3. In the context of obesity, failure of adipose tissue
expandability and function cause leakage of fatty acids
and ectopic accumulation in peripheral metabolically
relevant organs including the hypothalamus resulting in
cellular toxicity and body metabolic complications, a
process called lipotoxicity.
INTRODUCTION
4.
5. Obesity is the result of an interplay between genetic and
environmental factors. Polymorphisms in various genes
controlling appetite and metabolism predispose to
obesity under certain dietary conditions.
6. Gene product locus
leptin deficiency. 7q31.3 the signaling that triggers feelings of satiety does
not occur, leading to the excessive hunger and
weight gain.
leptin receptor
deficiency
1p31
proopiomelanocortin
deficiency
2p23.3 POMC gene provides instructions for making the
proopiomelanocortin protein. This protein is cut in smaller
pieces called peptides, The α-MSH peptide and another
peptide called beta-melanocyte stimulating hormone (β-
MSH) act in the brain to help maintain the balance
between energy from food taken into the body and
energy spent by the body.
melanocortin-4 receptor
polymorphism (MC4R[9]
18q22
7. It was discovered in 1994 in the mouse.
the human OB gene is located on chromosome 7
leptin acts as a lipostato : when the amount of fat
stored in adipocytes increases , leptin is released into
the bloodstream , which is a signal (negative
feedback ) that informs the hypothalamus that the
body has enough reserves and should inhibit
appetite.
8. Obesity is also a major feature in several syndromes,
such as:
Prader-Willi syndrome caused by the loss of
function of genes in a
particular region of
chromosome 15
Cohen síndrome associated with mutations
present at COH1 within
chromosome 8
9. * The TBK1 gene is located on
the long (q) arm of
chromosome 12 at position
14.1
* Serine/threonine-protein
kinase TBK1 is an enzyme that
in humans is encoded by the
TBK1 gene.
10. TBK1 (TANK-BindingTBK1 (TANK-Binding
Kinase 1)Kinase 1)
Phosphorylates and activates AKT1. Seems to play a role in
energy balance regulation by sustaining a state of chronic, low-
grade inflammation in obesity, wich leads to a negative impact
on insulin sensitivity.
11. AKT-1
RAC-alpha serine/threonine-protein kinase is an enzyme that
in humans is encoded by the AKT1 gene.
This enzyme belongs to the AKT subfamily of serine/threonine
kinases . It is commonly referred to as PKB, or by both names
as "Akt/PKB"
12. AKT-1
AKT1 is one of 3 closely related serine/threonine-protein kinases
(AKT1, AKT2 and AKT3) called the AKT kinase, and which regulate
many processes including metabolism, proliferation, cell survival,
growth and angiogenesis. This is mediated through serine and/or
threonine phosphorylation of a range of downstream substrates.
AKT is responsible of the regulation of glucose uptake by
mediating insulin-induced translocation of the SLC2A4/GLUT4
glucose transporter to the cell surface.
13. IN OBESITY: less AKT AND RI , AKT2 is
an important signaling molecule in
the insulin signaling pathway
( induced glucose transport )
PSD fraction : normal insulin
receptor and partial reduction of
AKT .
SOLUBLE FRACTION : NO CHANGE
OBESITY GENETICS : TBK1
increases negative regulator
of RI . In both fractions , in the
membrane and in the PSD
Soluble fraction of obese no
change with respect to all of
the small fractions .
14. GENERAL OBJETIVE
investigate whether metabolic abnormalities
associated to lipid-induced toxicity during obesity
induce altered targeting of insulin signaling proteins to
LRs in the hypothalamus.
15. MATERIALES Y METODOS
Todos los experimentos se realizaron utilizando ratones de tipo
salvaje y ob /ob, con 6 meses de edad.
Los animales fueron alojados en una habitación con temperatura
12 h luz /12 h oscuridad
Alimentos y disposición de agua ad libitum
PARA? Extraer sus balsas lipídicas hipotalámicas y estudiar las
respuestas en las distintas fracciones, ya sea insoluble, PSD o
soluble, de acuerdo a cierta estimulación simulando lo que ocurre
en la obesidad in vivo.
16. Aislamiento de lipidos.
Se extrajeron lípidos con algunas modificaciones:
Las células se homogeneizaron en tampón de lisis1 mM, proteasa
completa cóctel inhibidor y 0,5% de TritonX-100).
2) ultrasonidos, se centrifugó la muestra y se determino
concentración de proteínas mediante el ensayo de BCA.
3) El sobrenadante (3 mg de proteína en 500 l por muestra) se
incubó durante 30 min a 4 ° C y se llevo a centrifugar durante
20 min a 4 ° C, para separar un triton soluble y el sedimento
insoluble.
4) El sedimento se resuspendió en 0,4 ml de tampón de lisis y se
mezclo con sacarosa 2M (0,8 ml), sobrepuesto con 1 M (1,6 ml)
y 0,2 M (0,8 ml) de sacarosa y se centrifuga.
17. 4) Después de la centrifugación, cinco fracciones de 0,8 ml
se recogieron desde la parte superior a la parte inferior del gradiente.
con 25 mM Tris-HCL, NaCl 150 mM. Para el indicado
experimentos fracciones 2 y 3 (las balsas de lípidos) y las fracciones 4 y 5
(alto
densidad) se agruparon y se sedimentaron juntos. Los sedimentos se
resuspendieron en 100 l de tampón de lisis y se concentraron y
cuantificaron las proteínas mediante BCA.
18. Cultivo celular- neuronal
Neuronas corticales de ratónes fueron cultivadas: se
diseco la corteza, en un medio especial, luego se
estimulo con acido palmítico, palmitoleico y DHA por
12 horas. Buscando ver las respuestas especificas ante
cada estimulo.
Luego de la estimulación de los acidos, se lavó con
fosfato fría solución salina tamponada (PBS) y se
homogeneizaron Con tampón de lisis balsa como se
describo.
19. línea celular
mHypoA CLU472 línea de células del hipotálamo
La línea celular se cultivó en medio de crecimiento (1x DMEM con
10% fetal de suero bovino (FBS), 25 mM de glucosa y 1% de
penicilina / estreptomicina)
se mantuvo a 37 ° C con 5% de CO2. Las células se dividieron
usando tripsinización a 37 ° C durante 1-5 min, seguido de lavado /
resuspensión en crecimiento medio. Estimulación de ácidos grasos
se hizo en tróficamente privadomedio usando ácido palmítico (60
mM en etanol), ácido palmitoleico 60 M), ácido
docosahexaenoico, DHA (60 mM en DMSO), o DMSO/ 12 h o 24 h
Hubo una Estimulación de ácidos grasos usando ácido palmítico
(60 mM en etanol), ácido palmitoleico (60 mM), ácido
docosahexaenoico, Después de la estimulación, se lavaron las
células con fosfato salino (PBS) y se homogeneizaron con tampón .
20. Como tal, estas líneas celulares permiten a los ensayos
precisos en-vitro para uso en el descubrimiento,
desarrollo y validación de nuevas terapias dirigidas a las
enfermedades y trastornos del sistema nervioso central,
incluyendo la obesidad, estrés y trastornos metabólicos,
entre otros.
21. Aislamiento dominios
insolubles y solubles
Las células se homogeneizaron en tampón de lisis
balsa
Después de la homogeneización por ultrasonidos , la
muestra se centrifugó. El sobrenadante se incubó
se centrifugó para separar un extracto de Tritón-
soluble y el sedimento insoluble.
22. MTT
Es un ensayo colorimétrico para la evaluación de la viabilidad
celular. NAD (P) H enzimas oxidorreductasa celular dependiente
pueden, en condiciones definidas, reflejar el número de células
viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el
colorante de tetrazolio MTT 3- (4,5- di metil tiazol -2-il) -2,5-di fenil
bromuro de tetrazolio a su insoluble formazán , que tiene un color
púrpura.
23. ATP
Es un ensayo de viabilidad
celular a determinar el número
de células en cultivo viable
basándose en la cantidad de
ATP.
Se utilizó el CellTiter - Glo
luminiscentes : un indicador de
las células metabólicamente
activas
"añadir-Mix-medir" genera una
lisis celular y
consecuentemente una señal
luminiscente, proporcional a
la cantidad de ATP presente.
La cantidad de ATP es
directamente proporcional al
número de células presente
en la cultura. El ensayo Slo-Glo
celltiter genera un "de tipo
Glow" luminiscentes señal,
producido por la reacción
luciferase, que tiene una vida
media en general más de
cinco horas
24. inmunoprecipitacion
Es la técnica mediante la cual un antígeno proteico es precipitado
de una solución usando un anticuerpo que se une específicamente
a esa proteína. Este proceso puede ser usado para aislar y
concentrar un proteína particular de una muestra que contiene
muchos miles de proteínas distintas.
* mHypoA CLU472 línea de células del hipotálamo se estimuló con
palmítico (250 mM) o palmitoleico (250 mM), durante 24 h y
después
Se añadieron 100 nmol de insulina. Las células se lavaron una vez
en PBS,se sonificaron y luego se centrifugaron; se recogieron los
sobrenadantes, y se determinaron las concentraciones de proteína
. Luego, 500 g proteínas celulares se incubaron con 3 l de anti-IR o
antipTyr anticuerpo/ 2 h con 6 l de proteína A / G-agarosa. Los
complejos inmunes se aislaron por centrifugación.
25. WESTERN BLOT
Las muestras se mezclaron con tampón de Laemmli y después se
calentó
se sometieron a SDS-PAGE. Las Proteínas se transfirieron
electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa.
Los membranas se bloquearon durante 2 h a TA en tampón TBS-T (10
mM Tris, 0,9% NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 7,5)
se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 ° C:
anticuerpo anti-Irbeta, anti- TBK1, anti-pSer473, anti-pThre309, anti-acti
y anti-flotillin, anti-postsináptica densidad 95, anti-AKt.
Las membranas se lavaron (4 veces / 5 min) en TBS-T, se incubaron/ 1h
el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Se detectaron proteína
expuestos a hyperfilms de rayos X, que se han escanedo y cuantificad
densitométricamente con el software ImageJ 1.31V
26. WESTERN BLOT
Determina proteínas específicas en una
muestra.
Electroforesis de la muestra con proteínas.
Transferir a membrana.
Coloración.
Incubación con anticuerpo.
Detección del anticuerpo.
Revelado.
30. IR SE CONCENTRA EN LAS BALSAS LIPÍDICAS EN EL
HIPOTÁLAMO
La mayor parte de las proteínas
citoesqueleticas, permanecen
en el extracto insoluble.
GM1, esfingolipidos, flotilin 1
tienen una fracción enriquecida
en la fracción de las balsas.
mientras que se detectaron
niveles bajos en el
Fracción PSD y el extracto
soluble.
31. LA OBESIDAD DISMINUYE LOS NIVELES DE AKT Y PROTEÍNAS
DEL IR EN FRACCIONES LRS DEL HIPOCAMPO.
IR disminuyó en ≈35%) en
Fracción LRS de hipocampo de
los ratones ob / ob (Fig. 2A)
También que AKT, se redujo en
≈70% 30%.
en LR y fracciones PSD,
respectivamente
33. ANÁLISIS DE LA VIABILIDAD CELULAR EVALUADA
POR MTT Y ENSAYOS DE ATP.
Para determinar las dosis del
ácido palmítico saturado o ácido
palmitoleico monoinsaturadas
Se determino la respuesta de
la dosis curva sobre la toxicidad
neuronal utilizando MTT y el
ensayo de ATP.
34. ACUMULACION DE TBK1 CUANDO SE UTILIZA UN
ACIDO SATURADO COMO EL ACIDO PALMITICO
EN LAS FRACCIONES INSOLUBLES.
El ácido palmítico promueve la
contratación TBK1 en la
membrana dominios insolubles
(A, B) o cultivos neuronales
corticales.
35. EFECTOS DEL ACIDO PALMITICO Y PALMITOLEICO
SOBRE LA TIROSINFOSFORILACION DEL RECEPTOR
DE INSULINA
TBK1 en microdominios de plasma
insoluble: fosforilación de la tirosina
ineficiente.
36. LOS ÁCIDOS GRASOS SATURADOS REGULAN A LA BAJA
LAS PROTEÍNAS DEL IR Y AKT EN DOMINIOS
INSOLUBLES.
A) En contraste con el ácido palmítico, DHA no promueve la
resistencia a la insulina, se evidencia por la activación de
Ser473 AKT fosforilación durante la estimulación de la
insulina. Al ser el DHA un acido graso insaturado.
B.C) Además, la estimulación DHA no altera los niveles de
proteína de TBK1, AKT, o IR en los dominios insolubles
37.
38. • Using a balanced diet prevents neurological damage such as brain
damage insulin receptor level.
• genetic is implicated in obesity, for example in the genetic obesity,
TBK1, negative regulator of the insulin receptor is increased, which
implies low insulin response despite being produced enough insulin.
• Being obese is not just about aesthetics, it is also a disease that
involves many factors that affect health, reducing the quality of life of
many people.
• Everything in excess is bad, but stop eating fatty acids neither is
correct, its lack is associated with coronary heart disease and high
cholesterol.
• The nature of fatty acids we consume is relevant; when choosing the
consumption of these, we must choose unsaturated fatty acids, these
are essential for the proper functioning of the body, besides not
promote insulin resistance
