1. BIOTECNOLOGÍA DE LOS
PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER
ALUMNA: MARTÍNEZ SALDAÑA, YURICO ELIZABETH
CICLO: IX
HORARIO: JUEVES 11-1PM
TRUJILLO-2012

2. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
LABORATORIO N°06
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO
ENZIMÁTICO PURO
I. INTRODUCCIÓN
Como es bien sabido, las enzimas son proteína. Polímeros de residuos amino acídicos unidos
mediante enlaces peptídicos, que tiene la función de ser catalizadores de las reacciones químicas del
metabolismo celular. La producción de enzimas, de actividades específicas, es seguida por una
purificación y una estandarización del producto. En la formulación del producto se agregan diversos
excipientes (otras proteínas y azúcares, por ejemplo). Por lo que un preparado enzimático comercial
no es 100% puro .De manera de cuantificar la enzima presente en una formulación comercial se
realizan determinaciones de su actividad enzimática y del contenido de proteínas.
II. OBJETIVOS
Desarrollar una curva patrón de calibración
Determinar la actividad enzimática en unidades usc (Unidad Street Close)
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
CINÉTICA DE REACCIONES QUÍMICAS
La reacción química tiene dos características de importancia: la posición de equilibrio (estabilidad de la
concentración de productos y reactivos) y la velocidad de reacción (las reacciones tienen por objeto
determinar el mecanismo y la velocidad con que interaccionan las moléculas bajo determinadas
condiciones).
La velocidad de una reacción química puede medirse como la velocidad de formación de uno o más de
su productos o bien la velocidad de utilización de sus reactivos. Intuitivamente podemos suponer que
al aumentar la concentración de los reactivos la probabilidad de interacción de los mismos aumenta
conjuntamente con la velocidad que procede tal reacción. Ambas variables (velocidad de reacción y
concentración de los reactivos) son directamente proporcionales, así que matemáticamente debe
existir un valor constante, de esta manera podemos escribir:

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vr = k. [reactivos]n
(Velocidad de reacción) = (constante) . (Concentración de reactivos)n
El valor del exponente n es el orden de la reacción. Así si n = 1, estamos en presencia de una reacción
de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reacción de un solo reactivo. vr = k. [A]
Análogamente, cuando n = 2, la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de dos
reactivos o al cuadrado de la concentración de uno solo. Este tipo de reacciones reciben el nombre de
segundo orden. vr = k. [A] [B] = k [A] 2
La importancia de determinar el orden de una reacción química radica en que a partir de ese
parámetro puede obtenerse información sobre el mecanismo molecular en que opera.
VELOCIDAD DE REACCIÓN Y EQUILIBRIO
En estado de equilibrio químico las velocidades de reacciones directa e inversa son exactamente
iguales. Considerando una reacción de primer orden:
k1 [A] = k – 1 [B]
Este principio nos permite llegar fácilmente a una reacción entre las constantes de velocidad y de
equilibrio:
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN: ENERGÍA DE ACTIVACIÓN
Las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las
reacciones biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para
explicar este hecho se postuló que al acrecentar la temperatura aumenta la fracción de moléculas
capaces de tener una energía suficiente para alcanzar un “estado activado” que luego se transforme
en producto de la reacción por formación o ruptura de enlaces químicos.
Se admite que las únicas moléculas que reaccionan son aquellas que al chocar llevan consigo una
energía mayor que un cierto valor mínimo. A este valor de energía necesaria se lo denomina energía
de activación y es un factor de suma importancia para determinar la magnitud de la velocidad de
reacción.

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CATALIZADORES
Una reacción química tendrá lugar si se debe superar el valor de la energía de activación. Una vez vencida esa
barrera el sistema evoluciona de forma tal que llegará al estado final de la reacción. La velocidad de reacción
podría incrementarse de dos maneras: aumentando la concentración del “complejo activado” o eventualmente
disminuyendo la energía de activación. Este último mecanismo es el que se pone de manifiesto cuando se
emplea determinadas sustancias llamadas catalizadores. Estas sustancias aceleran las reacciones químicas
disminuyendo la energía libre de activación, se combinan con los reactivos para producir un estrato de
transición de menor energía que el estado de transición de la reacción no catalizada. Cuando los productos de la
reacción se forman, se regenera el catalizador al estado libre.
ENZIMAS: CATALIZADORES BIOLÓGICOS
Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en ausencia de un catalizador.
Estos catalizadores se denominan enzimas y son en su totalidad moléculas de naturaleza proteica
(aunque ha habido estudios acerca de enzimas de naturaleza glucosídica).Es razonable pensar en la
necesidad que tienen los seres vivos de poseer estos catalizadores, ya que las funciones vitales de
cualquier célula serían imposibles de mantener si las reacciones que ocurren en ella fueran
extremadamente lentas.
Además de incrementar la velocidad las enzimas exhiben una elevada especificidad y en algunos
casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y otras veces disminuyendo, de
acuerdo a las necesidades del momento, su actividad.Todas estas propiedades pueden ser cumplidas
por moléculas altamente complejas, que al ser moléculas orgánicas (macromoléculas) comparten
características con las proteínas no enzimáticas y difieren de los catalizadores inorgánicos:
a) Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.
b) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado sustrato) es altamente
específico.
c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas de sustrato por
unidad de tiempo.
d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos.
Como todos los catalizadores las enzimas aceleran notablemente la velocidad de una reacción
química y cumplen con las siguientes características:

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Son efectivas en pequeñas cantidades
No sufren modificaciones químicas irreversibles durante la catálisis. Es decir que luego de la
reacción enzimática, las moléculas de enzimas que reaccionaron son indistinguibles de las que
no lo han hecho, (la estructura de la molécula se mantiene, al principio y final de la reacción,
exactamente igual).
No afectan la posición de equilibrio de la reacción que catalizan. El estado inicial y final de la
reacción es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho más rápidamente.
CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
Las consideraciones generales de la cinética química pueden aplicarse a las reacciones catalizadas
enzimáticamente, aunque estas últimas tienen la particularidad de mostrar el fenómeno de saturación
por el sustrato.
A una concentración constante de enzima, si vemos el gráfico de la velocidad de la reacción catalizada
enzimáticamente en función de la concentración del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones
del mismo la velocidad de formación de producto es proporcional a la concentración del sustrato. A
medida que se aumenta la concentración de sustrato se aprecia una pérdida de la proporcionalidad,
en esta zona la reacción es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la
reacción es independiente de esta.Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una región
determinada del mismo llamada sitio activo. El fenómeno de saturación junto con otras evidencias
llevaron a postular la existencia de un complejo enzima – sustrato (E – S) como etapa previa a la
formación de productos.
En 1913 LenorMichelis dedujo la relación entre la velocidad máxima (vm) de una reacción catalizada
enzimáticamente en términos de la formación del complejo E – S. En base a estas consideraciones es
lógico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima están
ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un máximo. El modelo propuesto sirve de base para
explicar las propiedades de la mayoría de las enzimas y como se dijo antes asume la existencia de un
complejo E – S como intermediario en la catálisis.
Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E – S, con una constante de
velocidad k1. Este complejo E – S puede seguir dos caminos: a) puede proceder para formar el

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producto con una constante de velocidad k3; b) el camino alternativo es disociándose, generando
nuevamente E y S con una constante de velocidad k2.
En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será:
v = k3 [E – S]
El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión equivalente con
valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha desarrollado la siguiente ecuación:
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA
REACCIÓN CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE. OBTENCIÓN DEL KM Y LA VMAX
Si se mantiene la concentración de la enzima constante y variamos la concentración de substrato se
obtiene una curva hiperbólica como la de la figura (arriba izquierda). Al principio un aumento de la
concentración de substrato produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue
aumentando la concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a disminuir; vemos que
a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reacción, se dice
que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reacción que se
obtiene a esa alta concentración de substrato se define como la velocidad máxima (vm) de la reacción
enzimática bajo las condiciones especificadas. La concentración de substrato [S], a la semivelocidad
máxima de reacción (½ v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o
km, la cual es una característica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide aproximadamente la
afinidad de la enzima por el substrato. Mientras más pequeño sea el valor de km, mayor será la
afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo
substrato, éste será transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
Así tendremos:
(Simplificando)

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Si reordenamos la ecuación tendremos que:
[S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]
Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el
valor de km de la enzima.
La expresión de Michelis – Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son
más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los
recíprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuación.
Esta expresión conocida con el nombre de ecuación Lineweaver – Burk, corresponde a una recta de
ecuación:
y = a.m + b
Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando gráficamente (al
lado) obtendremos una gráfica del tipo lineal.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
a) Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción
hasta cierta temperatura óptima, ya que después de aproximadamente 45ºC se comienza a
producir la desnaturalización térmica. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una
temperatura óptima de 37ºC, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se
destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas

8. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
termales y en el otro extremo ciertas bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a
0ºC.
b) Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimática: El pH no afecta la actividad enzimática
directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar
la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la reacción como
substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la
velocidad de la reacción.Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son
proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie
proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede
producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Con respecto a la determinación de la actividad de la enzima, debemos recordar que la actividad
enzimática:
Indica el máximo potencial catalítico de una enzima y está dado por la velocidad inicial de la
reacción
La velocidad de reacción se mide, cuantificando la evolución del producto o del sustrato de
reacción en el tiempo, pero este último es más dificultoso ya que se utiliza en exceso y las
variaciones en corto tiempo no son notorias.
Se determina en las mejores condiciones para la enzima (Tº y pH óptimo) y a concentraciones
saturantes de sustrato.
La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite catalizar 1µ
mol de sustrato por minuto de reacción a las condiciones antes mencionadas.
La medición de actividad se ve afectada por los siguientes factores:
Denaturación de la enzima (por temperatura)
Reversibilidad de la reacción enzimática.
Inhibición de la enzima (por producto o inhibidor externo)
Desaturación de la enzima (baja concentración de sustrato)
Para evitar los tres primeros factores, la medición se realiza a tiempos cortos; el último factores
evita ala utilizar una concentración saturante de sustrato.
Al evitar tales problemas la velocidad de reacción sólo está condicionada por la cantidad deenzima
utilizada en la reacción.

9. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Materiales y Equipos
Materiales
Pulpa de papaya 20g HCl 0.1N
(Extracción de amilasa) Sustrato almidón
Solución yodada. Agua destilada
PEC
Equipos
Matraces Gradillas
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml Balanza analítica
Probeta de 200 ml Baño maría
Tubos de ensayo. Centrífuga
Mortero Espectrofotómetro.
Pilón.
B. Metodología
Preparación del Preparado Enzimático Puro (PEC)
Pesar 20 gramos de muestra (pulpa de papaya).
Se tritura en el mortero con el pilón.
Al triturado lo homogenizamos al agregar KCl 10 ml a 0.154M a 4ºC.
Disolver bien el triturado y luego filtrar.
El filtrado llevar a centrifugación (4000 rpm x 10 min).
Obtenemos el Preparado enzimático Crudo (PEC).
Determinación de la Actividad Catalítica
Método de Street - Close
Preparar los tubos blanco y problema.
Agregar 2.5 ml de solución de almidón al tubo problema.
Agregar 0.4 ml de agua destilada al tubo problema y 2.9 ml de agua destilada al tubo
blanco.
Agregamos 0.1mL de PEC al tubo blanco y 0.1 ml al tubo problema.

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Llevar a incubación 35ºC por 5 minutos, ambos tubos
Se agregará 2.5 ml de HCl 0.1N a los dos tubos.
Se agregará 0.1 ml de solución de iodo a los dos tubos.
Preparación de tubos para la curva de calibración
Preparar los tubos blanco, 1; 2; 3; 4 y 5del mismo modo que el tubo problema
Agregar 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 ml de solución de almidón (400ppm) en cada uno de
los tubos respectivamente. Menos en el tubo Blanco
Agregar 3.0; 2.5; 2.0; 1.5; 1.0; 0.5 ml de agua destilada a cada uno de los tubos
respectivamente.
Agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a cada uno de los tubos respectivamente.
Agregar solcuion iodada 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1 a todos los tubos.
Dejar reposar por tiempo de 5 minutos y llevar a medir la observancia a una longitud de
onda de 550 nm en el espectrofotómetro.
Esto se puede ver eb el sgte cuadro:
Cuadro 1. Datos previos a la curva de calibración.
g almidón 0,2 mg 0,4 mg 0,6 mg 0,8 mg 1 mg
MUESTRA MUESTRA MUESTRA MUESTRA MUESTRA
COMPONENTES BLANCO
1 2 3 4 5
Sol. Almidon soluble 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
H2O destilada 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
HCL 0,1N 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Sol. Yodada 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Tabla 1. Cantidad de almidón y Absorbancia para la obtención de Curva de
Calibración
CANTIDAD DE ALMIDÓN ABSORBANCIA
0 0
0.2 0.322
0.4 0.519
0.6 0.755
0.8 1.018
1 1.281

11. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
1.4
1.3
1.2
1.1
1
0.9
0.8
Absorbancia
0.7
0.6
y = 1.247x + 0.025
0.5 R² = 0.996
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05
Almidón (mg)
Figura 1. Cantidad de Almidón y Absorbancia
Tabla 2.Cálculos de las unidades Street Close en tubos Problema y Blanco
ABSORBANCIA ALMIDÓN ALMIDÓN usc (100
TUBO ABSORBANCIA usc (0,1ml)
CORREGIDA RESIDUAL (mg) HIDROLIZADO (mg) ml)
B 0.001 46.3913392
0.115 0.072173216 0.927826784 0.046391339
P 0.116 …..
Según Wiseman (1986);la Unidad Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de
muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En
esta técnica se incuban 10 µl de muestra con 0.25 mg de almidón contenidos en 0.5 ml de solución de
sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra con 10.000 mg de
almidón durante 30 minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra
sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se
multiplica por 1000. En nuestro práctica para la detreminacion de la actividad enzimática, utilizamos la

12. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
unidad Street Close (esta unidad no especifica el tipo de enzima solo la cuantifica) lo cual se puede
observar en la Tabla 2.
Según Doran (2998); la curva de de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia
(por ejemplo la albúmina sérica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de
esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita. En muchas determinaciones se cumple
una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del
reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la
aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de
proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente. En nuestro caso
esto se puede observar en los datos obtenidos en nuestra Tabla 1 la cual ayudó para la obtención de
la curva de calibración en Figura 1, la cual nos dio una recta y un coeficiente de determinación de
99.69% en lo cual vemos que esta relación debe estar dado por la magnitud y la intensidad de color
dado en el espectrofotómetro.
Según VanDer (1975); la Curva de Calibración esta dado con datos reales, los gráficos que se
obtienen no son tan ideales, pero esta situación no es un obstáculo ya que dentro de ciertos valores es
posible trazar la recta más probable que une una serie de puntos, con el uso de los programas de
cálculo de las computadoras. Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango
de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos
factores dependientes del método de medición. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita
solamente a la determinación de un elemento o compuesto químico sino que tiene múltiples
aplicaciones. Lo e4xpuesot por el autor se verifica en la figura 1, donde vemos la linealidad de la
línea recta de la cantidad de almidón con la Absorbancia ya que como dice el autor ésta curva está
dada por una serie de factores.
Según VanWeel (1959); la espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las
investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que
contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.“Espectro de Absorción”. Cada especie
absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El
espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abscisas
la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de
la espectrofotometría de absorción. Dicho espectro de absorción se nota en la Figura 1, donde vemos
una relación entre la cantidad de absorbancia la cual dependerá de su cantidad de almidón. Y en la
Tabla 2 vemos que la absorbancia corregida (se obtiene disminuyéndole la absorbancia del tubo

13. “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”
Blanco)sirve para llevarla a la gráfica y hallar la cantidad de almidón residual que queda en el tubo
problema y en el tubo testigo.
VI. CONCLUSIONES
Se desarrolló la curva patrón de calibración donde el coeficiente de determinación es de
99.69%.
Se llegó a determinar la actividad enzimática en unidades usc (Unidad Street Close), en la
cual la absorbancia corregida se obtiene disminuyéndole la absorbancia del tubo Blanco; a
la vez sirve para llevarla a la gráfica y hallar la cantidad de almidón residual que queda en
el tubo problema y en el tubo testigo.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DORAN, P. (1998). “Principios de Ingeniería de los bioprocesos”. Editorial acribia SA. Zaragoza
(España).
WISEMAN, A. (1986). “Principios de Biotecnología”. Editorial ACRIBIA S.A. ZARAGOzA (España).
VANDER M. (1975). The enzymatic hydrolysis of agar by CytophagafIevensLF sp. nov.TThesis,
üniversity of Groningen, Netherlands, 80 pp.
VANWEEL.P. (1959). The effect of special diets on the digestion processes (enzyme production and
resorption) in the african giant snail AchatinafilicaBowdich. 2. vergl. Physiol. 42: 433-448.
ANEXOS
Figura 2. Tubos de ensayo durante la Figura 3. Tubos de ensayo durante la
calibración calibración Tubo Blanco y Tubo 1.