosis pulmonar del
  adulto.
• Es simple, económica y eficiente para detectar
  los casos infecciosos.
• Es la herramienta fundamental de un
  programa de control de la tuberculosis
LA MUESTRA

El envase
• Boca ancha: de no menos
   de 50 mm de diámetro
• Capacidad entre 30 y 50
   ml
• Cierre hermético
• Material plástico,
   resistente a roturas.
Número de muestras y momento de la
           recolección
Para Diagnóstico

• Dos o tres muestras por SR, (aumenta
  probabilidad de detección).
• La primera muestra debe ser tomada en el
  momento de la consulta (muestra inmediata)
• La segunda muestra la debe recolectar el
  paciente en su casa por la mañana al
  despertar (muestra matinal).
• La tercera muestra, cuando sea requerida
Para Control

• Una muestra por mes de cada paciente de
  tuberculosis pulmonar con baciloscopia inicial
  positiva.
• Tomar al menos otra muestra para
  microscopía al finalizar el 4º mes (controlar la
  evolución del paciente y detectar un posible
  fracaso), y una al finalizar el tratamiento para
  confirmar la curación.
Obtención espontánea del esputo
• El primer paso para
  asegurar la calidad de
  la         baciloscopia
  consiste en explicar al
  SR,     con      mucha
  claridad,            la
  importancia         de
  examinar muestras de
  esputo, la necesidad
  de recolectar esputo y
  no saliva.
Calidad de la muestra
          • La muestra de esputo
            mucopurulenta,
            proveniente de árbol
            bronquial, es la que
            asegura        mayor
            probabilidad de que
            se puedan observar
            bacilos
Calidad de la muestra
• Una buena muestra tiene aproximadamente 3
  a 5ml, es generalmente espesa y mucoide.
  Puede ser fluida con partículas de material
  purulento. El color es variable (blanco,
  amarillento y hasta verdoso).
Otras muestras
• Orina
• Líquido cefalorraquideo
• Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, articular
  y otros
• Biopsias
• Pus
CONSERVACION Y TRANSPORTE DE
           MUESTRAS
• Es conveniente procesar la muestra para
  baciloscopía o para cultivo el mismo día de la
  recolección. Si esto no es posible, conservarla
  siempre en refrigeración (4 °C no congelar) o
  en un lugar fresco, protegido de la luz y no por
  más de cinco días.
CONSERVACION Y TRANSPORTE DE
              MUESTRAS
• Utilizar una caja de metal o de
   plástico opaco, con algún
   mecanismo que trabe su tapa, y
   con una manija para facilitar su
   acarreo.
• Evitar:
a) Exposición al calor excesivo.
b) Exposición a la luz solar
   directa.
c) Derrame del contenido del
   envase.
RECEPCION DE MUESTRAS
a) Comprobar que las muestras estén bien
    rotuladas (la etiqueta con los datos del
    paciente deberá estar colocada en el cuerpo
    del envase y no en la tapa) y que
    corresponda a lo asentado en la solicitud.
b) Limpiar el envase con fenol al 5% si existe
    un pequeño derrame del contenido. Si el
    derrame es masivo desechar la muestra por
    incineración o esterilización en autoclave.
c) Evaluar la calidad y cantidad de la muestra,
    capturar dicha información en el cuaderno
    de registro de laboratorio y en la sección
    apropiada de la solicitud de baciloscopía.
d) Notificar deficiencias en su identificación,
    calidad, cantidad o forma de envío. Si este
    es el caso, solicitar una nueva muestra.
LA BACILOSCOPIA
    Técnica: Coloración de Ziehl-Neelsen
    Fundamento:
    • Se basa en la capacidad de las
      micobacterias para incorporar y
      retener ciertos colorantes (fucsina
      fenicada) ante la acción de ácido y
      alcohol, propiedad conocida como
      ácido-alcohol-resistencia. Debido al
      alto    contenido      en    lípidos,
      particularmente       los      ácidos
      micólicos de la pared celular.
Lugar de trabajo y materiales
• Se recomienda que sea un
   área exclusiva
Los requisitos mínimos del
   laboratorio son:
• Buena iluminación
• Ventanas o extractor para
   renovar el aire una vez
   finalizado el trabajo.
• Paredes y pisos lavables,
   que        puedan       ser
   desinfectados con solución
   de hipoclorito de sodio
Lugar de trabajo y materiales
              • Una mesa para colocar las
                 muestras que se reciban y
                 realizar los extendidos, con
                 dimensiones mínimas de 1 x
                 0,50 m, en lo posible cubierta
                 con material liso y resistente a
                 soluciones germicidas (fórmica,
                 acero inoxidable o materiales
                 similares).
              • Un lavadero con fuente de agua
                 y desagüe, en el que se pueda
                 lavar las manos y realizar la
                 tinción.
              • Una repisa o armario para los
                 reactivos, portaobjetos y demás
                 materiales.
Lugar de trabajo y materiales

             • Una mesa para el microscopio.

             • Una mesa para escribir los informes y
             los registros del laboratorio
Equipo mínimo necesario
EPP:
• batas o guardapolvos de uso
   exclusivo para cada persona que
   realice baciloscopia.
• Respirador N95
• Guantes
Equipo mínimo necesario
•   Microscopio binocular con
                                       •   Aplicadores de madera.
    oculares 10x, 40x y lente
    objetivo de inmersión 100x en      •   Portaobjetos.
    excelentes condiciones de          •   Varillas de vidrio para soporte de
    funcionamiento.                        la tinción (puente).
•   Mechero de gas                     •   Hisopos de algodón.
•   Material de vidrio (matraces,      •   Soluciones antisepticas: Frasco
    probetas pipetas, etc.).               con fenol al 5%
•   Pizetas, embudos, lápiz de punta   •   Recipientes para eliminación de
    de diamante.                           material contaminado.
•    Frascos para soluciones           •   Gradillas para láminas.
    colorantes y reactivos             •   Aceite de inmersión.
    preparados.                        •   Papel lente.
•   Gasa o papel para cubrir el área   •   Papel filtro.
    de trabajo.
•   Envases para muestras.
Reactivos y colorantes
a) Fucsina fenicada.
Para 1000 ml:
Fucsina básica..................................................................3 g
Alcohol de 95 ...............................................................100 ml
Fenol acuoso*………………………………………………………….55 ml
(Completar a 1000ml).
b) Solución decolorante: (alcohol ácido).
Para 1000 ml:
Ácido clorhídrico..............................................................30 ml
Alcohol de 95 ................................................................970 ml
c) Azul de metileno.
Para 1000 ml:
Azul de metileno................................................................1 g
Agua destilada 1000 ml
Preparación del extendido
“Para este examen se deben usar sólo
  portaobjetos nuevos, los rayados o
  viejos pueden producir como resultado
  falsos positivos.”
Preparación del extendido
• Ordenar las muestras
• Rotular portaobjetos con el
  número único de la
  muestra de acuerdo al
  orden     progresivo     del
  registro de laboratorio.
• Preparar los aplicadores
Preparación del extendido
• Para evitar confusiones,
  colocar frente al operador
  solo la muestra y el
  portaobjeto que se va a
  procesar.

• Destapar el envase de la
  muestra, colocándolo junto
  a la laminilla que ha sido
  marcada con el mismo
  número de identificación
  que la muestra
Preparación del extendido
• Usar un aplicador o palillo
  de madera al que
  previamente se le ha
  quebrado uno de los
  extremos (captura el
  material mucopurulento y
  trasladarlo al portaobjetos)

• Abrir el envase atrás del
  mechero y colectar con el
  palillo de madera la
  fracción útil. (mayor
  posibilidad de encontrar
  bacilos).
Preparación del extendido
• Hacer un frotis de 2 cm
  de largo x 1 cm de
  ancho, haciendo
  movimientos circulares
  para obtener una
  película uniforme
Preparación del extendido
•   No debe ser demasiado grueso
    ni demasiado delgado. En
    ambos casos se dificulta la
    tinción y la lectura microscópica
•   Desechar el aplicador de madera
    en un frasco que contenga fenol
    al 5%. Usar un aplicador
    diferente para cada muestra de
    esputo aunque sean del mismo
    paciente.
•   Dejar secar a temperatura
    ambiente. Nunca se debe
    calentar la laminilla mientras
    está húmedo el frotis. Hacerlo
    produce aerosoles peligrosos
    para el operador.
Preparación del extendido
•   Solo después que el extendido
    se ha secado, fijar el frotis
    pasando la laminilla sobre la
    flama del mechero con suavidad
    2 o 3 veces, evitando el
    sobrecalentamiento



Fijación deficiente = falso
   negativa.

Calentar demasiado = alterar
  la estructura de los bacilos.
Preparación del extendido
• Si es muy grueso, el
  extendido        puede
  barrerse durante el
  proceso de tinción.

• Por lo general, cuando
  es del grosor adecuado,
  se puede leer un
  periódico      colocado
  detrás de un extendido
  seco.
Preparación del extendido
• Al terminar, desinfectar el área de trabajo con fenol al
  5% y esterilizar el recipiente con los aplicadores y el
  papel o gasa usados sobre la mesa.

• Conservar las muestras hasta terminada la observación
  microscópica, en caso de que sea necesario repetir el
  extendido, la tinción o la observación al microscopio.

•    Solo cuando estos procedimientos se han completado
    satisfactoriamente, los contenedores con las muestras
    se esterilizan y desechan.
Tinción

Técnica de Ziehl Neelsen
Coloración
• Se recomienda teñir como máximo
  12 frotis en cada oportunidad para
  lograr una coloración uniforme
•   Colocar los frotis, conservando el
  orden numérico sobre las varillas
  de vidrio (distancia mínima
  aproximada de 5 mm – 10mm -
  para evitar contaminación por
  arrastre)
Coloración
• Cubrir totalmente la
  superficie del extendido
  con      fucsina     básica
  fenicada recién filtrada.
  Dispensar el colorante
  con suavidad, sin salpicar
  y sin tocar con el gotero.
Coloración
• Con la llama de un hisopo
  embebido en alcohol calentar
  suavemente por debajo de los
  extendidos, con movimientos
  de vaivén, hasta que observe
  que se desprenden los primeros
  vapores blancos. No calentar
  con mechero.
• En caso de derrame del
  colorante, reponer la fucsina,
  no dejar secar el preparado.
• Calentar tres veces hasta la
  emisión de vapores. Dejar
  reposar 5 min.
Coloración
• Enjuagar con abundante agua.
  Cuidadosamente la superficie
  eliminando totalmente la solución
  de fucsina. Girar el extendido y
  lavar con cuidado también la parte
  posterior
• Inclinar el portaobjetos para
  eliminar el exceso de agua (evitar
   diluir los reactivos que se
   utilizarán a continuación).
Decoloración
   • Cubrir la totalidad del extendido
    con solución decolorante y dejar
    actuar 3 minutos
  • Enjuagar con abundante agua.
 • Verificar que el extendido se ha
    decolorado (las partes más gruesas
    del extendido a lo sumo conservan
    un leve tinte rosado). “Si se
    observan     cúmulos     rojos    o
    coloración rosada intensa, volver a
    cubrir con solución decolorante 1-3
    minutos” y enjuagar nuevamente.
• Eliminar el exceso de agua inclinando
    el portaobjetos
Coloración de fondo
• Cubrir todo el extendido con
 solución de azul de metileno.
  • Dejar actuar durante un
 minuto.
  • Enjuagar las láminas en
 ambas caras con agua a baja
 presión.
Coloración de fondo
• Limpiar la parte inferior con
  un algodón si ha quedado
  coloreada.
• Observar si las láminas
  conservan la numeración. Si
  no es así volver a numerarlas.
• Dejar secar las láminas a
  temperatura ambiente (no
  por    calentamiento).      No
  apoyar papel absorbente
  sobre el extendido.
OBSERVACION MICROSCÓPICA
  Y LECTURA DE EXTENDIDOS
La     observación microscópica
     debe cumplir principalmente
     dos objetivos:

• Determinar si en el extendido
   hay BAAR.
• Cuantifica la riqueza en
   bacilos.
Características morfológicas del
         bacilo de la tuberculosis
• De 1 y 10 μm de largo.
•Con la coloración de Ziehl
Neelsen se observan como
bastoncitos       delgados,
ligeramente curvos, rojo
fucsia,       destacándose
claramente contra el fondo
azul.
•Pueden         presentarse
aislados,    apareados    o
agrupados.
Observación microscópica
A. Colocar una gota de aceite
   de inmersión en el extremo
   izquierdo del frotis teñido.
B. Enfocar el portaobjetos con
   el lente objetivo de 40x
   antes de 100x
C. Después de encontrar el
   área adecuada, cambiar a la
   lente objetivo de 100x.
Observación microscópica
D. La lente objetivo no debe
tocar el portaobjetos (falsos
positivos).
E.Examinar sistemáticamente
100 campos útiles.
F. Después de observar un
campo           microscópico,
desplazar el portaobjetos
longitudinalmente para poder
examinar el campo contiguo.
Observación microscópica
             Campos útiles
•Aquel en el cual se observan
elementos     celulares    de
origen bronquial (leucocitos,
fibras mucosas y células
ciliadas).

•Los campos sin estos
elementos no deben ser
considerados para contar el
total de campos observados,
a menos que contengan
BAAR.
Observación microscópica
              Conteo de BAAR
•Contar el número de campos que
ha leído y el número de BAAR que
ha identificado.

•Se puede utilizar una cuadrícula
de 10 cuadrados por 10 cuadrados,
que representan los 100 campos
microscópicos, como ayuda para
registrar la cuenta.

•En cada cuadrado anotar el
número de BAAR que se observa.

•Si no observa BAAR consignar 0.
Reporte de resultados
Reporte de resultados




        Resultado: (No. de bacilos/No.
                    de campos)
        Resultado: (49/100) = 0.49
        Entonces: Positivo +
Reporte de resultados



    3       0       5       0       6       7       4       5       0       5

    4       0       0       5       7       0       6       0       0       4   Resultado: (No. de bacilos/No.
    4       6       0       0       5       7       5       5       0       6
                                                                                            de campos)
    0       5       7       5       0       0       6       0       6       0
                                                                                Resultado: (165/50) = 3.3
    6       0       7       0       5       0       6       7       0       6
                                                                                Entonces: Positivo ++
                                                                         

                                                                         

                                                                         

                                                                         
Reporte de resultados



15 13   0   9 16 20 10      0 18 15
0   20 15 11 17 16      0   18 20 17    Resultado: (No. de bacilos/No.
                                     
                                                    de campos)
                                     
                                     
                                        Resultado: (250/20) = 12.5
                                        Entonces: Positivo +++
                                     
                                     
                                     
                                     
Registrar el resultado
Qué hacer si es paucibacilar?

              -Leer 100 campos utiles más.
              -Si persiste el resultado,
              realizar otro extendido de una
              porción mas representativa.
              -Si persiste el resultado,
              anotar el hallazgo y enviar a
              cultivo.
              -Anotar      en    el    rubro
              Observaciones (Ej. 5 BAAR)
              -Solicitar nuevas mxs.
Algunas razones que causan resultados
         falsos positivos son:
  • Error al manejar la muestra o al
  registrar la información
  •Volver a usar recipientes o
  portaobjetos Positivos
  •Fucsina Fenicada sin filtrar
  •Aceite de inmersión contaminado
  •Decoloración incorrecta.
Algunas razones que causan resultados
        falsos negativos son:
  •Errores al manejar la muestra o al
  registrar información
  •Mala calidad del esputo
  •Decoloración excesiva
  •Lectura de menos de 100 campos
  microscópicos.
CONTROL DE CALIDAD DE LAS
    BACILOSCOPIAS


“Objetivo: elevar y mantener la
calidad de trabajo”.
•El control de calidad permite evaluar si la
información producida por el laboratorio es
precisa, reproducible y oportuna.
•Instaura un sistema de alarmas que permite
prevenir, descubrir y corregir errores

•Resulta más eficaz para detectar y asistir a
los casos de tuberculosis y para controlar la
enfermedad
Conservación de las láminas:
•Quitar el aceite presionando muy
suavemente sobre ellas un papel
absorbente.
•Sumergirlas en un recipiente con xilol o
alcohol 70%, durante no más de 30
segundos.
• Dejar secar al aire.
•Comprobar que la numeración esté visible
en las láminas.
•Guardarlas en cajas para láminas
portaobjetos, o dentro de una caja común
envueltas individualmente en papel, (en
paquetes rotulados con la fecha, en el orden
en que se realizaron).
• Conservarlas en lugar seco y fresco.
Conservación de las láminas:
       Laboratorios que procesan:
-Más de 100 bks por mes y con màs de 10 bks
positivos (diagnostico mas control) conservaran
todas la positivas y las dos negativas siguientes
-Más de 100 bks por mes y presentan menos de
10 bks positivos conservaran además el 10% de
láminas negativas.
-Menos de 100 bks como promedio mensual,
conservarán todas las positivas y negativas del
mes de numeración.
-Si durante el periodo un laboratorio no ha tenido
láminas positivas, conservará todas la láminas del
mes de numeración correlativa.
Evaluación de las láminas:
 Calidad de la coloración
Evaluación de las láminas:
  Calidad del extendido


                 Muestras de frotis:
                  (1)muy chico
                 (2)no    uniforme   y
                 demasiado grande
                 (3) muy delgado
                 (4) muy grande
                 (5)mal decolorado y
                 muy grueso
                 (6)tamaño y tinción
                 adecuadas
Evaluación de las láminas:
  Calidad del extendido
Evaluación de las láminas:
  Calidad del extendido
GRACIAS POR SU ATENCION


          LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN
          TELF: 064-217394
          CORREO ELECTRONICO:
          labreferencial@yahoo.es

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Baciloscopia set 2009

  • 1. DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS BACILOSCOPIA LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN Blgo. DANIEL FERNANDO ESTRELLA TORERO
  • 2. • La baciloscopia es la técnica de elección para el diagnóstico rápido y el control del tratamiento de la tuberculosis pulmonar del adulto. • Es simple, económica y eficiente para detectar los casos infecciosos. • Es la herramienta fundamental de un programa de control de la tuberculosis
  • 3. LA MUESTRA El envase • Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro • Capacidad entre 30 y 50 ml • Cierre hermético • Material plástico, resistente a roturas.
  • 4. Número de muestras y momento de la recolección
  • 5. Para Diagnóstico • Dos o tres muestras por SR, (aumenta probabilidad de detección). • La primera muestra debe ser tomada en el momento de la consulta (muestra inmediata) • La segunda muestra la debe recolectar el paciente en su casa por la mañana al despertar (muestra matinal). • La tercera muestra, cuando sea requerida
  • 6. Para Control • Una muestra por mes de cada paciente de tuberculosis pulmonar con baciloscopia inicial positiva. • Tomar al menos otra muestra para microscopía al finalizar el 4º mes (controlar la evolución del paciente y detectar un posible fracaso), y una al finalizar el tratamiento para confirmar la curación.
  • 7. Obtención espontánea del esputo • El primer paso para asegurar la calidad de la baciloscopia consiste en explicar al SR, con mucha claridad, la importancia de examinar muestras de esputo, la necesidad de recolectar esputo y no saliva.
  • 8. Calidad de la muestra • La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos
  • 9. Calidad de la muestra • Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso).
  • 10. Otras muestras • Orina • Líquido cefalorraquideo • Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, articular y otros • Biopsias • Pus
  • 11. CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS • Es conveniente procesar la muestra para baciloscopía o para cultivo el mismo día de la recolección. Si esto no es posible, conservarla siempre en refrigeración (4 °C no congelar) o en un lugar fresco, protegido de la luz y no por más de cinco días.
  • 12. CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS • Utilizar una caja de metal o de plástico opaco, con algún mecanismo que trabe su tapa, y con una manija para facilitar su acarreo. • Evitar: a) Exposición al calor excesivo. b) Exposición a la luz solar directa. c) Derrame del contenido del envase.
  • 13. RECEPCION DE MUESTRAS a) Comprobar que las muestras estén bien rotuladas (la etiqueta con los datos del paciente deberá estar colocada en el cuerpo del envase y no en la tapa) y que corresponda a lo asentado en la solicitud. b) Limpiar el envase con fenol al 5% si existe un pequeño derrame del contenido. Si el derrame es masivo desechar la muestra por incineración o esterilización en autoclave. c) Evaluar la calidad y cantidad de la muestra, capturar dicha información en el cuaderno de registro de laboratorio y en la sección apropiada de la solicitud de baciloscopía. d) Notificar deficiencias en su identificación, calidad, cantidad o forma de envío. Si este es el caso, solicitar una nueva muestra.
  • 14. LA BACILOSCOPIA Técnica: Coloración de Ziehl-Neelsen Fundamento: • Se basa en la capacidad de las micobacterias para incorporar y retener ciertos colorantes (fucsina fenicada) ante la acción de ácido y alcohol, propiedad conocida como ácido-alcohol-resistencia. Debido al alto contenido en lípidos, particularmente los ácidos micólicos de la pared celular.
  • 15. Lugar de trabajo y materiales • Se recomienda que sea un área exclusiva Los requisitos mínimos del laboratorio son: • Buena iluminación • Ventanas o extractor para renovar el aire una vez finalizado el trabajo. • Paredes y pisos lavables, que puedan ser desinfectados con solución de hipoclorito de sodio
  • 16. Lugar de trabajo y materiales • Una mesa para colocar las muestras que se reciban y realizar los extendidos, con dimensiones mínimas de 1 x 0,50 m, en lo posible cubierta con material liso y resistente a soluciones germicidas (fórmica, acero inoxidable o materiales similares). • Un lavadero con fuente de agua y desagüe, en el que se pueda lavar las manos y realizar la tinción. • Una repisa o armario para los reactivos, portaobjetos y demás materiales.
  • 17. Lugar de trabajo y materiales • Una mesa para el microscopio. • Una mesa para escribir los informes y los registros del laboratorio
  • 18. Equipo mínimo necesario EPP: • batas o guardapolvos de uso exclusivo para cada persona que realice baciloscopia. • Respirador N95 • Guantes
  • 19. Equipo mínimo necesario • Microscopio binocular con • Aplicadores de madera. oculares 10x, 40x y lente objetivo de inmersión 100x en • Portaobjetos. excelentes condiciones de • Varillas de vidrio para soporte de funcionamiento. la tinción (puente). • Mechero de gas • Hisopos de algodón. • Material de vidrio (matraces, • Soluciones antisepticas: Frasco probetas pipetas, etc.). con fenol al 5% • Pizetas, embudos, lápiz de punta • Recipientes para eliminación de de diamante. material contaminado. • Frascos para soluciones • Gradillas para láminas. colorantes y reactivos • Aceite de inmersión. preparados. • Papel lente. • Gasa o papel para cubrir el área • Papel filtro. de trabajo. • Envases para muestras.
  • 20. Reactivos y colorantes a) Fucsina fenicada. Para 1000 ml: Fucsina básica..................................................................3 g Alcohol de 95 ...............................................................100 ml Fenol acuoso*………………………………………………………….55 ml (Completar a 1000ml). b) Solución decolorante: (alcohol ácido). Para 1000 ml: Ácido clorhídrico..............................................................30 ml Alcohol de 95 ................................................................970 ml c) Azul de metileno. Para 1000 ml: Azul de metileno................................................................1 g Agua destilada 1000 ml
  • 21. Preparación del extendido “Para este examen se deben usar sólo portaobjetos nuevos, los rayados o viejos pueden producir como resultado falsos positivos.”
  • 22. Preparación del extendido • Ordenar las muestras • Rotular portaobjetos con el número único de la muestra de acuerdo al orden progresivo del registro de laboratorio. • Preparar los aplicadores
  • 23. Preparación del extendido • Para evitar confusiones, colocar frente al operador solo la muestra y el portaobjeto que se va a procesar. • Destapar el envase de la muestra, colocándolo junto a la laminilla que ha sido marcada con el mismo número de identificación que la muestra
  • 24. Preparación del extendido • Usar un aplicador o palillo de madera al que previamente se le ha quebrado uno de los extremos (captura el material mucopurulento y trasladarlo al portaobjetos) • Abrir el envase atrás del mechero y colectar con el palillo de madera la fracción útil. (mayor posibilidad de encontrar bacilos).
  • 25. Preparación del extendido • Hacer un frotis de 2 cm de largo x 1 cm de ancho, haciendo movimientos circulares para obtener una película uniforme
  • 26. Preparación del extendido • No debe ser demasiado grueso ni demasiado delgado. En ambos casos se dificulta la tinción y la lectura microscópica • Desechar el aplicador de madera en un frasco que contenga fenol al 5%. Usar un aplicador diferente para cada muestra de esputo aunque sean del mismo paciente. • Dejar secar a temperatura ambiente. Nunca se debe calentar la laminilla mientras está húmedo el frotis. Hacerlo produce aerosoles peligrosos para el operador.
  • 27. Preparación del extendido • Solo después que el extendido se ha secado, fijar el frotis pasando la laminilla sobre la flama del mechero con suavidad 2 o 3 veces, evitando el sobrecalentamiento Fijación deficiente = falso negativa. Calentar demasiado = alterar la estructura de los bacilos.
  • 28. Preparación del extendido • Si es muy grueso, el extendido puede barrerse durante el proceso de tinción. • Por lo general, cuando es del grosor adecuado, se puede leer un periódico colocado detrás de un extendido seco.
  • 29. Preparación del extendido • Al terminar, desinfectar el área de trabajo con fenol al 5% y esterilizar el recipiente con los aplicadores y el papel o gasa usados sobre la mesa. • Conservar las muestras hasta terminada la observación microscópica, en caso de que sea necesario repetir el extendido, la tinción o la observación al microscopio. • Solo cuando estos procedimientos se han completado satisfactoriamente, los contenedores con las muestras se esterilizan y desechan.
  • 31. Coloración • Se recomienda teñir como máximo 12 frotis en cada oportunidad para lograr una coloración uniforme • Colocar los frotis, conservando el orden numérico sobre las varillas de vidrio (distancia mínima aproximada de 5 mm – 10mm - para evitar contaminación por arrastre)
  • 32. Coloración • Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero.
  • 33. Coloración • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. • En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. • Calentar tres veces hasta la emisión de vapores. Dejar reposar 5 min.
  • 34. Coloración • Enjuagar con abundante agua. Cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior • Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua (evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación).
  • 35. Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar 3 minutos • Enjuagar con abundante agua. • Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). “Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante 1-3 minutos” y enjuagar nuevamente. • Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos
  • 36. Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. • Dejar actuar durante un minuto. • Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión.
  • 37. Coloración de fondo • Limpiar la parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada. • Observar si las láminas conservan la numeración. Si no es así volver a numerarlas. • Dejar secar las láminas a temperatura ambiente (no por calentamiento). No apoyar papel absorbente sobre el extendido.
  • 38. OBSERVACION MICROSCÓPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS
  • 39. La observación microscópica debe cumplir principalmente dos objetivos: • Determinar si en el extendido hay BAAR. • Cuantifica la riqueza en bacilos.
  • 40. Características morfológicas del bacilo de la tuberculosis • De 1 y 10 μm de largo. •Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. •Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados.
  • 41. Observación microscópica A. Colocar una gota de aceite de inmersión en el extremo izquierdo del frotis teñido. B. Enfocar el portaobjetos con el lente objetivo de 40x antes de 100x C. Después de encontrar el área adecuada, cambiar a la lente objetivo de 100x.
  • 42. Observación microscópica D. La lente objetivo no debe tocar el portaobjetos (falsos positivos). E.Examinar sistemáticamente 100 campos útiles. F. Después de observar un campo microscópico, desplazar el portaobjetos longitudinalmente para poder examinar el campo contiguo.
  • 43. Observación microscópica Campos útiles •Aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas). •Los campos sin estos elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados, a menos que contengan BAAR.
  • 44. Observación microscópica Conteo de BAAR •Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado. •Se puede utilizar una cuadrícula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan los 100 campos microscópicos, como ayuda para registrar la cuenta. •En cada cuadrado anotar el número de BAAR que se observa. •Si no observa BAAR consignar 0.
  • 46. Reporte de resultados Resultado: (No. de bacilos/No. de campos) Resultado: (49/100) = 0.49 Entonces: Positivo +
  • 47. Reporte de resultados 3 0 5 0 6 7 4 5 0 5 4 0 0 5 7 0 6 0 0 4 Resultado: (No. de bacilos/No. 4 6 0 0 5 7 5 5 0 6 de campos) 0 5 7 5 0 0 6 0 6 0 Resultado: (165/50) = 3.3 6 0 7 0 5 0 6 7 0 6 Entonces: Positivo ++                                                                                
  • 48. Reporte de resultados 15 13 0 9 16 20 10 0 18 15 0 20 15 11 17 16 0 18 20 17 Resultado: (No. de bacilos/No.                     de campos)                                         Resultado: (250/20) = 12.5                     Entonces: Positivo +++                                                                                
  • 50. Qué hacer si es paucibacilar? -Leer 100 campos utiles más. -Si persiste el resultado, realizar otro extendido de una porción mas representativa. -Si persiste el resultado, anotar el hallazgo y enviar a cultivo. -Anotar en el rubro Observaciones (Ej. 5 BAAR) -Solicitar nuevas mxs.
  • 51. Algunas razones que causan resultados falsos positivos son: • Error al manejar la muestra o al registrar la información •Volver a usar recipientes o portaobjetos Positivos •Fucsina Fenicada sin filtrar •Aceite de inmersión contaminado •Decoloración incorrecta.
  • 52. Algunas razones que causan resultados falsos negativos son: •Errores al manejar la muestra o al registrar información •Mala calidad del esputo •Decoloración excesiva •Lectura de menos de 100 campos microscópicos.
  • 53. CONTROL DE CALIDAD DE LAS BACILOSCOPIAS “Objetivo: elevar y mantener la calidad de trabajo”.
  • 54. •El control de calidad permite evaluar si la información producida por el laboratorio es precisa, reproducible y oportuna. •Instaura un sistema de alarmas que permite prevenir, descubrir y corregir errores •Resulta más eficaz para detectar y asistir a los casos de tuberculosis y para controlar la enfermedad
  • 55. Conservación de las láminas: •Quitar el aceite presionando muy suavemente sobre ellas un papel absorbente. •Sumergirlas en un recipiente con xilol o alcohol 70%, durante no más de 30 segundos. • Dejar secar al aire. •Comprobar que la numeración esté visible en las láminas. •Guardarlas en cajas para láminas portaobjetos, o dentro de una caja común envueltas individualmente en papel, (en paquetes rotulados con la fecha, en el orden en que se realizaron). • Conservarlas en lugar seco y fresco.
  • 56. Conservación de las láminas: Laboratorios que procesan: -Más de 100 bks por mes y con màs de 10 bks positivos (diagnostico mas control) conservaran todas la positivas y las dos negativas siguientes -Más de 100 bks por mes y presentan menos de 10 bks positivos conservaran además el 10% de láminas negativas. -Menos de 100 bks como promedio mensual, conservarán todas las positivas y negativas del mes de numeración. -Si durante el periodo un laboratorio no ha tenido láminas positivas, conservará todas la láminas del mes de numeración correlativa.
  • 57. Evaluación de las láminas: Calidad de la coloración
  • 58. Evaluación de las láminas: Calidad del extendido Muestras de frotis: (1)muy chico (2)no uniforme y demasiado grande (3) muy delgado (4) muy grande (5)mal decolorado y muy grueso (6)tamaño y tinción adecuadas
  • 59. Evaluación de las láminas: Calidad del extendido
  • 60. Evaluación de las láminas: Calidad del extendido
  • 61. GRACIAS POR SU ATENCION LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN TELF: 064-217394 CORREO ELECTRONICO: labreferencial@yahoo.es