Determinación de biomasa mediante recuento celular

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
CIENCIAS AGROPECUARIAS
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO 1. DETERMINACIÓN DE BIOMASA

PROFESOR:ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER

ALUMNA:MARTÍNEZSALDAÑA, YURICO ELIZABETH

CURSO:BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

CICLO:IX-A

HORARIO:JUEVES 11-1 PM

TRUJILLO- PERÚ
2012

LABORATORIO N° 01.

DETERMINACIÓN DE BIOMASA

I. OBJETIVOS

Objetivo General:

 Determinar la concentración de células por conteo en cámara Neubauer. Expresándolas en
unidades de células/mL.

Objetivo Específico:

 Reconocer la técnica de contaje en Cámara Neubauer.
 Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos; de manera general y manera
aleatoria, mediante los métodos de variabilidad y desviación estándar.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Biomasa es un término general quese refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez
también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproducción de células.

La determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su
determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para
establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de
cualquier proceso biológico.Una variedad de análisis están disponibles para la determinación de Biomasa de
muestras biológicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomycescerevisae).

Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Esto
es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o
drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. Los métodos para estimar el número
de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos
que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o
levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los
microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.

A. Métodos directos de determinación de biomasa:Se basan en el número de células o en el peso
celular, dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes:

1. Métodosgravimétricos (Peso Seco)
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por
unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles
(SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en
g.m.s/mL.

La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos
activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica

LABORATORIO N° 01. DETERMINACIÓN DE BIOMASA Página2

adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos
gravimétricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles.

2. Métodosespectrofotométricos.
Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes
en una muestra y su valor de turbidez.Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular
mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes
de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione
medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez.
Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a
partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de métodos rápidos, Pero de baja sensibilidad y que
presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas.

3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras

Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como la cámara de
Neubauer. Thoma, Bürker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Mal assez, Petroff H ttrser, etc. El recuento de
microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad,
obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células/ml,
generalmente).
El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades
en la distribución de la muestra. Además, pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e
inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células vivas de células muertas.

a. CÁMARA DE NEUBAUER. Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al
de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la
cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es
un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues
el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del
cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas,
la concentración en la suspensión celular será: concentración en la suspensión (células / mL) =
10000 (x/4).

Conteo en cámara de Neubauer, Esta cámara se utiliza para conteo celular.

 Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
 Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
 Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, este debe quedar centrada.
 Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las
células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara
se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
 La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado
se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido
abundante en las terminaciones del recuadro.


Figura 1. Conteo por Cámara Neubauer. Representación de la cuadricula 10 X.

En la figura 1, si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., debemos
ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de
los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las
esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio

4. Métodos microscópicos mediante epifluorescencia

La microscopía de epifluorescencia comenzó a emplearse a principios de los 70 y hoy en día se considera
como uno de los mejores métodos para la estimación de la biomasa.
La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adición de algún anticuerpo marcado con
fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algún
componente celular autofluorescente.

Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tinción de las
bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopía óptica con iluminación de
epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observación
directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedarían englobados aquellos
fluorocromos que tras ser adsorbidos actúan específicamente sobre ácidos nucleícos u otros componentes
celulares. El segundo incluiría a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad
metabólica, son convertidos en moléculas fluorescentes.

Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimación de la población total de
una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten
distinguir células de partículas e identificar bacterias no sólo por su color, sino también por su forma y
tamaño.El naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las células emitiendo a una longitud de
onda aproximada de 470 nm. Los ácidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo
fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. EI fluorocromoDAPI es


un colorante específico del ADN y su pico de excitación se encuentra próximo a la región ultravioleta (365
nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las
células muertas, metabólica- mente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso
en células muertas.El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina o el DAPI, es un colorante
específico de ácidos nucleicos. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del ácido 1 -anilino-8
naftalensulfónico (Mg-ANS) tiñen principalmente componentes celulares como proteínas, lípidos o
membranas celulares. En cambio, el comportamiento de estos agentes fluorocromos es el comentado
anteriormente, sobrestiman el número de células viables al no distinguir células vivas de muertas.

En el segundo grupo quedarían englobados fluorocromos como el cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio
(CTC) ó el 5 y 6 diacetato de sulfofluoresceína (SFDA) .Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores,
distinguen bacterias metabólicamente activas de las que no lo son mediante la observación microscópica del
producto fluorescente resultado de la actividad metabólica para la que son específicos. En el caso del CTC
1a actividad metabólica es la respiratoria y en el del SFDA es la actividad esterasa. La epifluorescencia
basada en fluorocromos como el CTC y el SFDA pondrá de manifiesto aquellos microorganismos en los
cuales estén presentes dichas actividades metabólicas, pero sin cuantificarlas. Salvando este obstáculo se
encuentran las medidas bioquímicas de determinación indirecta de la biomasa, que sí cuantifican
actividades metabólicas.

La epifluorescencia es un método simple y rápido. No obstante, su reproducibilidad está cuestionada y
necesita un equipamiento relativamente caro.
La fluorescencia mediante anticuerpos marcados con agentes fluorescentes está basada en las propiedades
inmunológicas de las células.Es una técnica muy sensible y específica, y puede realizarse in situ. También
puede llevarse a cabo mediante hibridación de sondas fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ
hybridization, FISH), cada vez más utilizadas en Ecología Microbiana.

5. Métodos de siembra

El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas células viables de
desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos en placa por vertido, un
volumen de 0,1- 1 ml de la suspensión microbiológica se mezcla con el medio de cultivo fundido y
parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se
extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensión sobre la superficie del medio de cultivo.
Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) por
unidad de volumen de la suspensión microbiológica. Para que el recuento sea estadísticamente significativo,
el número de colonias deberá estar comprendido entre 30 y 300 colonias. En el caso de muestras muy
diluidas se puede emplear la filtración de membrana, en la que tras la filtración de la muestra es el filtro el
que es colocado finalmente sobre el agar.

Otro tipo de recuentos los constituyen aquellos que emplean un medio de cultivo líquido como es el caso
de la estimación del número más probable (NMP). El recuento de microorganismos viables se
fundamenta en el desarrollo de una colonia visible a partir de cada organismo viable. El principal
problema de este método es que no todas las bacterias presentes en una muestra pueden crecer en el
medio y las condiciones de cultivo seleccionado. Suelen ser, por tanto, métodos infraestimativos y
estadísticamente cuestionables.


En el método de conteo celular se expresa en cel/mL, en el método de Peso Seco se expresa en g.m.
s/mL, en el método de Peso Húmedo se expresa en g. h /mL y en el método de Conteo de Colonias o
Recuento en Placa se expresa en UFC/mL.

B. Métodos indirectos de determinación de biomasa. Estos métodos se basan fundamentalmente en la
determinación de algún componente celular específico, en la cuantificación de alguna actividad
enzimática (métodos bioquímicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formación de algún
producto (métodos cinéticos). También se incluyen en este apartado algunos métodos fisicoquímicos.
Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan, más que la viabilidad de las bacterias la actividad ya
que dependen más del estado metabólico de los microorganismos que del número de individuos (Arnáiz
et al, 2000).

1. Componentes celulares. Cualquier componente celular seleccionado para la estimación de la biomasa
viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente únicamente en
células vi vas, ser rápidamente degradado en células vivas, ser relativamente constante en
concentración respecto a cambios en el estado fisiológico celular y entre distintas epsecies.

Hasta el momento no existe ningún componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin
embargo, los más adecuados para estimar biomasa viva (Arnáizet al, 2000), son:

Ácidos nucleicos, El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya síntesis es
proporcional a la tasa de crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varían
considerablemente con el estado fisiológico celular, la cantidad de ADN es relativamente más
constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometría, tras su extracción y
purificación. Existen diversas técnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos
de purificación son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos (Arnáizet al, 2000).
Proteínas, Existen varias técnicas para el análisis de proteínas totales de una muestra biológica.
Algunos están muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el
caso de las técnicas de Lowry et al. y Bradford.La principal desventaja de la determinación de
proteínas es que su cantidad en las células está sujeta a fuertes variaciones debido,
fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoquímicas y al estado fisiológico celular
(Arnáizet al, 2000).
Polisacáridos, La mayoría de las células procariotas contienen ácido murámico (un
peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias técnicas para 1a
determinación del ácido murámico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se
basan en la conversión del ácido murámico a lactato, seguida del análisis enzimático o químico
de la concentración de lactato. El ácido murámico se extrae de 1as células mediante una
hidrolisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico.
Otros análisis más sensibles necesitan del uso de cromatografía líquida (HPLC) o gaseosa (GC).
Todas estas técnicas son laboriosas. Muy largas y necesitan de un equipamiento caro (Arnáizet
al, 2000).
Lípidos, Los lípidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su
determinación para la estimación de la biomasa de una población bacteriana ofrece muchas
ventajas sobre otros métodos. La principal ventaja es su alto contenido específico y que se
encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los
lípidos no forman parte de las reservas ceiulares y se degradan rápidamente durante la lisis
bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lípidos de las membranas celulares está
en forma de fosfolípidos. Las técnicas de análisis se basan, fundamentalmente, en la extracción

celular de los fosfolípidos con un disolvente orgánico, su posterior hidrólisis ácida para liberar el
fosfato y, por último, 1a determinación colorimétrica de éste. Son técnicas relativamente sencillas,
reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato) (Arnáizet al, 2000).
ATP, El ATP presenta las ventajas de ser un componente bioquímico central presente en todos
los microorganismos y específico de los microorganismos vivos, circunstancias ambas que
permiten relacionarlo con la biomasa viva. Una de las técnicas más utilizadas para medir ATP se
basa en la reacción luciferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las
luciérnagas y que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe
que intervienen luciferina (fenol heterocíclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de
magnesio y oxígeno en un proceso de oxidorreducción que ocurre en doble etapa: Ya que por
cada molécula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinación del ATP en una
muestra biológica puede hacerse mediante extracción por ebullición en tampón Tris (hipocloruro
de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubación con luciferina-luciferasa y posterior medida
de la luz producida en un fotómetro con registro. La mayor desventaja de esta técnica es 1a
necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado fisiológico de las células cambia
rápidantente tras la toma de muestra. La relación entre el ATP, el ADP y el AMP y el contenido
total de desoxirribonucleótidos refleja la carga energética de las células [(ATP + 0,5 ADP)/(AMP +
ADP + ATP). Esta relación puede duplicarse en sólo unos segundos. Algunos autores sugieren
que la carga energética es un valor mucho más preciso que el contenido absoluto de ATP ya que
la composición celular de desoxirribunucleótidos varía con el estado fisiológico de los
microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energético disminuye, al disminuir la
concentración de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Arnáizet al, 2000).

2. Métodos bioquímicos. Las medidas de alguna actividad enzimática pueden considerarse como una
alternativa a los métodos tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples de realizar y sus
resultados se obtienen rápidamente. Además. El equiparniento necesario no es ni costoso ni complejo.
La mayoría de las medidas de actividad enzimática se realiza mediante la conversión de sustratos
específicos a productos coloreados que son cuantificados fotométricamente.

La principal desventaja de los métodos bioquímicos es la variación de las actividades enzimáticas
celulares con los cambios fisiológicos y que, una vez que los microorganisrnos mueren, las enzimas
liberadas pueden seguir activas .Entre las distintas medidas de actividad enzimática cabe destacar:

Actividad esterasa
Actividad deshidrogenasa

3. Métodos cinéticos. La base de estos métodos es la medida del consumo de sustrato o de la formación
de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo más típico en microorganismos aerobios es la
determinación de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolución a través del
consumo de oxígeno del medio.

Adaptaciones del Respirómetro de Warburg
Tasa de respiración
Tasa de desaparición de sustrato
Potencial bioquímico de producción de metano


4. Métodos en continuo. Durante los años 90 se han desarrollado métodos cuantitativos para la
determinación on-line de la biomasa de un proceso biológico. Las técnicas más importantes se basan en
propiedades eléctricas, microcalorimétricas o espectrofotométricas de los cultivos biológicos. Sin
embargo, a pesar del desarrollo tecnológico, no existe un sensor ideal para la monitorización en continuo
de la biomasa.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Materiales e Instrumentos

Levadura Saccharomycescerevisae
CamaraNeubauer
Jeringa
Laminilla cubreobjetos
Lámina Portaobjetos
Tubos de ensayo
Microscopio

B. Metodología

Con una jeringa se tomará una cantidad de la solución previamente preparada la cual se encuentra
en un tubo de ensayo en dilución a la 10 -1y se dejará caer unas gotas en la cámara de Neubauer.
Se colocará la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona central, para apreciar una
zona cuadriculada.
Con la ayuda de una jeringa se obtendrá una pequeña muestra del tubo de ensayo, y se colocará en
el borde del cubreobjetos. Se dejará que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que
pase a los canales laterales.
Una vez que la muestra ingrese por la cámara de Neubauer, se dejará reposar, y posteriormente, se
colocará en el microscopio.
Se realizará la cuantificación de células en las zonas de los cuadrados más pequeños de 0.05 mm.
tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna.Se contarán las
células que estén dentro de los cuadrados las que se noten bien y las células que estén en el lado
superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4.
Luego de calcular las células en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se
deberá calcularel número de células/ mL(por cuadrado), y por medio de la siguiente fórmula, se
determinó el número de células por mililitro.
A la vez se deberá calcular la desviación estándar de las 25 celdas. Luego tomaremos 5 celdas al
azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviación estándar para luego
hacer una comparación.


IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1.Conteo de Células en 25 celdas, en CámaraNeubauer

FILAS NÚMERO DE CÉLULAS EN CADA UNA DE LAS 25 CELDAS.
1 fila 8 6 10 10 5
2 fila 9 5 2 10 6
3 fila 4 2 6 3 1
4 fila 10 4 5 7 5
5 fila 12 7 5 2 6

Tabla 2. Concentración de las células en las 25 celdas, Desviación estándar y coeficiente de
Variación

Concentración de
células

Desviación estándar 2.9580

Coeficiente de
Variación

Tabla 3.Al azar 5 Células de las 25 celdas de la CámaraNeubauer

Números al Desviación
Concentración de Células Coeficiente de Variación
azar estándar

8
4
10 2.2361
7
6


SegúnAquiahuati, (2004); la cámara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de las células de
levadura, sin embargo nopermite distinguir las células viables de las no viables. Esto se puede contrastar en
la tabla 1, en donde observamos que hicimos un conteo de 25 celdas.

Según Madigan, et al (1998), mediante el método de conteo directo en cámara de Neubauer se debe utilizar
fórmulas que expresen la concentración de células, mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de
levaduras en laboratorio. Esto se observa en los datos hallados en la Tabla 2 donde determinamos la
concentración de células , desviación estándar y coeficiente de variación en las 25 celdas, del mismo modo
en la Tabla 3 determinamos lo mismo para 5 celdas al azar , de este modo pudimos determinar la diferencia
de levaduras en el laboratorio.

Según Rodríguez et al, 2005), los métodos para estimar el número de microorganismos medirán la cantidad
de células. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar
organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden
utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar
las células individuales. Según lo expuesto por el autor en nuestra práctica hicimos conteo de levadura de
Saccharomycescerevisaepor mililitro, para la determinación de su biomasa utilizando el método directo por
recuento en el microscopio.

Según Arnaiz, et al (2000),los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se
basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de enumeración celular, son método de
observación, basados en propiedades físicas o en la actividad biológica. Mientras que los métodos
indirectos estiman algún componente celular o alguna actividad metabólicaespecífica, estos no requieren de
examen visual de los organismos ni su incubación.

Según Silva, et al (2004), los métodos de recuento de células determinan directamente las células vivas y
muertas presentes en una muestra esto puede lograse utilizando una cámaraespecial para recuentos como
lade Petroff-Hauser, la Cámara de Neubauer, Siendo estos los más conocidos puesto existen otros tipos de
métodos decuantificación como los son el UFC, membrana de filtración, Epifluorescenciadirecta, Coulters,
Técnica del número más probable (NMP). Es así que en la práctica se desarrolló la medición de la biomasa
microbiana de la levadura Saccharomycescerevisae por conteo directo en cámara Neubauer tomando una
muestra en dilución de 10 L a la 10-1 por lo que los resultados arrojados en la Tabla 2 de las 25 celdas nos
arrojaron una concentración de células de 1.5 x 106 células/mL , es decir que la dilución indica que la
muestra original (la muestra madre) cumplió con los aspectos necesarios para un buen conteo de biomasa;
en la Tabla 3 vemos que los resultados arrojados en concentración de células es de 1.75 x 106células /mL,
tanto en los resultados de la concentración de 25 celdas y las de las 5 celdas al azar vemos que los valores
se asemejan por lo que no hay mucho margen de error así no debemos olvidar que la técnica de conteo no
permiten distinguir las células vivas de la muertas, por lo que no será útil en un recuento de poblaciones con
altas o bajas concentraciones de microorganismos, pero en nuestro caso nuestro margen de conteo de
células las que se pueden ver en la Tabla 1 no es ni alta ni baja concentración.

SegúnUnam (1986),en la técnica de conteo de células hay que tener en cuenta que en esta técnica uno de
los factores que afecta la observación de las células de levadura es la correcta dilución de la muestra
empleada se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente69 células la muestra se
encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de 20 células, la muestra se encuentra muy
diluida. En nuestro práctica la muestra nos arrojaron valores de un total de células por las 25 celdas de 150,
por lo que podemos que probablemente se encuentra muy diluida ya que es mayor delas 69 células dichas
pro el autor.


Según Valencia (20019, la desviación estándar es el promedio con respecto de la media aritmética, dice
cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del promedio en una distribución. El coeficiente de
variación indica un método de comparación de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades
diferentes. Es así que en la tabla la desviación estándar de las 25 celdas nos da 2.9580 y en la Tabla 3 para
5 celdas al azar nos da un valor de 2.236 en ambos casos su desviación están próximos porque tenemos en
ambos una desviación pequeña indicando que los datos están agrupados cerca de la media. Al igual vemos
que le coeficiente de variación de las 25 celdas es 0.493 y de las 5 celdas es 0.447 por lo que sus valores
son próximos además de las 5 celdas es una parte de la representación de la muestra general de las 25
celdas por lo que la muestra obtenida es una muestra homogénea y representativa.

V. CONCLUSIONES

Se logró determinar la concentración de células de la levadura Sacharomycescerevisae en las 25 celdas la
que nos dio 1.5 x 106 células /mL y en las 5 celdas al azar nos dio un valor de 1.75 x 106 células / mL por lo
que nos damos cuenta que la muestra de 5 celdas al azar es una muestra representativa de la general.se
pudo determinar las células por mililitro gracias a la cámara Neubauer.

Se pudo determinar el promedio de levaduras (Saccharomycescerevisiae) contadas en las 25 celdas, por el
método de conteo directo, usando la cámara de Neubauer, que es un método eficaz para el conteo de
dichas levaduras.

Se comparó estadísticamente los valores de la concentración de la levadura en las 25 celdas y las de las 5
celdas al azar, del mismo modo se compararon su desviación estándar y coeficiente de variación dando
valores en las de 25 celdas de desviación de 2.958 y coeficiente de variación de 0.493 y en el caso de 5
celdas desviación de 2.236 y coeficiente de variación de 0.447. Por lo que la muestra de las 5 al azar es
representativa.

VI. RECOMENDACIONES

Se recomienda calibrar bien el microscopio, con la finalidad de poder observar de manera más clara las
levaduras, de esta forma facilitaremos el conteo de las células.
Se debe agitar la dilución a emplear (10-1), de manera homogénea para que esta se encuentra
debidamente preparada y ser llevada adecuadamente a la lámina portaobjetos.
Verificar que mediante el uso de la jeringa se pueda hacer un correcto llenado de la muestra en la
cámara de Neubauer.
Miraren el microscopio y contabilizar bien la células, las cuales no se tomarán las células que estén la
parte derecha del cuadro ni las de la parte inferior del mismo cuadro, ya que ellas formaran parte del
siguiente cuadro.
Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios
errores.

VII. BIBLIOGRAFÍA

AQUIAHUATI M. (2004), Manual de Prácticas: Laboratorio de Microbiología Celular, Universidad Autónoma
Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnología, 1era Edición, Pág. 63-68.

ARNÁIZ,C., ISAC,L. LEBRATO, J. (2000).Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Sevilla-
España.


MADIGAN M. et al (1998). Brock Biología de los microorganismos Octava Edición, Prentice Hall, España, P.
155 – 156.

RODRÍGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNÁNDEZ, F. GARCÍA, J. (2005). Bacteriología General: Principios y
prácticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica.

SILVA, C., GARCÍA, J. (2004). Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. Editorial
MAD, S.L. Sevilla.

UNAM, (1986); “Biología Celular”, Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias,
Universidad autóctona de México. Pág. 20 – 28.

VALENCIA, H. (2001). Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Universidad Nacional de Colombia.
2001.

ANEXOS

Las ventajas de este tipo de recuentos de Conteo, son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la
rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos
presentes.
Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es tedioso y
no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de bacterias.
No se usa en hifas o mohos.

Figura 2. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular de 10X.

Figura 3. Orientación que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando lacámara de Neubauer


Figura 4. Orientación para el conteo de microorganismos usando lacámara de Neubauer.

Figura 5. Cuadrículas de la cámara Neubauer


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